高通量测序

**DNA 定序**（英語：DNA sequencing）又稱 **DNA 測序**，是指分析特定 DNA 片段的鹼基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）與鳥嘌呤（G）的排列方式。快速的 DNA 定序方法的出現極大地推動了生物學和醫學的研究和發現。

在基礎生物學研究中，和在眾多的應用領域，如診斷，生物技術，法醫生物學，生物系統學中，DNA 序列知識已成為不可缺少的知識。具有現代的 DNA 定序技術的快速定序速度已經有助於達到定序完整的 DNA 序列，或多種類型的基因組定序和生命物種，包括人類基因組和其他許多動物，植物和微生物物種的完整 DNA 序列。

RNA 定序則通常將 RNA 提取後，反轉錄為 DNA 後使用 DNA 定序的方法進行定序。目前應用最廣泛的是由弗雷德里克・桑格發明的桑格定序。新的定序方法，例如 454 生物科學的方法和焦磷酸定序法。

## 應用

DNA 定序可用於確定任何生物的單個基因的序列，較大的遺傳區域（即基因簇或操縱子的簇），完整的染色體或整個基因組。 DNA 定序也是對 RNA 或蛋白質進行定序的最有效方法（通過對開放閱讀框定序）。目前，DNA 定序已成為生物學和其他科學領域（如醫學，法醫學或人類學等）的關鍵技術。

### 分子生物學

在分子生物學中，DNA 定序可被用於研究基因組及其編碼的蛋白質。利用定序獲得的資訊，科研人員能夠辨識基因的變化，基因與疾病和表型的關聯，並確定潛在的藥物靶點。

### 演化生物學

由於 DNA 是攜帶有遺傳資訊的大分子，在演化生物學中，DNA 定序被用於研究不同生物體之間的相關性以及它們是如何演化的。

### 宏基因組學（或元基因組學）

宏基因組學是一門直接取得環境中所有遺傳物質的研究。環境包括但不限於水體，污水，污垢，從空氣中過濾出的碎片或者從生物體採集的樣本。了解在特定環境中存在哪些生物體對於生態學，流行病學，微生物學和其他領域的研究至關重要。DNA 定序使研究人員能夠確定微生物群中可能存在哪些類型的微生物。

### 醫學

醫療人員可通過對患者基因（基因組）的定序結果確定該患者是否有攜帶遺傳性疾病的風險。需要注意的是，該方法屬於基因檢測，有些基因檢測不會用到 DNA 定序技術。

### 法醫學

DNA 定序可以與 DNA 圖譜鑑定（基因指紋分析，英語：DNA profiling）一起用於法醫鑑定和親子鑑定。 DNA 測試在過去的幾十年中發展迅猛，目前已能夠做到將 DNA 鑑定結果與被調查物件聯絡起來。指紋，唾液，毛囊等中的 DNA 特徵可以將不同的生物體進行區分。測試 DNA 是一種可以檢測 DNA 鏈中特定基因組並生成唯一的個性化 DNA 模型的技術。每一種有機體都有其 DNA 特徵，並可以通過 DNA 測試來確定。兩個人具有完全相同的 DNA 特徵是非常罕見的，因此保證了 DNA 測試的成功。

## 歷史

### DNA 結構與功能的發現

去氧核糖核酸（DNA）最早在 1869 年由 Friedrich Miescher 發現並分離出來，但由於當時普遍認為遺傳資訊儲存於蛋白質而不是 DNA 中，因此在過去幾十年中 DNA 一直沒有得到充分研究。1944 年，由於 Oswald Avery，Colin MacLeod 和 Maclyn McCarty 的一些實驗表明，純化的 DNA 可以將一種細菌變成另一種細菌，這種情況才發生了變化。這也是首次 DNA 顯示出改變細胞特性的能力。

1953 年，James Watson 和 Francis Crick 根據 Rosalind Franklin 研究的結晶 X 射線結構提出了他們的雙螺旋 DNA 模型。根據該模型，DNA 由彼此纏繞的兩條核苷酸鏈組成，通過氫鍵連接在一起並以相反方向執行。每條鏈由四個互補的核苷酸組成：腺嘌呤（A），胞嘧啶（C），鳥嘌呤（G）和胸腺嘧啶（T），其中 A 與 T 配對，C 與 G 配對。他們提出的這種結構，使得每條單鏈都可被用於重建另一條鏈，並且讓遺傳資訊代代相傳。

對蛋白質進行定序的基礎首先由弗雷德里克・桑格（Frederick Sanger）的工作奠定，他於 1955 年完成了胰島素（胰腺分泌的一種蛋白質）中所有胺基酸序列的定序工作。這是首個確鑿的證據證明蛋白質是具有特定分子模式的化學實體，而不是懸浮在流體中的隨機混合物。桑格在胰島素定序方面的成功使得 X 射線晶體學家大為振奮，包括華生和克里克，他們現在正試圖理解 DNA 如何指導細胞內蛋白質的形成。在 1954 年 10 月弗雷德里克・桑格出席一系列講座後不久，克里克開始發展一種理論，認為 DNA 中核苷酸的排列決定了蛋白質中胺基酸的序列，從而幫助確定蛋白質的功能。他於 1958 年發表了這一理論。

### RNA 定序

RNA 定序是最早的核苷酸定序形式之一。 RNA 定序的主要標誌是 1972 年和 1976 年 Walter Fiers 及其同事在根特大學（根特，比利時）確定並發表的第一個完整基因序列和噬菌體 MS2 的完整基因組。傳統的 RNA 定序方法需要建立一個用於定序的互補 cDNA（Complementary DNA）分子。

### 早期的 DNA 定序方法

確定 DNA 序列的第一種方法涉及由康奈爾大學的吳瑞於 1970 年建立的位置特異性引子延伸策略。 DNA 聚合酶催化和特定核苷酸標記，這兩者在當前的定序方案中都很重要，用於對 λ 噬菌體 DNA 的粘性末端進行定序。在 1970 年至 1973 年間，吳瑞、R Padmanabhan 及其同事證明，該方法可用於使用合成的位置特異性引子確定任何 DNA 序列。隨後弗雷德里克・桑格 (Frederick Sanger) 採用這種引子延伸策略在英國劍橋的英國醫學研究委員會 (MRC) 中心開發了更快速的 DNA 定序方法，並於 1977 年發表了「使用鏈終止抑制劑進行 DNA 定序」的方法。

### 全基因組定序

第一個完整的 DNA 基因組定序是在 1977 年 Φ-X174 噬菌體（Phage Φ-X174）的定序工作。醫學研究委員會的科學家在 1984 年破譯了 Epstein-Barr 病毒的完整 DNA 序列，發現它含有 172,282 個核苷酸。 該序列的完成標誌著 DNA 定序的一個重要轉折點，它在沒有病毒基因譜知識的情況下實現了 DNA 定序。

20 世紀 80 年代初，Pohl 及其同事開發了一種在電泳時將定序反應混合物的 DNA 分子轉移到固定基質上的非放射性方法。隨後 GATC Biotech 公司的 DNA 定序儀「Direct-Blotting-Electrophoresis-System GATC 1500」商業化，該定序儀在 EU 基因組定序程式的框架以及酵母釀酒酵母染色體 II 的完整 DNA 序列中廣泛使用。加利福尼亞理工學院的 Leroy E. Hood 實驗室於 1986 年宣布了第一台半自動 DNA 定序機。隨後，Applied Biosystems 在 1987 年推出了第一台全自動定序儀 ABI 370。以及 Dupont 公司的 Genesis 2000，該儀器使用了一種新的螢光標記技術，可在單一泳道中辨識所有四個雙去氧核苷酸。到 1990 年，美國國立衛生研究院（NIH）已開始對支原體，大腸桿菌，秀麗隱杆線蟲和釀酒酵母進行大規模定序實驗，費用為每個鹼基 0.75 美元。同時，人類 cDNA 序列的定序始於 Craig Venter 的實驗室，試圖取得人類基因組的編碼部分。 1995 年，Venter，Hamilton Smith 及其基因組研究所（TIGR）的同事發表了第一個完整的自由生物體細菌流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae）的基因組。該環形染色體中含有 1,830,137 個鹼基，其在《科學》雜誌中的發表標誌著全基因組鳥槍法定序的首次公開使用，擺脫了初始繪製工作的需要。

### 高通量定序 (HTS) 方法

1990 年代中後期開發了幾種新的 DNA 定序方法，並於 2000 年在商業 DNA 定序儀中實施。這些方法統稱為「下一代」或「第二代」定序 (NGS) 方法，以便將它們與包括桑格定序在內的早期方法區分開來。 與第一代定序相比，NGS 技術的典型特徵是高度可擴展，允許一次對整個基因組進行定序。通常，這是通過將基因組片段化成小塊、隨機採樣片段並使用多種技術之一對其進行定序來實現的，例如下面描述的那些。 整個基因組定序是可能的，因為在一個自動化過程中同時對多個片段進行定序（命名為「大規模並行」定序）。

1990 年 10 月 26 日，錢永健、Pepi Ross、Margaret Fahnestock 和 Allan J Johnston 提交了一項專利，描述了在 DNA 陣列（墨點和單個 DNA 分子）上使用可移除的 3' 阻斷劑進行逐步（「鹼基對鹼基」）定序。 1996 年，斯德哥爾摩皇家理工學院的波爾・尼倫 (Pål Nyrén) 和他的學生穆斯塔法・羅納吉 (Mostafa Ronaghi) 發表了他們的焦磷酸定序方法。

1997 年 4 月 1 日，Pascal Mayer 和 Laurent Farinelli 向世界智慧財產權組織提交了描述 DNA 菌落定序的專利。 本專利中描述的 DNA 樣品製備和隨機表面聚合酶連鎖反應 (PCR) 陣列方法，與錢永健等人的「鹼基對鹼基」定序方法相結合，現已在 Illumina 公司的 Hi-Seq 基因組定序儀中實施。

## 基本方法

### Maxam-Gilbert 定序法

馬克薩姆 - 吉爾伯特定序（英語：Maxam-Gilbert sequencing）是一項由阿倫・馬克薩姆與沃爾特・吉爾伯特於 1976～1977 年間開發的 DNA 定序方法。此項方法基於：對核鹼基特異性地進行局部化學改性，接下來在改性核苷酸毗鄰的位點處 DNA 骨架發生斷裂 。

### Sanger 定序法

Sanger（桑格）雙去氧鏈終止法是弗雷德里克・桑格（Frederick Sanger）於 1975 年發明的。定序過程需要先做一個聚合酶連鎖反應（PCR）。PCR 過程中，雙去氧核苷酸可能隨機地被加入到正在合成中的 DNA 片段里。由於雙去氧核糖核苷酸又少了一個氧原子，一旦它被加入到 DNA 鏈上，這個 DNA 鏈就不能繼續增加長度。最終的結果是獲得所有可能獲得的、不同長度的 DNA 片段。目前最普遍最先進的方法，是將雙去氧核糖核苷酸進行不同螢光標記。將 PCR 反應獲得的總 DNA 通過毛細管電泳分離，跑到最末端的 DNA 就可以在雷射的作用下發出螢光。由於 ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP（4 種雙去氧核糖核苷酸）螢光標記不同，電腦可以自動根據顏色判斷該位置上鹼基究竟是 A，T，G，C 中的哪一個。

## 進階方法和 de novo 定序法

### 霰彈槍定序法

霰彈槍定序法（Shotgun sequencing，又稱鳥槍法）是一種廣泛使用的為較長 DNA 定序的方法。它比傳統的定序法快速，但精確度較差。霰彈槍定序法曾經使用於塞雷拉基因組（Celera Genomics）公司所主持的人類基因組計劃。

### Bridge PCR

## 新一代定序

隨著人們對低成本定序的需求與日俱增，推動了**高通量定序**（high-throughput sequencing）的發展，此技術又稱為**二代定序**、**新一代定序**、**次世代定序**；這些技術對定序過程采多路復用，同時產生上千或上百萬條序列。高通量定序技術的目的是降低 DNA 定序的成本，這個成本比同樣可實現定序的染料終止法來得低得多。超高通量定序過程中可同時執行高達 500,000 次的邊合成邊定序。

### 454 生物科學和焦磷酸定序法

454 定序法由 454 生物科學發明，是一個類似焦磷酸定序法的新方法。2003 年向 GenBank 提交了一個腺病毒全序列，使得他們的技術成為 Sanger 定序法後第一個被用來測生物基因組全序列的新方法。454 使用類似於焦磷酸定序的方法，有著相當高的讀取速度，大約為 5 小時可以測兩千萬鹼基對。

## 正在開發的定序法

### 奈米孔 DNA 定序法

### 高通量定序

高通量定序能一次對幾十到幾百萬 DNA 分子進行序列測定。

## 參見

* 已定序的生物

## 參考文獻