荧光光谱

**螢光光譜**是指某些物質經某波長入射光照射後，分子從能級 Sa 被激發至能級 Sb，並在很短時間內去激發從 Sb 返回 Sa，發出波長長於入射光的螢光。

## 螢光光譜原理

設分子能級為基態 Sa，激發態 Sb。

分子在能級 Sa 和 Sb 上的分布按照波爾茲曼分布規律：

　
: $n_{b}/n_{a}=e^{-(E_{b}-E_{a})}=e^{-h\nu /kT}$

基態上分子數目變化速率為

　
: $-{\frac {dn_{a}}{dt}}=I(\nu )n_{a}B_{ab}-I(\nu )n_{b}B_{ba}-n_{b}A_{ba}$

平衡時（穩定態），上式為 0：
又有：

遷移機率（愛因斯坦係數）

　
: $B_{ab}=B_{ba}={\frac {2\pi }{3\hbar ^{2}}}D_{ab}$

偶極強度

　
: $D_{ab}=\mid <\psi _{b}\mid {\underline {\mu }}\mid \psi _{a}>\mid $

頻率 ν 處的入射光強

　
: $I(\nu )={\frac {8{\pi }h{\nu ^{3}}}{c^{3}(e^{h{\nu }/kT}-1)}}$

推導出：
Sb 通過發射光子從回到 Sa 的機率，即衰減常數 λ

　
: $A_{ba}=({\frac {32{\pi ^{3}}{\nu ^{3}}}{3c^{3}\hbar }})\mid <\psi _{b}\mid {\underline {\mu }}\mid \psi _{a}>\mid $

Sb 上的分子去激發速率

　
: ${\frac {dn_{b}}{dt}}=-A_{ba}n_{b}$

上式的一個解為

　
: $n_{b}(t)=n_{b}(0)e^{-A_{ba}t}$

可見激發態上的分子數目以指數形式衰減，衰減常數為 Aba
Sb 的輻射壽命為（此處參考指數衰減）

　
: $\tau _{R}={\frac {1}{A_{ba}}}$

此僅當吸收的光子和隨後發射的光子相同時候有效，即全部吸收的光能量通過輻射過程全部發出光子消耗掉。
而實測時激發態壽命很少和上述壽命一致，因為激發態除了直接發射光子外有很多其他途徑失去能量。

Sb 通過發出螢光回到 Sa 的過程的反應速率，即固有螢光速率常數 kF

　
: $k_{F}=A_{ba}={\frac {1}{\tau _{R}}}$

Sb 回到 Sa 的其他非輻射途徑包括內轉變，系統間轉變，猝熄作用，其速率常數分別為 kIC,kIS,kQ[Q]
則 Sb 總的去激化（熄滅）常數為 kF+kIC+kIS+kQ[Q]

螢光量子產率

　
: $\phi _{F}={\frac {k_{F}}{k_{F}+k_{I}C+k_{I}S+k_{Q}[Q]}}$

也可以寫作發射光子數 / 吸收光子數，即發射的螢光光子數 / 入射光照射時的吸收量

因為大量的非輻射過程的存在，所以激發態實際衰減時間遠小於理想的輻射壽命 τR 描述此動力學過程

　
: $-{\frac {d[S_{b}]}{dt}}=(k_{F}+k_{I}C+k_{I}S+k_{Q}[Q])[S_{b}]$

此方程的一個解為

　
: $S_{b}(t)=S_{b}(0)e^{-t/\tau _{F}}$

Sb 是激發態上的分子數

## 斯托克斯位移

吸收曲線的 0,0 躍遷與發射曲線的 0,0 躍遷不重合，之間有一位移，螢光光譜較相應的吸收光譜紅移。
原因是分子在處於激發態期間進行了重定向 / 重排布，消耗了能量，故螢光光譜的 0,0 峰向低能量（高波長）方向平移。

## 螢光強度

　
: $A=\epsilon cl=lg{\frac {I_{0}}{I}}$

得到

　
: $I=I_{0}e^{-2.303\epsilon cl}$

觀測發射強度為

　
: $F(\lambda )=2.303\epsilon clI_{0}\phi _{F}f(\lambda )d=\epsilon \phi _{F}f(\lambda )cI_{0}k$

k=2.303ld

給一束脈衝入射光後，發射光在脈衝後的時間 t 時的強度 I (t)，與激發態的衰減率 dSb/dt 及激發態通過螢光衰減的比率 φF（量子產率）成比例：

　
: $I(t)={\frac {dS_{b}}{dt}}\phi _{F}=S_{b}(0)({\frac {\phi _{F}}{\tau _{F}}}e^{-t/\tau _{F}}=k_{F}S_{b}(0)e^{-t/\tau _{F}}$

隨時間表現為指數衰減

系統內有一種螢光物質時：

　
: $E_{m}(t)=Ae^{-t/\tau _{F}}$

系統中有兩種螢光物質時：

　
: $E_{m}(t)=A_{1}e^{-t/\tau _{1F}}+A_{2}e^{-t/\tau _{2F}}$

Em 是螢光強度，上述公式為螢光衰減（decay）公式

## 內部濾光效應

對高濃度溶液而言，螢光的再吸收不能忽略。大部分入射光在系統前半部分被吸收，發射的螢光被再吸收，只有少量的螢光通過狹縫入射到螢光探測器上，使得探測到的螢光強度減少。

## 外環境影響

去激發同樣可能由於碰撞或和溶劑分子的混合導致，以速率 kQ[Q] 發生。和其他過程不同，考慮碰撞時此猝熄是一個雙分子過程。
Sb + Q → Sa + Q (kQ[Q])

因為 Q 通常濃度遠大於 Sb ，此過程被視為一個偽一級反應，kQ[Q] 的值可通過變化猝熄劑 Q 的濃度，觀察對 φF 的影響測得。芳香類發色基的輻射壽命通常為 1\*10-9 到 100\*10-9 秒。因此，相比較而言，猝熄過程是相當有效率的。普遍的猝熄劑如 O2 和 I-離子，每和激發態分子碰撞一次就會使其去激發一次。此反應速率僅被擴散限制。在微摩爾濃度猝熄劑下，碰撞發生速率為 108 每秒，因此可以觀察到明顯的猝熄。

　
: ${\frac {F_{0}}{F}}={\frac {\phi _{0}}{\phi }}={\frac {k_{F}+k_{I}C+k_{I}S+k_{Q}[Q]}{k_{F}+k_{I}C+k_{I}S}}=1+k_{Q}[Q]$

τ0 可測，以 F0/F 對 [Q] 作圖求得 kQ

## 螢光共振能量遷移

簡稱 FRET，此過程適用與計算兩端帶發色基的高分子長度。

存在供體 D 和受體 A，當光入射時，激發基態供體 Da→Db，Db 又去激發，通過共振將能量傳遞給 Aa，使得 Aa→Ab。

定義遷移效率（E）是 Db 去激發傳遞能量到 Aa 占總 Db 去激發的比例

　
: $E={\frac {k_{T}}{k_{T}+k_{F}^{D}<+k_{I}C^{D}<+k_{I}S^{D}}}$

通過一系列複雜的計算和變化，此處省略，得：

　
: $k_{T}={\frac {1}{\tau _{0}}}{\frac {R_{0}}{R}}$

　
: $R_{0}=9.7*10^{3}(J\kappa ^{2}n^{-4}\phi _{D})^{\frac {1}{6}}cm$

　
: $J=\int \epsilon (\nu )f_{D}(\nu )\nu ^{-4}\,d\nu $

推導出：

　
: $E={\frac {R_{0}^{6}}{R_{0}^{6}+R^{6}}}$

這裡 R0 對一個固定的化學系統而言是常數，R 是供體和受體之間的距離，R 越接近 R0，測計算越精確。

此外計算 E 的方法有：

　
: ${\frac {\phi _{D+A}}{\phi _{D}}}=1-E$

　
: ${\frac {F_{D+A}}{F_{A}}}=1+{\frac {\epsilon _{D}c_{D}}{\epsilon _{A}c_{A}}}E$

　
: ${\frac {\tau _{D,A}}{\tau _{D}}}=1-E$

## 參考文獻

* C.P Cantor & P.R. Schimmel, BIOPHYSICAL CHEMISTRY, Part II. Techniques for the study of biological structure and function. Page 433-465.