多重退火循环扩增法

**多重退火循環擴增法** (英語：Multiple Annealing and Looping Based Amplification Cycles，縮寫 **MALBAC**) 是一種準線性的全基因組擴增方法。與非線性或指數的傳統 DNA 擴增方法不同（在每個循環中，複製的 DNA 可以作為後續循環的模板），MALBAC 利用特殊引子使擴增子具有互補末端以形成環狀，防止 DNA 被指數複製。這導致僅擴增原始基因組 DNA，因此減少了擴增偏差。 MALBAC「用於鳥槍法生成有重疊、涵蓋大部分基因組的擴增子」。為了進行下一代定序，MALBAC 完成後再進行常規 PCR 進一步擴增。

## 技術平台

在進行 MALBAC 之前，需要通過各種方法分離單個細胞，包括雷射捕獲顯微切割、微流體裝置、流式細胞術或微量移液，然後裂解。MALBAC 單細胞全基因組擴增需要進行 5 個循環地淬滅、延伸、解鏈和成環。

### MALBAC 引子

MALBAC 的主要優點是 DNA 幾乎呈線性擴增。使用專門的引子可以使擴增子形成環，從而防止它們在 MALBAC 的後續循環中進一步擴增。這些引子有 35 個核苷酸長，有 8 個可變核苷酸與模板互補結合，還有 27 個共有核苷酸。共有的核苷酸序列為：GTG AGT GAT GGT TGA GGT AGT GTG GAG。8 個可變核苷酸與單鏈基因組 DNA 分子隨機退火結合。一次延伸後，產生僅在 5' 末端包含共有核苷酸序列的「半擴增子」。半擴增子後面用作另一輪延伸的模板，然後產生全擴增子，即 3' 端與 5' 端序列互補的擴增子。

### 鏈取代

MALBAC 引子具有可變部分，可以隨機結合模板 DNA。這意味著在任何循環的單個片段上，都可能有多個引子與該片段退火結合。DNA 聚合酶，如源自嗜熱脂肪芽孢桿菌的 DNA 聚合酶（Bst 聚合酶），能夠取代遇到的沿同一方向延申的另一條鏈的 5' 末端上游的鏈。

### 錯誤率

_Bst_ DNA 聚合酶的錯誤率為 1/10000 鹼基。

## 實驗工作流程

1. **單細胞分離和裂解** – 從單細胞中分離出的 pg 級基因組 DNA 片段（10 至 100kb）用作模板。
2. **熔解** – 在 94°C 時，雙鏈 DNA 分子會熔解成單鏈形式。
3. **淬滅** – 熔解後，反應立即淬滅至 0°C，並將 MALBAC 引子添加到反應中。
4. **延伸** – _Bst_ DNA 聚合酶（大片段）在 65°C 下將引子延伸 2 分鐘，產生半擴增子。
5. **熔解** – 將反應加熱至 94°C，以將半擴增子與基因組 DNA 模板分離。
6. **淬滅** – 反應在 0°C 下快速淬滅，然後加入相同的聚合酶混合物。MALBAC 引子有效結合半擴增子和基因組 DNA 模板。
7. **延伸** – _Bst_ DNA 聚合酶（大片段）在 65°C 下延伸引子 2 分鐘。在這一步，以半擴增子為模板的擴增為全擴增子，以基因組 DNA 為模板擴增為半擴增子。
8. **熔化** – 將反應加熱至 94°C 以將擴增子與模板分離。
9. **循環** – 對於完整的擴增子，3' 末端序列現在與 5' 末端互補。在 58°C 時，兩端雜交形成環狀 DNA。這可以防止完整的擴增子在隨後的 MALBAC 循環中用作模板。
10. **重複步驟 6-9** – 5 輪的 MALBAC 線性擴增循環。
11. **常規 PCR** – MALBAC 產物通過 PCR 進一步擴增。通過使用 27 個常見核苷酸作為引子，只擴增完整的擴增子。

在 PCR 結束時，pg 級的遺傳物質被放大為 mg 級的 DNA，足以進行 DNA 定序。

## 應用

MALBAC 提供了一種從單個細胞擴增 DNA 的無偏差方法。這種單細胞定序方法具有廣泛的應用，其中許多還有待開發。MALBAC 可用於分析法醫標本、產前遺傳疾病篩查、了解生殖細胞的發育或闡明腫瘤的複雜性。在其基礎上，這項技術允許研究人員通過單個細胞觀察突變累積的頻率。此外，它允許檢測細胞內和細胞之間的染色體異常和基因拷貝數變異（CNV），並進一步幫助檢測導致單核苷酸多態性的不常見突變。

MALBAC 在癌症研究領域有很多應用。它可用於檢查腫瘤內異質性，識別可能賦予侵襲性或轉移性表型的基因，或評估腫瘤產生耐藥性的可能性。MALBAC 的一項開創性應用發表在 2012 年 12 月的《科學》期刊上，描述了使用該技術測量結腸癌細胞系 SW4802 的突變率。通過對三個同源結腸癌細胞與來自不同譜系的無關結腸癌細胞平行的擴增 DNA 進行定序鑑定了 SNP，沒有檢測到假陽性。還觀察到在 SNP 中，嘌呤 - 嘧啶顛換的發生頻率很高。單個結腸癌細胞的拷貝數和單核苷酸變異的特徵突出了腫瘤內存在的異質性。

MALBAC 被用作一種檢查生殖細胞之間遺傳多樣性的方法。通過對來自匿名捐贈者的 99 個人類精子細胞的基因組進行定序，MALBAC 被用於檢查涉及單個配子的基因重組事件，來研究基因重組動態及其對男性不育的意義。此外，在單個精子中，MALBAC 識別出重複或缺失的染色體，以及可能對生育能力產生負面影響的 SNP 或複製數變異。

## 優點

與其他單細胞定序技術相比，MALBAC 取得了許多重大進展，最重要的是它可以報告一個人類細胞 93% 的基因組。該技術的一些優勢包括減少擴增偏差和增加基因組覆蓋率、需要很少的模板 DNA、以及低假陽性和假陰性突變率。

### 減少擴增偏差 增加基因組覆蓋率

MALBAC 擴增後進行全基因組定序，通過使用預擴增的準線性步驟減少了與指數 PCR 擴增相關的偏差。MALBAC 利用 5 個循環的預擴增和包含 27 個核苷酸的共有序列、8 個核苷酸的可變序列的引子來產生擴增的 DNA 片段（擴增子），這些片段會自我成環，防止額外的複製和交叉雜交。MALBAC 期間，這些環不能用作擴增的模板，因此減少了與 PCR 中對 DNA 片段不均勻指數擴增產生的相關擴增偏差。MALBAC 被描述為比其他單次定序方法（例如多重置換擴增，簡稱 MDA）具有更好的擴增均勻性。MDA 以指數方式擴增 DNA，導致了偏差。因此，其他單細胞定序方法相關的擴增偏差導致了基因組的低覆蓋率。與其他單細胞定序方法相比，與 MALBAC 相關的偏差減少，使基因組序列覆蓋率上升。

### 只需要很少的模板 DNA

當只有一個或幾個細胞可用時，MALBAC 可用於擴增 DNA 並隨後對其進行定序，例如用於分析血液中篩選出的腫瘤細胞、產前篩查或法醫樣本。啟動該過程只需要少量起始模板（pg 級的 DNA），因此它是對單個人體細胞進行定序的理想方法。

### 假陽性、假陰性突變發生率低

單細胞定序通常具有很高的假陰性突變率。假陰性突變率是指未檢測到真正突變的概率，這可能是由於等位基因丟失或脫落導致的擴增偏倚造成的。與其他單細胞定序技術相比，MALBAC 的序列覆蓋均勻性增強了 SNP 的檢測並降低了等位基因丟失率。 當雜合子的等位基因無法擴增，導致檢測出「假純合子」時，等位基因丟失率會增加。這可能是由於 DNA 模板濃度低，或者模板擴增不均勻導致雜合子的一個等位基因被複製更多。與等位基因丟失率大約為 65% 的 MDA 相比，MALBAC 要低得多（大約 1%）。與批量定序相比，MDA 有 41% 的 SNP 檢測效率，而 MALBAC 有 76% 的 SNP 檢測效率。 據報導，MALBAC 的假陽性率也很低。 MALBAC 產生的假陽性突變主要是由 DNA 聚合酶在第一個擴增循環中引入的錯誤造成的，並在隨後的循環中進一步複製。通過對源自單個細胞的譜系中的 2-3 個細胞進行定序以驗證 SNP 的存在，以及通過對來自單獨譜系的無關細胞進行定序來消除定序和擴增錯誤，可以消除假陽性。

## 局限

* 由於只需要少量的模板 DNA，操作者或環境對目標 DNA 的污染可能會混淆定序結果。
* 為了完全排除假陽性，有必要將細胞定序結果與從同一譜系內的 2-3 個細胞獲得的結果以及來自不相關譜系的細胞進行比較。
* 用於擴增模板 DNA 的 DNA 聚合酶容易出錯，並且會在 MALBAC 的第一個循環中引入定序錯誤，錯誤在後面的擴增中複製。
* 使用 MALBAC 在單細胞水平上的基因組覆蓋率不如批量定序統一。雖然 MALBAC 提高了單細胞定序的檢測效率，但與批量定序相比，它無法檢測大約三分之一的 SNP。

## 參考資料

## 外部連結

* Search: MALBAC - NCBI database
* Yikon Genomics: Whole Genome Amplification (WGA) and Multiple Annealing and Looping-based Amplification Cycles (MALBAC)