延遲股

**DNA 複製**是指 DNA 雙股在細胞分裂間期階段進行以一個親代 DNA 分子為模板合成子代 DNA 鏈的過程。複製的結果是一條雙股變成兩條一樣的雙股（如果複製過程正常的話），每條雙股都與原來的雙股一樣（排除突變等不定因素）。

DNA 複製是一種在所有的生物體內都會發生的生物學過程，是生物遺傳的基礎。對於雙股 DNA（即絕大部分生物體內的 DNA）來說，在正常情況下，這個過程開始於一個親代 DNA 分子，最後產生出兩個相同的子代 DNA 分子。親代雙股 DNA 分子的每條單股都被作為模板，用以合成新的互補單股，這一過程被稱為半保留複製。細胞的校對機制確保了 DNA 複製近乎完美的準確性。

在細胞當中，DNA 複製起始於基因組的特殊位點，稱為「複製起點」。起始於複製起點的 DNA 解鏈和新鏈的合成會形成複製叉。除了 DNA 聚合酶外，一些酶（引發酶、DNA 連接酶）通過添加和模板相配的核苷酸來合成新 DNA，一些和複製叉連接的其他酶或蛋白（拓撲異構酶、解旋酶、單股 DNA 結合蛋白、引發酶、DNA 連接酶）對 DNA 的複製起始、穩定、延伸起輔助作用。

DNA 複製也可以在體外（即人工地）進行，從細胞中分離的 DNA 聚合酶和人造的 DNA 複製引子可以用來啟動以已知序列的 DNA 分子為模板的複製，聚合酶連鎖反應（PCR）是一種常見的實驗室技術，這種採用了循環方式的人工合成，在一個 DNA 池中擴增出特定的 DNA 片段。

## DNA 的結構

DNA 通常是一個雙股的結構，兩條單股互相盤繞從而表現出雙螺旋結構。去氧核糖核苷酸是 DNA 的單體。DNA 的每一條單股都是由四種鹼基不同的去氧核糖核苷酸構成的，這四種鹼基即：腺嘌呤（**A**）、胞嘧啶（**C**）、鳥嘌呤（**G**）和胸腺嘧啶（**T**）。一個核苷酸可以是一磷酸、二磷酸或者三磷酸的，也就是說，一個去氧核糖連接著一個、兩個或者三個磷酸基團。每條單股中相鄰的去氧核糖核苷酸都通過化學反應生成磷酸二酯鍵相連接，以此形成了 DNA 雙螺旋結構中由磷酸基團和去氧核糖組成的骨架，而骨架裡面即是鹼基對。兩條單股之間的核苷（即鹼基）通過氫鍵形成鹼基對相連。一般情況下，A 只與 T 相連，而 C 只與 G 相連。

DNA 鏈是具有方向性的，對於 DNA 的一條單股來說，它的兩個末端分別被命名為「3' 端」和「5' 端」。DNA 兩條單股的結構之所以被描述為「反向平行雙螺旋」，其中的「反向」即指兩條單股中，一條鏈的方向是從 3' 端到 5' 端，而另一條則相反，是從 5' 端到 3' 端。5 和 3 指的是在一個去氧核糖中連接著相鄰的磷酸基團的兩個碳原子。方向性對於 DNA 合成有重要的意義，因為在 DNA 合成的過程中，DNA 聚合酶只能向 3' 端的方向添加新的去氧核糖核苷酸。

DNA 中兩條鏈的鹼基是通過氫鍵連接實現一一配對的，這意味著一個 DNA 中的兩條單股都包含著完全相同的資訊。這樣，一條單股中的核苷酸可以用來重建互補鏈中預期相對的核苷酸。

## DNA 聚合酶

在所有形式的 DNA 複製中，DNA 聚合酶都是必需的一類酶。不過，一個 DNA 聚合酶只能根據模板股，延長已經存在的 DNA 鏈，並不能直接開始合成一條新鏈以起始 DNA 複製。要起始 DNA 複製，必須先合成一小段與模板股配對的，被稱之為引子的 DNA 或者 RNA 鏈。

之後，DNA 聚合酶會通過磷酸二酯鍵的連接，添加與模板股配對的核苷酸，從而向引子股的 3' 端方向合成 DNA。每一個未結合的鹼基都連著三個磷酸基，DNA 合成的能量即來自於其中的兩個磷酸基。（自由的鹼基和與之相連的磷酸基團統稱為三磷酸核苷）當一個核苷酸被添加到正在延長的 DNA 鏈上時，它的兩個磷酸基團將脫落，釋放的能量將會生成一個磷酸二酯鍵把剩下的磷酸基團和 DNA 鏈連接起來。這樣的能量機制也可以用來解釋複製的方向性 —— 如果 DNA 是從 3' 端向 5' 端合成的話，那麼能量就會通過 5' 端提供而不是自由的核苷酸了。

一般來說，DNA 聚合酶是相當精準的，每添加 107 個核苷酸，發生的錯誤不超過一個。即使是這樣，有些 DNA 聚合酶也具有校對的能力，他們可以移除錯配的鹼基。如果 5' 端核苷酸在校正的過程中需要被移除，那麼三磷酸末端就會丟失。因此，用於提供添加新核苷酸的能量來源也就丟失了。

## 預測和實驗

DNA 複製是透過名為半保留複製的機制來得以順利完成的。半保留複製是由沃森與克里克所預測，並且由馬修・梅瑟生（Matthew Meselson）和富蘭克林・史達（Franklin Stahl）於 1958 年進行研究而得以證實。

### 預測

沃森和克里克在提出 DNA 的雙螺旋結構模型時就對 DNA 的複製過程進行了預測。由於 DNA 鹼基對的配對原則，兩條鏈是互補的，因此，雙股中的任意一條鏈都含有完整的遺傳資訊。沃森和克里克推測，在 DNA 複製過程中氫鍵首先斷裂，雙螺旋解旋並被分開，每條鏈分別作為模板各自合成一條新的互補鏈。這樣就產生了兩個與原來 DNA 分子的鹼基順序一樣的新的 DNA 分子。而新 DNA 分子的一條鏈來自親代 DNA 分子，另一條鏈是新合成的，因此，這種複製方式稱為半保留複製。

### 實驗

1958 年，馬修・梅瑟生（Matthew Meselson）和富蘭克林・史達（Franklin Stahl）用同位素標記法和氯化銫密度梯度離心法證明了沃森和克里克的半保留複製模型。這個實驗被稱作梅瑟生–史達實驗。

## 過程

複製可以分為以下幾個階段：

* 起始階段：DNA 解旋酶在局部展開雙螺旋結構的 DNA 分子為單股，引子酶辨認複製起點（起始位點），以解開的一段 DNA 為模板，按照 5' 到 3' 方向合成 RNA 短鏈。形成 RNA 引子。
* DNA 片段的生成：在引子提供了 3'-OH 末端的基礎上，DNA 聚合酶催化 DNA 的兩條鏈同時進行複製過程，由於複製過程只能由 5'→3' 方向合成，因此一條鏈能夠連續合成，另一條鏈分段合成，其中每一段短鏈成為岡崎片段（Okazaki fragments）。
* RNA 引子的水解：當 DNA 合成一定長度後，DNA 聚合酶水解 RNA 引子，補填缺口。
* DNA 連接酶將 DNA 片段連接起來，形成完整的 DNA 分子。最後 DNA 新合成的片段在旋轉酶的幫助下重新形成螺旋狀。

### 起始

細胞分裂一般需要先複製其 DNA。這個過程在 DNA 上的一個特殊位點上開始，這一位點被稱之為複製起點（英語：Origin of Replication, ori）或起始位點，該序列被歸類為共同序列（英語：Consenseus Sequence），因為此處核苷酸序列基本上都相同，相關的解螺旋酶作用於這個位點，DNA 的雙股被分開，複製隨即開始。複製起點包含一段可以被複製啟動蛋白（比如大腸桿菌中的 dnaA 以及酵母菌中的起始點識別複合物）識別的 DNA 序列。這些啟動蛋白吸引其他的蛋白質把 DNA 的雙股打開並開啟複製叉（replication fork）。

啟動蛋白吸引其他相關蛋白組成了前複製複合物，它可以在複製起點打開 DNA 鏈並形成一個泡。複製起點的序列傾向於富含 A-T 鹼基對，這有益於啟動的實現，因為 A-T 鹼基對只有兩條氫鍵相連（C-G 鹼基對有三個），一般來說，這樣的結構使得打開雙股更加容易，因為氫鍵的數量越多則打斷它們需要的能量也越多。

所有已知的 DNA 複製系統在複製開始前都需要一個自由的 3' 羥基。現在已發現四種不同的複製機制。

1. 所有的真核生物、許多 DNA 病毒、噬菌體和質體用引子酶合成一小段包含有一個自由 3' 羥基的 RNA 引子，DNA 聚合酶隨後會順著 3' 羥基延長序列。
2. 反轉錄轉座子（包括反轉錄病毒）在反轉錄酶的輔作用下利用轉移 RNA 為 DNA 的複製延伸提供自由 3′ OH。
3. 在腺病毒和細菌噬菌體 φ29 家族中，DNA 聚合酶將核苷酸添加到基因組附蛋白以合成新鏈，組成基因組附蛋白的胺基酸側鏈提供 3' OH。
4. 在單股 DNA 病毒（包括環狀病毒、雙粒病毒、細小病毒以及其他單股 DNA 病毒）、許多噬菌體和質體中，採用環狀複製機制（RCR）。RCR 內切酶先在基因鏈上（對於單股病毒）或者 DNA 的一條鏈上（對於質體）製造一個缺口。缺口鏈的 5' 端被運送到核酸酶的酪胺酸殘基上，而自由的 3' 羥基端則被用作 DNA 聚合酶複製新鏈的起點。

這些機制中被了解最深入的是真核生物的複製機制。DNA 首先解開螺旋，雙股被打開，RNA 引子與模板鏈結合。特別來說，領先股的活動區域只結合一個 RNA 引子；而延遲股則結合幾個，這幾個 RNA 引子生成的斷斷續續的延遲股稱之為岡崎片段，以其發現者命名。

DNA 聚合酶在合成領先股時是持續合成的，而在延遲股時卻是不連續合成的（這是因為合成的方向性，請參考岡崎片段）。RNA 水解酶（RNase）會水解那些曾用於使 DNA 聚合酶起始複製的 RNA 片段，另一些 DNA 聚合酶會進去缺口並生成 DNA 填補缺口。當這一步完成時，領先股的一個缺口和延遲股的數個缺口都會被填補上。DNA 連接酶將會填補這些缺口，從而完成新 DNA 分子的合成。

古菌、真核生物在這個過程中使用的引子酶，和細菌使用的有所不同。細菌用的引發酶屬於 DnG 蛋白質超家族含有一個 TOPRIM 摺疊型的催化域。TOPRIM 摺疊包含一個 α/β 核心和四條保守鏈，以羅斯曼拓撲結構存在。這種結構同時在許多酶的催化結構域中發現，如拓撲異構酶 I a, 拓撲異構酶 II,OLD 家族核酸酶，與 RecR 蛋白有關的 DNA 修復蛋白。

比較而言，古菌和真核生物中的引發酶含有高度派生的 RNA 識別模式。這種引發酶在結構上和許多參與 DNA 複製與修復的酶相似，如：依賴於 RNA 的 RNA 聚合酶，反轉錄酶，核苷酸生成循環酶，A/B/Y 家族的 DNA 聚合酶。所有這些蛋白質共有一個催化機制：雙向金屬離子介導的核苷酸轉移，其中在第一條鏈末端和 RRM-LIKE 單位的第二條鏈和第三條鏈之間分別附著著兩個酸性核酸殘基，由二價陽離子螯合。

隨著 DNA 合成的繼續，原始 DNA 鏈繼續沿複製泡兩邊解旋，形成具有兩個叉子的複製叉結構。在細菌的環形染色體上只有一個複製起點，複製過程最終形成一個 θ 結構。比較起來，真核生物具有較長的線性染色體，可在多個位點進行複製起始。

### 複製叉

複製叉（replication fork）是細胞核內 DNA 複製時形成的結構。這是由解旋酶創造的，解旋酶用來打斷連接兩條 DNA 鏈的氫鍵。複製叉有兩個由 DNA 單股組成的「叉子」。這兩條打開的單股將會作為領先股和延遲股的模板，領先股和延遲股將會由 DNA 聚合酶按鹼基互補配對原則依照模板鏈合成。模板鏈的資訊可以被嚴格地複製到領先股和延遲股上。

#### 領先股

合成後的領先股（英語：Leading strand）作為新 DNA 的模板鏈，所以複製叉沿 3' 向 5' 移動。從而使新合成的鏈與原始鏈互補，在新鏈沿著 5' 到 3' 合成 DNA，這和複製叉移動的方向相同。

在領先股上，一個聚合酶不斷地「閱讀」被複製的 DNA 並向領先股添加核苷酸。這個聚合酶就是原核生物中的 DNA 聚合酶 Ⅲ（DNA Pol III）；在酵母菌中，推測是聚合酶 ε。在人體細胞中，領先股和延遲股在細胞核中是由聚合酶 α 和聚合酶 δ 合成，在粒線體中由聚合酶 γ 合成。在特殊情況下聚合酶 ε 可以替代聚合酶 δ。

#### 延遲股

延遲股（英語：Lagging strand）是新 DNA 雙股的編碼鏈，所以複製叉沿 5' 向 3' 移動。因為它的方向性和 DNA 聚合酶 Ⅲ 從 3' 到 5' 的工作方向相反，複製過程在延遲股上比領先股更為複雜。

在延遲股上，引子酶「讀」DNA 並添加數小段分開的 RNA 引子。在真核生物中引子酶是聚合酶 α。DNA 聚合酶 Ⅲ 或聚合酶 δ 延長引子片段，形成岡崎片段。之後引子的去除也由聚合酶 α 完成。而在原核細胞中，DNA 聚合酶 Ⅰ（DNA polymerase I）將 RNA 引子去除後再用對應的去氧核糖核苷酸替換。最後 DNA 連接酶再將片段連接起來。

## 相關影片 / 影視作品

* YouTube 上的 DNA replication (DNA 複製機制)
* DNA replication (advanced detail)（頁面存檔備份，存於網際網路檔案館）
* 原核生物 DNA 複製：YouTube 上的 DNA replication in prokaryotic cell 3D animation with subtitle

## 參考文獻