linnaeus · Datasets at Hugging Face

id stringlengths 1 5	tokens sequence	ner_tags sequence
0	[ "Scp160p", ",", "a", "multiple", "KH", "-", "domain", "protein", ",", "is", "a", "component", "of", "mRNP", "complexes", "in", "yeast" ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1 ]
1	[ "Abstract" ]	[ 0 ]
2	[ "Scp160p", "is", "a", "160", "kDa", "protein", "in", "the", "yeast", "Saccharomyces", "cerevisiae", "that", "contains", "14", "repeats", "of", "the", "hnRNP", "K", "-", "homology", "(", "KH", ")", "domain", ",", "and", "demonstrates", "significant", "sequence", "homology", "to", "a", "family", "of", "proteins", "collectively", "known", "as", "vigilins", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1, 1, 2, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
3	[ "As", "a", "first", "step", "towards", "defining", "the", "function", "of", "Scp160p", ",", "we", "have", "characterized", "the", "subcellular", "distribution", "and", "in", "vivo", "interactions", "of", "this", "protein", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
4	[ "Using", "sucrose", "gradient", "fractionation", "studies", "we", "have", "demonstrated", "that", "Scp160p", "in", "cytoplasmic", "lysates", "is", "predominantly", "associated", "with", "polyribosomes", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
5	[ "Furthermore", ",", "we", "have", "found", "that", "Scp160p", "is", "released", "from", "polyribosomes", "by", "EDTA", "in", "the", "form", "of", "a", "large", "complex", "of", ">=", "1300", "kDa", "that", "is", "sensitive", "both", "to", "RNase", "and", "NaCl", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
6	[ "Using", "affinity", "-", "chromatography", "to", "isolate", "these", "complexes", ",", "we", "have", "identified", "two", "protein", "components", "other", "than", "Scp160p", ":", "poly", "(", "A", ")", "binding", "protein", ",", "Pab1p", ",", "and", "Bfr1p", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
7	[ "The", "presence", "of", "Pab1p", "confirms", "these", "complexes", "to", "be", "mRNPs", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
8	[ "The", "presence", "of", "Bfr1p", "is", "intriguing", "because", "the", "null", "phenotype", "for", "this", "gene", "is", "essentially", "the", "same", "as", "that", "reported", "for", "scp160", "-", "null", "cells", ":", "increased", "cell", "size", "and", "aberrant", "DNA", "content", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
9	[ "These", "results", "demonstrate", "that", "Scp160p", "associates", "with", "polyribosome", "-", "bound", "mRNP", "complexes", "in", "vivo", ",", "implicating", "a", "role", "for", "this", "protein", "in", "one", "or", "more", "levels", "of", "mRNA", "metabolism", "in", "yeast", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1, 0 ]
10	[ "INTRODUCTION" ]	[ 0 ]
11	[ "Scp160p", "is", "a", "1222", "amino", "acid", "Saccharomyces", "cerevisiae", "protein", "that", "contains", "14", "copies", "of", "the", "hnRNP", "K", "homology", "(", "KH", ")", "domain", ",", "a", "highly", "conserved", "motif", "found", "in", "many", "proteins", "involved", "in", "RNA", "metabolism", "(", "1", ")", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1, 2, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
12	[ "KH", "domain", "-", "containing", "proteins", "appear", "to", "have", "diverse", "functions", "and", "have", "been", "identified", "in", "all", "kingdoms", "of", "life", ",", "including", "the", "ribosomal", "protein", "S3", "from", "Escherichia", "coli", "(", "1", ")", ",", "Mer1p", "from", "S", ".", "cerevisiae", ",", "a", "meiosis", "-", "specific", "splicing", "factor", "(", "1", ")", ",", "MEX", "-", "3", "from", "Caenorhabditis", "elegans", ",", "presumably", "involved", "in", "mRNA", "localization", "during", "development", "(", "2", ")", ",", "and", "FMRP", ",", "the", "fragile", "-", "X", "mental", "retardation", "protein", "in", "humans", "(", "3", ")", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1, 2, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1, 2, 2, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1, 2, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1, 0, 0, 0, 0 ]
13	[ "A", "partial", "clone", "of", "Scp160p", ",", "known", "as", "HX", ",", "was", "one", "of", "the", "first", "multiple", "-", "KH", "proteins", "identified", "(", "1", ")", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
14	[ "Whole", "cell", "immunofluorescence", "studies", "have", "demonstrated", "that", "Scp160p", "localizes", "to", "the", "cytoplasm", ",", "with", "enrichment", "around", "the", "nuclear", "envelope", ",", "and", "what", "appears", "to", "be", "the", "endoplasmic", "reticulum", "(", "3", ")", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
15	[ "Deletion", "of", "the", "SCP160", "locus", "in", "yeast", "is", "not", "lethal", ",", "but", "results", "in", "a", "complex", "phenotype", ",", "including", "increased", "DNA", "content", "per", "cell", ",", "missegregation", "of", "genetic", "markers", "during", "sporulation", ",", "and", "abnormal", "cell", "morphology", ",", "including", "increased", "size", "and", "irregular", "shape", "(", "4", ")", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
16	[ "Observation", "of", "this", "phenotype", "led", "to", "the", "hypothesis", "that", "Scp160p", "may", "function", "in", "regulating", "ploidy", "during", "cell", "division", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
17	[ "More", "recently", ",", "Weber", "and", "colleagues", "demonstrated", "in", "vitro", "RNA", "binding", "activity", "of", "Scp160p", "using", "northwestern", "blot", "analyses", ";", "the", "protein", "was", "found", "to", "bind", "efficiently", "to", "ribohomopolymers", "and", "rRNA", ",", "but", "not", "to", "tRNA", "(", "5", ")", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
18	[ "Cell", "fractionation", "studies", "revealed", "that", "a", "large", "percentage", "of", "Scp160p", "associates", "with", "membrane", "-", "pellets", ",", "and", "is", "released", "by", "treatment", "with", "either", "10", "mM", "EDTA", "or", "500", "mM", "NaCl", "(", "5", ")", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
19	[ "While", "these", "authors", "interpreted", "these", "results", "to", "suggest", "that", "the", "nuclear", "envelope", "/", "ER", "localization", "of", "Scp160p", "was", "due", "primarily", "to", "interactions", "of", "the", "protein", "with", "membrane", "-", "bound", "polyribosomes", ",", "clear", "evidence", "of", "this", "association", "has", "not", "been", "reported", "(", "5", ")", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
20	[ "Currently", ",", "the", "relationship", "between", "the", "phenotype", "of", "scp160", "null", "mutants", "and", "the", "RNA", "-", "binding", "activity", "of", "Scp160p", "remains", "unclear", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
21	[ "Scp160p", "demonstrates", "significant", "sequence", "homology", "(", "~", "23", "%", "identity", "and", "~", "40", "%", "similarity", "at", "the", "amino", "acid", "level", ")", "to", "a", "class", "of", "vertebrate", "KH", "-", "domain", "proteins", "collectively", "known", "as", "vigilins", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
22	[ "First", "identified", "in", "chicken", ",", "vigilin", "homologues", "have", "now", "been", "found", "in", "human", "(", "6", ")", ",", "Xenopus", "laevis", "(", "7", ")", ",", "Drosophila", "melanogaster", "(", "8", ")", ",", "C", ".", "elegans", "(", "5", ")", "and", "Schizosaccharomyces", "pombe", "." ]	[ 0, 0, 0, 1, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1, 0, 0, 0, 0, 1, 2, 0, 0, 0, 0, 1, 2, 0, 0, 0, 0, 1, 2, 2, 0, 0, 0, 0, 1, 2, 0 ]
23	[ "While", "all", "of", "the", "vigilin", "proteins", "studied", "to", "date", "are", "reported", "to", "bind", "nucleic", "acid", ",", "both", "the", "type", "of", "nucleic", "acid", "bound", "and", "the", "functional", "significance", "of", "these", "interactions", "remain", "unclear", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
24	[ "For", "example", ",", "Kruse", "and", "colleagues", "reported", "from", "their", "work", "with", "human", "cells", "in", "culture", "that", "vigilin", "may", "be", "involved", "in", "the", "binding", "and", "transport", "of", "tRNA", "(", "9", "-", "11", ")", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
25	[ "In", "contrast", ",", "Dodson", "and", "Shapiro", "concluded", "from", "their", "work", "with", "Xenopus", "vigilin", "that", ",", "in", "response", "to", "estrogen", ",", "the", "protein", "bound", "specifically", "to", "the", "3", "'", "UTR", "of", "vitellogenin", "mRNA", "(", "7", ",", "12", ")", ",", "potentially", "stabilizing", "the", "message", "(", "13", ")", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
26	[ "Lastly", ",", "DDP1", ",", "the", "Drosophila", "homolog", "of", "vigilin", ",", "was", "reported", "recently", "to", "interact", "with", "the", "dodeca", "-", "satellite", "repeat", "regions", "of", "centromeric", "heterochromatin", "in", "embryonic", "and", "larval", "cell", "nuclei", ",", "suggesting", "a", "possible", "role", "for", "this", "protein", "in", "heterochromatin", "structure", "(", "8", ")", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
27	[ "The", "goal", "of", "the", "present", "study", "was", "to", "begin", "elucidating", "the", "function", "of", "Scp160p", "in", "yeast", "by", "characterizing", "the", "subcellular", "distribution", "and", "macromolecular", "interactions", "of", "this", "protein", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
28	[ "We", "have", "demonstrated", "that", "Scp160p", "in", "cytoplasmic", "lysates", "is", "associated", "predominantly", "with", "polyribosomes", ",", "and", "that", "following", "treatment", "with", "EDTA", ",", "Scp160p", "remains", "in", "an", "RNase", "/", "NaCl", "-", "sensitive", "complex", "of", "apparent", "molecular", "weight", "approximately", ">=", "1300", "kDa", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
29	[ "Affinity", "purification", "of", "this", "complex", "revealed", "the", "presence", "of", "poly", "(", "A", ")", "-", "binding", "protein", "(", "Pab1p", ")", ",", "a", "well", "-", "characterized", "component", "of", "eukaryotic", "mRNPs", "(", "14", ",", "15", ")", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
30	[ "Finally", ",", "a", "third", "abundant", "protein", "component", "of", "this", "complex", "was", "identified", "as", "Bfr1p", ",", "a", "protein", "not", "previously", "reported", "to", "associate", "with", "mRNPs", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
31	[ "While", "the", "function", "of", "Bfr1p", "remains", "unknown", ",", "gene", "deletion", "reportedly", "leads", "to", "a", "phenotype", "remarkably", "similar", "to", "that", "of", "scp160", "deletion", "(", "16", ")", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
32	[ "These", "results", "indicate", "a", "role", "for", "Scp160p", "in", "mRNA", "metabolism", "in", "yeast", ",", "and", "by", "extension", ",", "support", "results", "seen", "with", "Xenopus", "vigilin", "in", "its", "interactions", "with", "mRNA", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
33	[ "To", "our", "knowledge", ",", "the", "data", "reported", "here", "demonstrate", "Scp160p", "to", "be", "the", "first", "example", "of", "a", "KH", "-", "domain", "protein", "that", "functions", "as", "a", "component", "of", "polyribosome", "-", "associated", "mRNP", "complexes", "in", "the", "yeast", ",", "S", ".", "cerevisiae", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1, 0, 1, 2, 2, 0 ]
34	[ "MATERIALS", "AND", "METHODS" ]	[ 0, 0, 0 ]
35	[ "Plasmids", ",", "yeast", "strains", "and", "culture", "conditions" ]	[ 0, 0, 1, 0, 0, 0, 0 ]
36	[ "All", "recombinant", "DNA", "manipulations", "were", "performed", "according", "to", "standard", "techniques", "and", "utilized", "E", ".", "coli", "strain", "XL1", "-", "Blue", "(", "Stratagene", ")", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1, 2, 2, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
37	[ "The", "yeast", "strain", "JFy1511", ",", "expressing", "FLAG", "-", "Scp160p", ",", "was", "derived", "by", "two", "-", "step", "gene", "replacement", "from", "strain", "yJJ52", "(", "MAT", "alpha", "gal7", "Delta", "102", "ura3", "-", "52", "trp1", "-", "289", "ade1", "lys1", "leu2", "-", "3", ",", "112", ";", "generously", "donated", "by", "Drs", "Mark", "Parthun", "and", "Judith", "Jaehning", ",", "University", "of", "Colorado", "Health", "Sciences", "Center", ")", ",", "and", "confirmed", "by", "PCR", "." ]	[ 0, 1, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
38	[ "The", "wild", "-", "type", "SCP160", "coding", "sequence", "was", "obtained", "by", "PCR", "amplification", "from", "a", "genomic", "DNA", "preparation", "from", "yJFK1", "(", "MAT", "alpha", "gal7", "Delta", "102", "ura3", "-", "52", "trp1", "-", "289", "ade1", "lys1", "leu2", "-", "3", ",", "112", "Delta", "GAL80", ":", ":", "URA3", ")", ",", "using", "a", "16", ":", "1", "mixture", "of", "Taq", "(", "Fisher", "Biotech", ")", "and", "Pfu", "(", "Stratagene", ")", "DNA", "polymerases", "and", "the", "following", "primers", ":", "Scp160F1", "(", "5", "'", "-", "GCCGGTCGA", "-", "CTAACTGCAATGTCTGAAGAACAAACCGCTATTG", "-", "3", "'", ")", "and", "Scp160R1", "(", "5", "'", "-", "GCGCGTCGACGAGCTTGTCTATCTT", "-", "CTTAAGG", "-", "3", "'", ")", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
39	[ "A", "wild", "-", "type", "SCP160", "genomic", "clone", ",", "containing", "1", "kb", "upstream", "and", "300", "bp", "downstream", "sequence", "was", "PCR", "amplified", "from", "yJFK1", "genomic", "DNA", "using", "the", "primers", "Scp160F0", "(", "5", "'", "-", "GCCGAGCTCACACCAGCTTTGTCCTGG", "-", "3", "'", ")", "and", "Scp160R2", "(", "5", "'", "-", "GCGCAAGCTTGTGCGGTA", "-", "TCCCAGTCTATG", "-", "3", "'", ")", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
40	[ "The", "resultant", "clone", "was", "confirmed", "by", "dideoxy", "sequencing", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
41	[ "The", "N", "-", "terminal", "FLAG", "and", "HA", "tags", "were", "added", "using", "PCR", "with", "the", "primers", "ScpFLAGF1", "(", "5", "'", "-", "CCAT", "-", "TATAACTGCAATGGACTACAAGGACGACGACGACGAC", "-", "AAGATGTCTGAAGAACAAACCGCTATTG", "-", "3", "'", ")", "and", "ScpHAF1", "(", "5", "'", "-", "CCCCCTCCTGTCGACATTATAACTGCAATGCACCA", "-", "TCACCATCACCATTCTGAAGAACAAACCGCTATTG", "-", "3", "'", ")", "respectively", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
42	[ "For", "integration", ",", "constructs", "containing", "the", "1", "kb", "upstream", "and", "300", "bp", "downstream", "sequence", "were", "subcloned", "into", "the", "plasmid", "YIplac211", "(", "17", ")", "using", "SacI", "and", "HindIII", "restriction", "sites", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
43	[ "The", "HA", "-", "tagged", "construct", "was", "subcloned", "into", "the", "low", "copy", "number", "plasmid", ",", "YCplac22", "using", "SacI", "and", "HindIII", "restriction", "sites", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
44	[ "The", "SCP160", "deletion", "construct", "was", "made", "by", "removal", "of", "a", "3", ".", "4", "kb", "ApaI", "-", "KpnI", "fragment", "from", "the", "coding", "region", "of", "this", "construct", ",", "followed", "by", "treatment", "with", "Klenow", "fragment", "and", "re", "-", "ligation", "following", "attachment", "of", "BamHI", "linker", "oligonucleotides", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
45	[ "Genomic", "integration", "of", "the", "plasmid", "sequences", "and", "subsequent", "removal", "of", "the", "endogenous", "SCP160", "allele", "were", "achieved", "by", "standard", "two", "-", "step", "gene", "replacement", "techniques", "(", "18", ")", "and", "confirmed", "by", "PCR", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
46	[ "The", "N", "-", "terminally", "HA", "-", "tagged", "allele", "of", "BFR1", "was", "generated", "by", "PCR", "-", "amplifiction", "of", "the", "BFR1", "locus", "from", "wild", "-", "type", "(", "W303", ")", "yeast", "genomic", "DNA", "using", "the", "primers", "BFR1HAF1", "(", "5", "'", "-", "CCGCGGATCCATGTACC", "-", "CATACGACGTCCCAGACTACGCTATGTCCTCCCAAC", "-", "AACACAA", "-", "3", "'", ")", "and", "BFR1HINDR1", "(", "5", "'", "-", "CCGCAAGCTTGTCG", "-", "ACTATTTCATATGCCACAGGAAACAG", "-", "3", "'", ")", ",", "and", "subcloned", "into", "YIPlac211", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
47	[ "The", "BFR1", "promoter", "region", "was", "PCR", "-", "amplified", "in", "a", "similar", "manner", "using", "the", "primers", "BFR1SACF1", "(", "5", "'", "-", "CCGCGAG", "-", "CTCAGCATTAAGCATTCACGAGC", "-", "3", "'", ")", "and", "BFR1BAMR1", "(", "5", "'", "-", "CCGCGGATCCGGCAATGGCTGTGTTGTTAGA", "-", "3", "'", ")", "and", "subcloned", "into", "the", "appropriate", "position", "upstream", "of", "the", "HA", "-", "Bfr1p", "open", "reading", "frame", "in", "the", "plasmid", "backbone", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
48	[ "The", "entire", "open", "reading", "frame", "was", "confirmed", "by", "dideoxy", "sequencing", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
49	[ "Finally", ",", "the", "HA", "-", "BFR1", "allele", "was", "substituted", "into", "the", "yeast", "genome", "in", "place", "of", "the", "native", "allele", "using", "linearization", "with", "SphI", "and", "standard", "two", "-", "step", "gene", "replacement", "techniques", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
50	[ "All", "yeast", "transformations", "and", "culture", "manipulations", "were", "performed", "according", "to", "standard", "protocols", "as", "described", "elsewhere", "(", "19", ")", "." ]	[ 0, 1, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
51	[ "Confirmation", "of", "genomic", "integrations" ]	[ 0, 0, 0, 0 ]
52	[ "All", "genomic", "integrations", "were", "confirmed", "by", "PCR", "amplifications", "from", "purified", "yeast", "genomic", "DNA", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1, 0, 0, 0 ]
53	[ "For", "scp160", "deletion", "mutants", ",", "the", "primers", "Scp160PF", "(", "5", "'", "-", "GATTTCCTAACTTTCC", "-", "GTCTA", "-", "3", "'", ")", "and", "Scp160R5", "(", "5", "'", "-", "GCGCAAGCTTCACCGCCTTATAACGAAGAC", "-", "3", "'", ")", "that", "flanked", "the", "deleted", "region", "were", "used", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
54	[ "Similarly", ",", "epitope", "tags", "on", "Scp160p", "were", "confirmed", "by", "PCR", "using", "primers", "that", "flanked", "the", "tag", "sequence", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
55	[ "Positive", "clones", "were", "further", "confirmed", "by", "western", "blot", "analysis", "of", "crude", "cell", "lysates", "using", "the", "appropriate", "anti", "-", "tag", "antibodies", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
56	[ "The", "presence", "of", "HA", "-", "Bfr1p", "in", "cells", "was", "confirmed", "by", "western", "blot", "analysis", "of", "soluble", "cell", "lysates", "using", "12CA5", "mAb", "(", "Boehringer", "Mannheim", ")", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
57	[ "Polyribosome", "isolation" ]	[ 0, 0 ]
58	[ "Polyribosomes", "were", "isolated", "using", "a", "combination", "of", "protocols", "described", "by", "Stansfield", "and", "colleagues", "(", "20", ")", "and", "by", "Dr", "Maurice", "Swanson", "(", "personal", "communication", ")", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
59	[ "In", "brief", ",", "a", "100", "ml", "culture", "of", "yeast", "was", "grown", "in", "either", "YEPD", "or", "Hartwell", "synthetic", "medium", ",", "to", "early", "-", "log", "phase", "(", "OD600", "=", "1", ".", "0", ")", ",", "at", "which", "time", "cyclohexamide", "(", "Sigma", ")", "was", "added", "directly", "to", "the", "culture", "to", "a", "final", "concentration", "of", "100", "micro", "g", "/", "ml", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
60	[ "The", "culture", "was", "incubated", "on", "ice", "for", "15", "min", ",", "and", "cells", "were", "harvested", "by", "centrifugation", "(", "4000", "r", ".", "p", ".", "m", ".", "/", "10", "min", ")", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
61	[ "Following", "two", "washes", "in", "10", "ml", "of", "water", "containing", "100", "micro", "g", "/", "ml", "cyclohexamide", ",", "cells", "were", "lysed", "by", "vortex", "agitation", "with", "an", "equal", "volume", "of", "glass", "beads", "in", "1", "ml", "lysis", "buffer", "(", "25", "mM", "Tris", "pH", "7", ".", "2", ",", "50", "mM", "KCl", ",", "30", "mM", "MgCl2", ",", "5", "mM", "beta", "-", "mercaptoethanol", ",", "200", "micro", "g", "/", "ml", "cyclohexamide", ",", "2", "micro", "g", "/", "ml", "aprotonin", ",", "1", "mM", "PMSF", ",", "0", ".", "5", "micro", "g", "/", "ml", "leupeptin", ",", "2", ".", "9", "micro", "g", "/", "ml", "E64", ",", "1", "micro", "g", "/", "ml", "antipain", ",", "0", ".", "2", "micro", "g", "/", "ml", "chymostatin", ")", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
62	[ "Lysate", "was", "transferred", "to", "a", "clean", "microfuge", "tube", ",", "and", "centrifuged", "10", "min", "at", "3000", "g", "at", "4", "degrees", "C", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
63	[ "The", "supernatant", "was", "again", "transferred", "to", "a", "clean", "microfuge", "tube", "and", "centrifuged", "at", "12", "000", "g", "for", "15", "min", "at", "4", "degrees", "C", ",", "and", "then", "assayed", "for", "absorbance", "at", "260", "nm", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
64	[ "Approximately", "12", "OD260", "units", "were", "loaded", "onto", "a", "11", "ml", "15", "-", "45", "%", "sucrose", "gradient", "made", "in", "10", "mM", "Tris", ",", "pH", "7", ".", "4", ",", "70", "mM", "NH4Cl", ",", "4", "mM", "MgOAc", ",", "using", "a", "Gradient", "Master", "automatic", "system", ",", "and", "the", "gradient", "was", "centrifuged", "in", "a", "SW41ti", "rotor", "(", "Beckman", ")", "at", "39", "000", "r", ".", "p", ".", "m", ".", "for", "2", ".", "5", "h", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
65	[ "0", ".", "5", "ml", "fractions", "were", "collected", "using", "an", "Isco", "gradient", "fractionator", ",", "and", "gradient", "profiles", "were", "determined", "by", "monitoring", "absorbance", "at", "254", "nm", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
66	[ "For", "EDTA", "controls", ",", "lysis", "buffer", "containing", "5", "mM", "MgCl2", "was", "used", ",", "and", "30", "mM", "EDTA", "was", "added", "to", "the", "sample", "before", "loading", "onto", "the", "gradient", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
67	[ "Where", "indicated", ",", "addition", "of", "50", "U", "/", "ml", "of", "RNase", "One", "(", "Promega", ")", "was", "performed", "prior", "to", "loading", "the", "sample", "onto", "the", "gradient", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
68	[ "Gel", "filtration", "chromatography" ]	[ 0, 0, 0 ]
69	[ "Gel", "filtration", "chromatography", "was", "performed", "using", "a", "120", "ml", "Hi", "-", "Prep", "S", "-", "300", "Sephacryl", "column", "(", "Pharmacia", ")", "with", "a", "cut", "-", "off", "of", "1300", "kDa", ",", "attached", "to", "an", "FPLC", "system", "(", "Pharmacia", ")", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
70	[ "The", "column", "had", "been", "calibrated", "previously", "using", "the", "following", "molecular", "weight", "standards", "(", "Sigma", ")", ":", "blue", "dextran", "(", "2000", "kDa", ")", ",", "thyroglobulin", "(", "669", "kDa", ")", ",", "apoferritin", "(", "443", "kDa", ")", ",", "alcohol", "dehydrogenase", "(", "150", "kDa", ")", ",", "and", "bovine", "serum", "albumin", "(", "66", "kDa", ")", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
71	[ "Yeast", "were", "lysed", "as", "described", "for", "polyribosome", "analysis", ",", "with", "an", "additional", "clarification", "by", "passage", "through", "a", "0", ".", "2", "micro", "m", "syringe", "-", "tip", "filter", "(", "Acrodisc", ")", "and", "run", "over", "the", "column", "at", "a", "rate", "of", "0", ".", "5", "ml", "/", "min", "in", "polyribosome", "lysis", "buffer", "following", "treatment", "with", "the", "indicated", "reagents", "." ]	[ 1, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
72	[ "Fractions", "(", "2", ".", "0", "ml", ")", "were", "collected", ",", "from", "which", "12", "micro", "l", "were", "combined", "with", "sample", "buffer", "(", "2", "%", "SDS", ",", "10", "%", "glycerol", ",", "100", "mM", "dithiothreitol", ",", "60", "mM", "Tris", "pH", "6", ".", "8", ",", "0", ".", "001", "%", "bromophenol", "blue", ")", "and", "analyzed", "by", "western", "blot", "using", "the", "indicated", "antibodies", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
73	[ "alpha", "-", "FLAG", "affinity", "chromatography" ]	[ 0, 0, 0, 0, 0 ]
74	[ "For", "most", "experiments", ",", "one", "liter", "yeast", "cultures", "were", "grown", "to", "early", "log", "-", "phase", "and", "harvested", "by", "centrifugation", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
75	[ "Cells", "were", "washed", "twice", "in", "T75", "buffer", "(", "25", "mM", "Tris", "pH", "7", ".", "5", ",", "75", "mM", "NaCl", ")", "and", "then", "were", "lysed", "by", "vortex", "agitation", "with", "an", "equal", "volume", "of", "glass", "beads", "in", "4", "ml", "T75", "buffer", "containing", "30", "mM", "EDTA", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
76	[ "Lysate", "was", "transferred", "to", "a", "clean", "microfuge", "tube", ",", "and", "centrifuged", "for", "10", "min", "at", "3000", "g", "at", "4", "degrees", "C", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
77	[ "The", "supernatant", "was", "again", "transferred", "to", "a", "clean", "microfuge", "tube", "and", "centrifuged", "at", "12", "000", "g", "for", "15", "min", "at", "4", "degrees", "C", ",", "and", "finally", "passed", "through", "a", "0", ".", "2", "micro", "m", "syringe", "filter", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
78	[ "Lysate", "was", "then", "pre", "-", "purified", "by", "running", "over", "the", "S", "-", "300", "gel", "-", "filtration", "column", "in", "T75", "buffer", ",", "with", "pooling", "of", "the", "void", "volume", "fractions", "(", "~", "10", "ml", "total", ")", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
79	[ "For", "several", "experiments", "(", "Fig", ".", "5A", ",", "B", ",", "E", "and", "F", ")", ",", "a", "low", "concentration", "(", "<", "10", "micro", "g", "/", "ml", ")", "of", "FLAG", "peptide", "(", "N", "-", "DYKDDDDK", "-", "C", ")", "was", "added", "to", "this", "sample", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
80	[ "This", "void", "material", "was", "then", "loaded", "onto", "a", "1", "ml", "M2", "alpha", "-", "FLAG", "column", "(", "Sigma", ")", ";", "column", "flow", "-", "through", "was", "passed", "over", "the", "column", "a", "second", "time", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
81	[ "The", "column", "was", "then", "washed", "extensively", "with", "75", "ml", "T75", "buffer", ";", "material", "bound", "to", "the", "column", "was", "eluted", "with", "5", "ml", "T75", "containing", "184", "mg", "/", "ml", "FLAG", "peptide", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
82	[ "The", "peptide", "solution", "was", "allowed", "to", "incubate", "on", "the", "column", "for", "20", "min", "prior", "to", "collection", "of", "the", "first", "1", "ml", "fraction", ";", "subsequent", "fractions", "were", "collected", "every", "10", "min", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
83	[ "Samples", "of", "crude", "material", ",", "S", "-", "300", "void", ",", "alpha", "-", "FLAG", "flow", "-", "through", ",", "first", "and", "last", "wash", ",", "and", "eluate", "fractions", "were", "analyzed", "by", "western", "blot", "using", "the", "indicated", "antibodies", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
84	[ "For", "Figure", "5A", "and", "E", ",", "samples", "of", "first", "and", "last", "wash", "and", "eluate", "fractions", "were", "concentrated", ",", "run", "on", "SDS", "-", "PAGE", "and", "stained", "with", "colloidal", "G250", "Coomassie", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
85	[ "Concentration", "of", "samples" ]	[ 0, 0, 0 ]
86	[ "Where", "indicated", ",", "samples", "were", "concentrated", "using", "the", "method", "of", "Traub", "et", "al", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
87	[ "(", "21", ")", "." ]	[ 0, 0, 0, 0 ]
88	[ "400", "micro", "l", "of", "sample", "were", "transferred", "to", "a", "microfuge", "tube", ",", "and", "combined", "with", "400", "micro", "l", "of", "methanol", ",", "and", "100", "micro", "l", "of", "chloroform", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
89	[ "Samples", "were", "then", "vortexed", "vigorously", ",", "and", "centrifuged", "for", "5", "min", "at", "12", "000", "g", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
90	[ "The", "supernatant", "was", "discarded", ",", "leaving", "the", "interface", "intact", ",", "and", "an", "additional", "400", "micro", "l", "of", "methanol", "was", "added", "to", "each", "tube", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
91	[ "Samples", "were", "then", "inverted", "several", "times", ",", "and", "centrifuged", "again", "for", "5", "min", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
92	[ "The", "supernatant", "was", "discarded", ",", "and", "the", "protein", "pellet", "was", "air", "-", "dried", "and", "resuspended", "in", "1", "x", "sample", "buffer", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
93	[ "Western", "blot", "analysis" ]	[ 0, 0, 0 ]
94	[ "Western", "blot", "analysis", "was", "performed", "essentially", "as", "described", "previously", "(", "19", ")", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
95	[ "Briefly", ",", "samples", "to", "be", "analyzed", "were", "mixed", "with", "sample", "buffer", ",", "boiled", ",", "electrophoresed", "through", "a", "10", "%", "SDS", "-", "polyacrylamide", "gel", ",", "and", "electro", "-", "blotted", "onto", "nitrocellulose", "(", "Bio", "-", "Rad", ")", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
96	[ "FLAG", "-", "Scp160p", "fusion", "protein", "was", "detected", "by", "incubation", "of", "the", "filter", "with", "mouse", "M2", "anti", "-", "FLAG", "monoclonal", "antibody", "(", "10", "micro", "g", "/", "ml", "final", "concentration", ")", ",", "followed", "by", "HRP", "-", "conjugated", "sheep", "anti", "-", "mouse", "secondary", "antibody", "(", "Amersham", ")", ",", "diluted", "1", ":", "5000", "as", "per", "the", "manufacturer", "'", "s", "instructions", ",", "and", "ECL", "reagent", "(", "Amersham", ")", ",", "followed", "by", "exposure", "to", "X", "-", "ray", "film", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1, 0, 0, 1, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
97	[ "HA", "-", "tagged", "Scp160p", "and", "HA", "-", "tagged", "Bfr1p", "were", "detected", "using", "the", "12CA5", "mAb", "(", "Boehringer", "Mannheim", ")", "at", "a", "final", "concentration", "of", "0", ".", "8", "micro", "g", "/", "ml", ";", "Pab1p", "and", "Pub1p", "were", "detected", "using", "1G1", "mAb", "at", "1", ":", "5000", ",", "and", "4C3", "mAb", "at", "1", ":", "1000", ",", "respectively", ",", "both", "generous", "gifts", "from", "Dr", "Maurice", "Swanson", "(", "22", ",", "23", ")", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
98	[ "Where", "appropriate", ",", "films", "were", "analyzed", "by", "scanning", "densitometry", "(", "Molecular", "Dynamics", ")", ",", "and", "quantitated", "using", "ImageQuant", "software", "(", "Molecular", "Dynamics", ")", "." ]	[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]
99	[ "Colloidal", "G250", "coomassie", "staining" ]	[ 0, 0, 0, 0 ]

0

[ "Scp160p", ",", "a", "multiple", "KH", "-", "domain", "protein", ",", "is", "a", "component", "of", "mRNP", "complexes", "in", "yeast" ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1 ]

1

[ "Abstract" ]

[ 0 ]

2

[ "Scp160p", "is", "a", "160", "kDa", "protein", "in", "the", "yeast", "Saccharomyces", "cerevisiae", "that", "contains", "14", "repeats", "of", "the", "hnRNP", "K", "-", "homology", "(", "KH", ")", "domain", ",", "and", "demonstrates", "significant", "sequence", "homology", "to", "a", "family", "of", "proteins", "collectively", "known", "as", "vigilins", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1, 1, 2, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

3

[ "As", "a", "first", "step", "towards", "defining", "the", "function", "of", "Scp160p", ",", "we", "have", "characterized", "the", "subcellular", "distribution", "and", "in", "vivo", "interactions", "of", "this", "protein", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

4

[ "Using", "sucrose", "gradient", "fractionation", "studies", "we", "have", "demonstrated", "that", "Scp160p", "in", "cytoplasmic", "lysates", "is", "predominantly", "associated", "with", "polyribosomes", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

5

[ "Furthermore", ",", "we", "have", "found", "that", "Scp160p", "is", "released", "from", "polyribosomes", "by", "EDTA", "in", "the", "form", "of", "a", "large", "complex", "of", ">=", "1300", "kDa", "that", "is", "sensitive", "both", "to", "RNase", "and", "NaCl", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

6

[ "Using", "affinity", "-", "chromatography", "to", "isolate", "these", "complexes", ",", "we", "have", "identified", "two", "protein", "components", "other", "than", "Scp160p", ":", "poly", "(", "A", ")", "binding", "protein", ",", "Pab1p", ",", "and", "Bfr1p", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

7

[ "The", "presence", "of", "Pab1p", "confirms", "these", "complexes", "to", "be", "mRNPs", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

8

[ "The", "presence", "of", "Bfr1p", "is", "intriguing", "because", "the", "null", "phenotype", "for", "this", "gene", "is", "essentially", "the", "same", "as", "that", "reported", "for", "scp160", "-", "null", "cells", ":", "increased", "cell", "size", "and", "aberrant", "DNA", "content", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

9

[ "These", "results", "demonstrate", "that", "Scp160p", "associates", "with", "polyribosome", "-", "bound", "mRNP", "complexes", "in", "vivo", ",", "implicating", "a", "role", "for", "this", "protein", "in", "one", "or", "more", "levels", "of", "mRNA", "metabolism", "in", "yeast", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1, 0 ]

10

[ "INTRODUCTION" ]

[ 0 ]

11

[ "Scp160p", "is", "a", "1222", "amino", "acid", "Saccharomyces", "cerevisiae", "protein", "that", "contains", "14", "copies", "of", "the", "hnRNP", "K", "homology", "(", "KH", ")", "domain", ",", "a", "highly", "conserved", "motif", "found", "in", "many", "proteins", "involved", "in", "RNA", "metabolism", "(", "1", ")", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1, 2, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

12

[ "KH", "domain", "-", "containing", "proteins", "appear", "to", "have", "diverse", "functions", "and", "have", "been", "identified", "in", "all", "kingdoms", "of", "life", ",", "including", "the", "ribosomal", "protein", "S3", "from", "Escherichia", "coli", "(", "1", ")", ",", "Mer1p", "from", "S", ".", "cerevisiae", ",", "a", "meiosis", "-", "specific", "splicing", "factor", "(", "1", ")", ",", "MEX", "-", "3", "from", "Caenorhabditis", "elegans", ",", "presumably", "involved", "in", "mRNA", "localization", "during", "development", "(", "2", ")", ",", "and", "FMRP", ",", "the", "fragile", "-", "X", "mental", "retardation", "protein", "in", "humans", "(", "3", ")", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1, 2, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1, 2, 2, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1, 2, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1, 0, 0, 0, 0 ]

13

[ "A", "partial", "clone", "of", "Scp160p", ",", "known", "as", "HX", ",", "was", "one", "of", "the", "first", "multiple", "-", "KH", "proteins", "identified", "(", "1", ")", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

14

[ "Whole", "cell", "immunofluorescence", "studies", "have", "demonstrated", "that", "Scp160p", "localizes", "to", "the", "cytoplasm", ",", "with", "enrichment", "around", "the", "nuclear", "envelope", ",", "and", "what", "appears", "to", "be", "the", "endoplasmic", "reticulum", "(", "3", ")", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

15

[ "Deletion", "of", "the", "SCP160", "locus", "in", "yeast", "is", "not", "lethal", ",", "but", "results", "in", "a", "complex", "phenotype", ",", "including", "increased", "DNA", "content", "per", "cell", ",", "missegregation", "of", "genetic", "markers", "during", "sporulation", ",", "and", "abnormal", "cell", "morphology", ",", "including", "increased", "size", "and", "irregular", "shape", "(", "4", ")", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

16

[ "Observation", "of", "this", "phenotype", "led", "to", "the", "hypothesis", "that", "Scp160p", "may", "function", "in", "regulating", "ploidy", "during", "cell", "division", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

17

[ "More", "recently", ",", "Weber", "and", "colleagues", "demonstrated", "in", "vitro", "RNA", "binding", "activity", "of", "Scp160p", "using", "northwestern", "blot", "analyses", ";", "the", "protein", "was", "found", "to", "bind", "efficiently", "to", "ribohomopolymers", "and", "rRNA", ",", "but", "not", "to", "tRNA", "(", "5", ")", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

18

[ "Cell", "fractionation", "studies", "revealed", "that", "a", "large", "percentage", "of", "Scp160p", "associates", "with", "membrane", "-", "pellets", ",", "and", "is", "released", "by", "treatment", "with", "either", "10", "mM", "EDTA", "or", "500", "mM", "NaCl", "(", "5", ")", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

19

[ "While", "these", "authors", "interpreted", "these", "results", "to", "suggest", "that", "the", "nuclear", "envelope", "/", "ER", "localization", "of", "Scp160p", "was", "due", "primarily", "to", "interactions", "of", "the", "protein", "with", "membrane", "-", "bound", "polyribosomes", ",", "clear", "evidence", "of", "this", "association", "has", "not", "been", "reported", "(", "5", ")", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

20

[ "Currently", ",", "the", "relationship", "between", "the", "phenotype", "of", "scp160", "null", "mutants", "and", "the", "RNA", "-", "binding", "activity", "of", "Scp160p", "remains", "unclear", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

21

[ "Scp160p", "demonstrates", "significant", "sequence", "homology", "(", "~", "23", "%", "identity", "and", "~", "40", "%", "similarity", "at", "the", "amino", "acid", "level", ")", "to", "a", "class", "of", "vertebrate", "KH", "-", "domain", "proteins", "collectively", "known", "as", "vigilins", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

22

[ "First", "identified", "in", "chicken", ",", "vigilin", "homologues", "have", "now", "been", "found", "in", "human", "(", "6", ")", ",", "Xenopus", "laevis", "(", "7", ")", ",", "Drosophila", "melanogaster", "(", "8", ")", ",", "C", ".", "elegans", "(", "5", ")", "and", "Schizosaccharomyces", "pombe", "." ]

[ 0, 0, 0, 1, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1, 0, 0, 0, 0, 1, 2, 0, 0, 0, 0, 1, 2, 0, 0, 0, 0, 1, 2, 2, 0, 0, 0, 0, 1, 2, 0 ]

23

[ "While", "all", "of", "the", "vigilin", "proteins", "studied", "to", "date", "are", "reported", "to", "bind", "nucleic", "acid", ",", "both", "the", "type", "of", "nucleic", "acid", "bound", "and", "the", "functional", "significance", "of", "these", "interactions", "remain", "unclear", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

24

[ "For", "example", ",", "Kruse", "and", "colleagues", "reported", "from", "their", "work", "with", "human", "cells", "in", "culture", "that", "vigilin", "may", "be", "involved", "in", "the", "binding", "and", "transport", "of", "tRNA", "(", "9", "-", "11", ")", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

25

[ "In", "contrast", ",", "Dodson", "and", "Shapiro", "concluded", "from", "their", "work", "with", "Xenopus", "vigilin", "that", ",", "in", "response", "to", "estrogen", ",", "the", "protein", "bound", "specifically", "to", "the", "3", "'", "UTR", "of", "vitellogenin", "mRNA", "(", "7", ",", "12", ")", ",", "potentially", "stabilizing", "the", "message", "(", "13", ")", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

26

[ "Lastly", ",", "DDP1", ",", "the", "Drosophila", "homolog", "of", "vigilin", ",", "was", "reported", "recently", "to", "interact", "with", "the", "dodeca", "-", "satellite", "repeat", "regions", "of", "centromeric", "heterochromatin", "in", "embryonic", "and", "larval", "cell", "nuclei", ",", "suggesting", "a", "possible", "role", "for", "this", "protein", "in", "heterochromatin", "structure", "(", "8", ")", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

27

[ "The", "goal", "of", "the", "present", "study", "was", "to", "begin", "elucidating", "the", "function", "of", "Scp160p", "in", "yeast", "by", "characterizing", "the", "subcellular", "distribution", "and", "macromolecular", "interactions", "of", "this", "protein", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

28

[ "We", "have", "demonstrated", "that", "Scp160p", "in", "cytoplasmic", "lysates", "is", "associated", "predominantly", "with", "polyribosomes", ",", "and", "that", "following", "treatment", "with", "EDTA", ",", "Scp160p", "remains", "in", "an", "RNase", "/", "NaCl", "-", "sensitive", "complex", "of", "apparent", "molecular", "weight", "approximately", ">=", "1300", "kDa", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

29

[ "Affinity", "purification", "of", "this", "complex", "revealed", "the", "presence", "of", "poly", "(", "A", ")", "-", "binding", "protein", "(", "Pab1p", ")", ",", "a", "well", "-", "characterized", "component", "of", "eukaryotic", "mRNPs", "(", "14", ",", "15", ")", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

30

[ "Finally", ",", "a", "third", "abundant", "protein", "component", "of", "this", "complex", "was", "identified", "as", "Bfr1p", ",", "a", "protein", "not", "previously", "reported", "to", "associate", "with", "mRNPs", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

31

[ "While", "the", "function", "of", "Bfr1p", "remains", "unknown", ",", "gene", "deletion", "reportedly", "leads", "to", "a", "phenotype", "remarkably", "similar", "to", "that", "of", "scp160", "deletion", "(", "16", ")", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

32

[ "These", "results", "indicate", "a", "role", "for", "Scp160p", "in", "mRNA", "metabolism", "in", "yeast", ",", "and", "by", "extension", ",", "support", "results", "seen", "with", "Xenopus", "vigilin", "in", "its", "interactions", "with", "mRNA", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

33

[ "To", "our", "knowledge", ",", "the", "data", "reported", "here", "demonstrate", "Scp160p", "to", "be", "the", "first", "example", "of", "a", "KH", "-", "domain", "protein", "that", "functions", "as", "a", "component", "of", "polyribosome", "-", "associated", "mRNP", "complexes", "in", "the", "yeast", ",", "S", ".", "cerevisiae", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1, 0, 1, 2, 2, 0 ]

34

[ "MATERIALS", "AND", "METHODS" ]

[ 0, 0, 0 ]

35

[ "Plasmids", ",", "yeast", "strains", "and", "culture", "conditions" ]

[ 0, 0, 1, 0, 0, 0, 0 ]

36

[ "All", "recombinant", "DNA", "manipulations", "were", "performed", "according", "to", "standard", "techniques", "and", "utilized", "E", ".", "coli", "strain", "XL1", "-", "Blue", "(", "Stratagene", ")", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1, 2, 2, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

37

[ "The", "yeast", "strain", "JFy1511", ",", "expressing", "FLAG", "-", "Scp160p", ",", "was", "derived", "by", "two", "-", "step", "gene", "replacement", "from", "strain", "yJJ52", "(", "MAT", "alpha", "gal7", "Delta", "102", "ura3", "-", "52", "trp1", "-", "289", "ade1", "lys1", "leu2", "-", "3", ",", "112", ";", "generously", "donated", "by", "Drs", "Mark", "Parthun", "and", "Judith", "Jaehning", ",", "University", "of", "Colorado", "Health", "Sciences", "Center", ")", ",", "and", "confirmed", "by", "PCR", "." ]

[ 0, 1, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

38

[ "The", "wild", "-", "type", "SCP160", "coding", "sequence", "was", "obtained", "by", "PCR", "amplification", "from", "a", "genomic", "DNA", "preparation", "from", "yJFK1", "(", "MAT", "alpha", "gal7", "Delta", "102", "ura3", "-", "52", "trp1", "-", "289", "ade1", "lys1", "leu2", "-", "3", ",", "112", "Delta", "GAL80", ":", ":", "URA3", ")", ",", "using", "a", "16", ":", "1", "mixture", "of", "Taq", "(", "Fisher", "Biotech", ")", "and", "Pfu", "(", "Stratagene", ")", "DNA", "polymerases", "and", "the", "following", "primers", ":", "Scp160F1", "(", "5", "'", "-", "GCCGGTCGA", "-", "CTAACTGCAATGTCTGAAGAACAAACCGCTATTG", "-", "3", "'", ")", "and", "Scp160R1", "(", "5", "'", "-", "GCGCGTCGACGAGCTTGTCTATCTT", "-", "CTTAAGG", "-", "3", "'", ")", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

39

[ "A", "wild", "-", "type", "SCP160", "genomic", "clone", ",", "containing", "1", "kb", "upstream", "and", "300", "bp", "downstream", "sequence", "was", "PCR", "amplified", "from", "yJFK1", "genomic", "DNA", "using", "the", "primers", "Scp160F0", "(", "5", "'", "-", "GCCGAGCTCACACCAGCTTTGTCCTGG", "-", "3", "'", ")", "and", "Scp160R2", "(", "5", "'", "-", "GCGCAAGCTTGTGCGGTA", "-", "TCCCAGTCTATG", "-", "3", "'", ")", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

40

[ "The", "resultant", "clone", "was", "confirmed", "by", "dideoxy", "sequencing", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

41

[ "The", "N", "-", "terminal", "FLAG", "and", "HA", "tags", "were", "added", "using", "PCR", "with", "the", "primers", "ScpFLAGF1", "(", "5", "'", "-", "CCAT", "-", "TATAACTGCAATGGACTACAAGGACGACGACGACGAC", "-", "AAGATGTCTGAAGAACAAACCGCTATTG", "-", "3", "'", ")", "and", "ScpHAF1", "(", "5", "'", "-", "CCCCCTCCTGTCGACATTATAACTGCAATGCACCA", "-", "TCACCATCACCATTCTGAAGAACAAACCGCTATTG", "-", "3", "'", ")", "respectively", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

42

[ "For", "integration", ",", "constructs", "containing", "the", "1", "kb", "upstream", "and", "300", "bp", "downstream", "sequence", "were", "subcloned", "into", "the", "plasmid", "YIplac211", "(", "17", ")", "using", "SacI", "and", "HindIII", "restriction", "sites", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

43

[ "The", "HA", "-", "tagged", "construct", "was", "subcloned", "into", "the", "low", "copy", "number", "plasmid", ",", "YCplac22", "using", "SacI", "and", "HindIII", "restriction", "sites", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

44

[ "The", "SCP160", "deletion", "construct", "was", "made", "by", "removal", "of", "a", "3", ".", "4", "kb", "ApaI", "-", "KpnI", "fragment", "from", "the", "coding", "region", "of", "this", "construct", ",", "followed", "by", "treatment", "with", "Klenow", "fragment", "and", "re", "-", "ligation", "following", "attachment", "of", "BamHI", "linker", "oligonucleotides", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

45

[ "Genomic", "integration", "of", "the", "plasmid", "sequences", "and", "subsequent", "removal", "of", "the", "endogenous", "SCP160", "allele", "were", "achieved", "by", "standard", "two", "-", "step", "gene", "replacement", "techniques", "(", "18", ")", "and", "confirmed", "by", "PCR", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

46

[ "The", "N", "-", "terminally", "HA", "-", "tagged", "allele", "of", "BFR1", "was", "generated", "by", "PCR", "-", "amplifiction", "of", "the", "BFR1", "locus", "from", "wild", "-", "type", "(", "W303", ")", "yeast", "genomic", "DNA", "using", "the", "primers", "BFR1HAF1", "(", "5", "'", "-", "CCGCGGATCCATGTACC", "-", "CATACGACGTCCCAGACTACGCTATGTCCTCCCAAC", "-", "AACACAA", "-", "3", "'", ")", "and", "BFR1HINDR1", "(", "5", "'", "-", "CCGCAAGCTTGTCG", "-", "ACTATTTCATATGCCACAGGAAACAG", "-", "3", "'", ")", ",", "and", "subcloned", "into", "YIPlac211", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

47

[ "The", "BFR1", "promoter", "region", "was", "PCR", "-", "amplified", "in", "a", "similar", "manner", "using", "the", "primers", "BFR1SACF1", "(", "5", "'", "-", "CCGCGAG", "-", "CTCAGCATTAAGCATTCACGAGC", "-", "3", "'", ")", "and", "BFR1BAMR1", "(", "5", "'", "-", "CCGCGGATCCGGCAATGGCTGTGTTGTTAGA", "-", "3", "'", ")", "and", "subcloned", "into", "the", "appropriate", "position", "upstream", "of", "the", "HA", "-", "Bfr1p", "open", "reading", "frame", "in", "the", "plasmid", "backbone", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

48

[ "The", "entire", "open", "reading", "frame", "was", "confirmed", "by", "dideoxy", "sequencing", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

49

[ "Finally", ",", "the", "HA", "-", "BFR1", "allele", "was", "substituted", "into", "the", "yeast", "genome", "in", "place", "of", "the", "native", "allele", "using", "linearization", "with", "SphI", "and", "standard", "two", "-", "step", "gene", "replacement", "techniques", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

50

[ "All", "yeast", "transformations", "and", "culture", "manipulations", "were", "performed", "according", "to", "standard", "protocols", "as", "described", "elsewhere", "(", "19", ")", "." ]

[ 0, 1, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

51

[ "Confirmation", "of", "genomic", "integrations" ]

[ 0, 0, 0, 0 ]

52

[ "All", "genomic", "integrations", "were", "confirmed", "by", "PCR", "amplifications", "from", "purified", "yeast", "genomic", "DNA", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1, 0, 0, 0 ]

53

[ "For", "scp160", "deletion", "mutants", ",", "the", "primers", "Scp160PF", "(", "5", "'", "-", "GATTTCCTAACTTTCC", "-", "GTCTA", "-", "3", "'", ")", "and", "Scp160R5", "(", "5", "'", "-", "GCGCAAGCTTCACCGCCTTATAACGAAGAC", "-", "3", "'", ")", "that", "flanked", "the", "deleted", "region", "were", "used", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

54

[ "Similarly", ",", "epitope", "tags", "on", "Scp160p", "were", "confirmed", "by", "PCR", "using", "primers", "that", "flanked", "the", "tag", "sequence", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

55

[ "Positive", "clones", "were", "further", "confirmed", "by", "western", "blot", "analysis", "of", "crude", "cell", "lysates", "using", "the", "appropriate", "anti", "-", "tag", "antibodies", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

56

[ "The", "presence", "of", "HA", "-", "Bfr1p", "in", "cells", "was", "confirmed", "by", "western", "blot", "analysis", "of", "soluble", "cell", "lysates", "using", "12CA5", "mAb", "(", "Boehringer", "Mannheim", ")", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

57

[ "Polyribosome", "isolation" ]

[ 0, 0 ]

58

[ "Polyribosomes", "were", "isolated", "using", "a", "combination", "of", "protocols", "described", "by", "Stansfield", "and", "colleagues", "(", "20", ")", "and", "by", "Dr", "Maurice", "Swanson", "(", "personal", "communication", ")", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

59

[ "In", "brief", ",", "a", "100", "ml", "culture", "of", "yeast", "was", "grown", "in", "either", "YEPD", "or", "Hartwell", "synthetic", "medium", ",", "to", "early", "-", "log", "phase", "(", "OD600", "=", "1", ".", "0", ")", ",", "at", "which", "time", "cyclohexamide", "(", "Sigma", ")", "was", "added", "directly", "to", "the", "culture", "to", "a", "final", "concentration", "of", "100", "micro", "g", "/", "ml", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

60

[ "The", "culture", "was", "incubated", "on", "ice", "for", "15", "min", ",", "and", "cells", "were", "harvested", "by", "centrifugation", "(", "4000", "r", ".", "p", ".", "m", ".", "/", "10", "min", ")", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

61

[ "Following", "two", "washes", "in", "10", "ml", "of", "water", "containing", "100", "micro", "g", "/", "ml", "cyclohexamide", ",", "cells", "were", "lysed", "by", "vortex", "agitation", "with", "an", "equal", "volume", "of", "glass", "beads", "in", "1", "ml", "lysis", "buffer", "(", "25", "mM", "Tris", "pH", "7", ".", "2", ",", "50", "mM", "KCl", ",", "30", "mM", "MgCl2", ",", "5", "mM", "beta", "-", "mercaptoethanol", ",", "200", "micro", "g", "/", "ml", "cyclohexamide", ",", "2", "micro", "g", "/", "ml", "aprotonin", ",", "1", "mM", "PMSF", ",", "0", ".", "5", "micro", "g", "/", "ml", "leupeptin", ",", "2", ".", "9", "micro", "g", "/", "ml", "E64", ",", "1", "micro", "g", "/", "ml", "antipain", ",", "0", ".", "2", "micro", "g", "/", "ml", "chymostatin", ")", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

62

[ "Lysate", "was", "transferred", "to", "a", "clean", "microfuge", "tube", ",", "and", "centrifuged", "10", "min", "at", "3000", "g", "at", "4", "degrees", "C", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

63

[ "The", "supernatant", "was", "again", "transferred", "to", "a", "clean", "microfuge", "tube", "and", "centrifuged", "at", "12", "000", "g", "for", "15", "min", "at", "4", "degrees", "C", ",", "and", "then", "assayed", "for", "absorbance", "at", "260", "nm", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

64

[ "Approximately", "12", "OD260", "units", "were", "loaded", "onto", "a", "11", "ml", "15", "-", "45", "%", "sucrose", "gradient", "made", "in", "10", "mM", "Tris", ",", "pH", "7", ".", "4", ",", "70", "mM", "NH4Cl", ",", "4", "mM", "MgOAc", ",", "using", "a", "Gradient", "Master", "automatic", "system", ",", "and", "the", "gradient", "was", "centrifuged", "in", "a", "SW41ti", "rotor", "(", "Beckman", ")", "at", "39", "000", "r", ".", "p", ".", "m", ".", "for", "2", ".", "5", "h", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

65

[ "0", ".", "5", "ml", "fractions", "were", "collected", "using", "an", "Isco", "gradient", "fractionator", ",", "and", "gradient", "profiles", "were", "determined", "by", "monitoring", "absorbance", "at", "254", "nm", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

66

[ "For", "EDTA", "controls", ",", "lysis", "buffer", "containing", "5", "mM", "MgCl2", "was", "used", ",", "and", "30", "mM", "EDTA", "was", "added", "to", "the", "sample", "before", "loading", "onto", "the", "gradient", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

67

[ "Where", "indicated", ",", "addition", "of", "50", "U", "/", "ml", "of", "RNase", "One", "(", "Promega", ")", "was", "performed", "prior", "to", "loading", "the", "sample", "onto", "the", "gradient", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

68

[ "Gel", "filtration", "chromatography" ]

[ 0, 0, 0 ]

69

[ "Gel", "filtration", "chromatography", "was", "performed", "using", "a", "120", "ml", "Hi", "-", "Prep", "S", "-", "300", "Sephacryl", "column", "(", "Pharmacia", ")", "with", "a", "cut", "-", "off", "of", "1300", "kDa", ",", "attached", "to", "an", "FPLC", "system", "(", "Pharmacia", ")", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

70

[ "The", "column", "had", "been", "calibrated", "previously", "using", "the", "following", "molecular", "weight", "standards", "(", "Sigma", ")", ":", "blue", "dextran", "(", "2000", "kDa", ")", ",", "thyroglobulin", "(", "669", "kDa", ")", ",", "apoferritin", "(", "443", "kDa", ")", ",", "alcohol", "dehydrogenase", "(", "150", "kDa", ")", ",", "and", "bovine", "serum", "albumin", "(", "66", "kDa", ")", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

71

[ "Yeast", "were", "lysed", "as", "described", "for", "polyribosome", "analysis", ",", "with", "an", "additional", "clarification", "by", "passage", "through", "a", "0", ".", "2", "micro", "m", "syringe", "-", "tip", "filter", "(", "Acrodisc", ")", "and", "run", "over", "the", "column", "at", "a", "rate", "of", "0", ".", "5", "ml", "/", "min", "in", "polyribosome", "lysis", "buffer", "following", "treatment", "with", "the", "indicated", "reagents", "." ]

[ 1, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

72

[ "Fractions", "(", "2", ".", "0", "ml", ")", "were", "collected", ",", "from", "which", "12", "micro", "l", "were", "combined", "with", "sample", "buffer", "(", "2", "%", "SDS", ",", "10", "%", "glycerol", ",", "100", "mM", "dithiothreitol", ",", "60", "mM", "Tris", "pH", "6", ".", "8", ",", "0", ".", "001", "%", "bromophenol", "blue", ")", "and", "analyzed", "by", "western", "blot", "using", "the", "indicated", "antibodies", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

73

[ "alpha", "-", "FLAG", "affinity", "chromatography" ]

[ 0, 0, 0, 0, 0 ]

74

[ "For", "most", "experiments", ",", "one", "liter", "yeast", "cultures", "were", "grown", "to", "early", "log", "-", "phase", "and", "harvested", "by", "centrifugation", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

75

[ "Cells", "were", "washed", "twice", "in", "T75", "buffer", "(", "25", "mM", "Tris", "pH", "7", ".", "5", ",", "75", "mM", "NaCl", ")", "and", "then", "were", "lysed", "by", "vortex", "agitation", "with", "an", "equal", "volume", "of", "glass", "beads", "in", "4", "ml", "T75", "buffer", "containing", "30", "mM", "EDTA", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

76

[ "Lysate", "was", "transferred", "to", "a", "clean", "microfuge", "tube", ",", "and", "centrifuged", "for", "10", "min", "at", "3000", "g", "at", "4", "degrees", "C", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

77

[ "The", "supernatant", "was", "again", "transferred", "to", "a", "clean", "microfuge", "tube", "and", "centrifuged", "at", "12", "000", "g", "for", "15", "min", "at", "4", "degrees", "C", ",", "and", "finally", "passed", "through", "a", "0", ".", "2", "micro", "m", "syringe", "filter", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

78

[ "Lysate", "was", "then", "pre", "-", "purified", "by", "running", "over", "the", "S", "-", "300", "gel", "-", "filtration", "column", "in", "T75", "buffer", ",", "with", "pooling", "of", "the", "void", "volume", "fractions", "(", "~", "10", "ml", "total", ")", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

79

[ "For", "several", "experiments", "(", "Fig", ".", "5A", ",", "B", ",", "E", "and", "F", ")", ",", "a", "low", "concentration", "(", "<", "10", "micro", "g", "/", "ml", ")", "of", "FLAG", "peptide", "(", "N", "-", "DYKDDDDK", "-", "C", ")", "was", "added", "to", "this", "sample", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

80

[ "This", "void", "material", "was", "then", "loaded", "onto", "a", "1", "ml", "M2", "alpha", "-", "FLAG", "column", "(", "Sigma", ")", ";", "column", "flow", "-", "through", "was", "passed", "over", "the", "column", "a", "second", "time", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

81

[ "The", "column", "was", "then", "washed", "extensively", "with", "75", "ml", "T75", "buffer", ";", "material", "bound", "to", "the", "column", "was", "eluted", "with", "5", "ml", "T75", "containing", "184", "mg", "/", "ml", "FLAG", "peptide", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

82

[ "The", "peptide", "solution", "was", "allowed", "to", "incubate", "on", "the", "column", "for", "20", "min", "prior", "to", "collection", "of", "the", "first", "1", "ml", "fraction", ";", "subsequent", "fractions", "were", "collected", "every", "10", "min", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

83

[ "Samples", "of", "crude", "material", ",", "S", "-", "300", "void", ",", "alpha", "-", "FLAG", "flow", "-", "through", ",", "first", "and", "last", "wash", ",", "and", "eluate", "fractions", "were", "analyzed", "by", "western", "blot", "using", "the", "indicated", "antibodies", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

84

[ "For", "Figure", "5A", "and", "E", ",", "samples", "of", "first", "and", "last", "wash", "and", "eluate", "fractions", "were", "concentrated", ",", "run", "on", "SDS", "-", "PAGE", "and", "stained", "with", "colloidal", "G250", "Coomassie", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

85

[ "Concentration", "of", "samples" ]

[ 0, 0, 0 ]

86

[ "Where", "indicated", ",", "samples", "were", "concentrated", "using", "the", "method", "of", "Traub", "et", "al", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

87

[ "(", "21", ")", "." ]

[ 0, 0, 0, 0 ]

88

[ "400", "micro", "l", "of", "sample", "were", "transferred", "to", "a", "microfuge", "tube", ",", "and", "combined", "with", "400", "micro", "l", "of", "methanol", ",", "and", "100", "micro", "l", "of", "chloroform", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

89

[ "Samples", "were", "then", "vortexed", "vigorously", ",", "and", "centrifuged", "for", "5", "min", "at", "12", "000", "g", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

90

[ "The", "supernatant", "was", "discarded", ",", "leaving", "the", "interface", "intact", ",", "and", "an", "additional", "400", "micro", "l", "of", "methanol", "was", "added", "to", "each", "tube", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

91

[ "Samples", "were", "then", "inverted", "several", "times", ",", "and", "centrifuged", "again", "for", "5", "min", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

92

[ "The", "supernatant", "was", "discarded", ",", "and", "the", "protein", "pellet", "was", "air", "-", "dried", "and", "resuspended", "in", "1", "x", "sample", "buffer", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

93

[ "Western", "blot", "analysis" ]

[ 0, 0, 0 ]

94

[ "Western", "blot", "analysis", "was", "performed", "essentially", "as", "described", "previously", "(", "19", ")", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

95

[ "Briefly", ",", "samples", "to", "be", "analyzed", "were", "mixed", "with", "sample", "buffer", ",", "boiled", ",", "electrophoresed", "through", "a", "10", "%", "SDS", "-", "polyacrylamide", "gel", ",", "and", "electro", "-", "blotted", "onto", "nitrocellulose", "(", "Bio", "-", "Rad", ")", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

96

[ "FLAG", "-", "Scp160p", "fusion", "protein", "was", "detected", "by", "incubation", "of", "the", "filter", "with", "mouse", "M2", "anti", "-", "FLAG", "monoclonal", "antibody", "(", "10", "micro", "g", "/", "ml", "final", "concentration", ")", ",", "followed", "by", "HRP", "-", "conjugated", "sheep", "anti", "-", "mouse", "secondary", "antibody", "(", "Amersham", ")", ",", "diluted", "1", ":", "5000", "as", "per", "the", "manufacturer", "'", "s", "instructions", ",", "and", "ECL", "reagent", "(", "Amersham", ")", ",", "followed", "by", "exposure", "to", "X", "-", "ray", "film", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1, 0, 0, 1, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

97

[ "HA", "-", "tagged", "Scp160p", "and", "HA", "-", "tagged", "Bfr1p", "were", "detected", "using", "the", "12CA5", "mAb", "(", "Boehringer", "Mannheim", ")", "at", "a", "final", "concentration", "of", "0", ".", "8", "micro", "g", "/", "ml", ";", "Pab1p", "and", "Pub1p", "were", "detected", "using", "1G1", "mAb", "at", "1", ":", "5000", ",", "and", "4C3", "mAb", "at", "1", ":", "1000", ",", "respectively", ",", "both", "generous", "gifts", "from", "Dr", "Maurice", "Swanson", "(", "22", ",", "23", ")", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

98

[ "Where", "appropriate", ",", "films", "were", "analyzed", "by", "scanning", "densitometry", "(", "Molecular", "Dynamics", ")", ",", "and", "quantitated", "using", "ImageQuant", "software", "(", "Molecular", "Dynamics", ")", "." ]

[ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 ]

99

[ "Colloidal", "G250", "coomassie", "staining" ]

[ 0, 0, 0, 0 ]