亞硫酸鹽定序

**亞硫酸鹽定序**（英語：bisulfite sequencing）是一種利用亞硫酸鹽處理，測定 DNA 甲基化情形的方法。DNA 甲基化是最早被發現的表觀遺傳標記，也是被研究最為深入的表觀遺傳改變。原理在於亞硫酸鹽可使 DNA 上的胞嘧啶（C）轉變為尿嘧啶（U），同時已受甲基化的 5 - 甲基胞嘧啶則不受影響。如此一來，就可以使實驗者得知 DNA 序列上甲基化的情形 (Figure 2)。 對動物而言，DNA 甲基化主要是指對 **CpG 位點**中**胞嘧啶**的五號碳上增加一個甲基的過程。DNA 位點的甲基化可能對該基因的**轉錄**活性起到抑制作用。

使用亞硫酸鹽處理 DNA 會將胞嘧啶殘基轉化成**尿嘧啶**，但被甲基化的胞嘧啶殘基則不受影響；因此，被亞硫酸鹽處理後的 DNA 片段只保留甲基化的胞嘧啶。基於此原理，亞硫酸鹽能在單個核苷酸水平上揭示 DNA 的甲基化情況。有多種檢測方法可以實現對亞硫酸鹽處理後 DNA 序列的分析，分析的實際問題就是亞硫酸鹽使鹼基從 C 到 U 最終到 T 造成的區別（Figure 1）。

## 方法

亞硫酸鹽定序法是常見的檢測 CpG 位點甲基化情況的方法。其他非測序的檢測 DNA 甲基化策略主要是針對某個位點或全基因組水平的甲基化情況。所有的檢測策略都基於亞硫酸鹽已將全部未甲基化的胞嘧啶轉化為尿嘧啶的前提。理論上說，檢測結果能將一對**等位基因**的甲基化情況分別展示出來。除下文介紹的檢測方法外，還有結合亞硫酸鹽限制測序和甲基化 DNA 免疫沉澱等方法。

檢測亞硫酸鹽處理後 DNA 甲基化情況的手段仍在不斷發展中。檢測方法的研究方向分兩類，區別是是否採用甲基化特異性的 PCR。（Figure  3&4）。以微陣列為基礎的檢測方法使用非甲基化特異性的 PCR。

### 基於非甲基化特異性 PCR 的檢測方法

#### 直接定序

第一個被報導的利用亞硫酸鹽檢測 DNA 甲基化的實例使用的方法。引子被設計成既有 DNA 序列特異性也有亞硫酸鹽特異性（也就是說引子序列中含有非 CpG 位點的胞嘧啶，這樣引子就不能和未經亞硫酸鹽處理的 DNA 片段結合），和需要檢測的甲基化位點臨近但不交叉。這樣設計的引子會同時擴增甲基化和非甲基化的序列（和甲基化特異性 PCR 不同）。PCR 結束後，所有未甲基化的胞嘧啶都被顯示為胸腺嘧啶，而反義鏈的對應位置則是腺嘌呤。直接測序要求 PCR 的克隆產物 prior to 測序（為了獲得足夠的靈敏度），因此這種方法費時費力，且通量較低。巢式 PCR（nested PCR）能提高擴增產物質量。

之後所有的檢測 DNA 甲基化技術都源於 Frommer 等人的成果。儘管有些其他方法都不是真正的測序技術，但「亞硫酸鹽測序」一般被用來指代此類檢測 DNA 甲基化的技術。

#### 焦磷酸測序

焦磷酸測序也是非甲基化特異性 PCR 測序的一種類型。在 PCR 擴增目的片段之後，焦磷酸測序可以檢測出被亞硫酸鹽作用而改變的 CpG 位點。發生了從 C 到 T 轉變的位點可以由 C 和 T 的數量變化推出。該技術的主要問題在於成本較高且無法應用於高通量篩選。

對於此項技術的改進由 wong 等人報導：使用等位基因特異性的引物進行 PCR，可以把單鏈和雙鏈的結果區分開來。這項技術對於基因銘印的檢測非常有效。

#### 甲基化敏感的單鏈構象檢測

這項技術是以單鏈構象多態性檢測（single-strand conformation polymorphism, SSCA）為基礎發展而來。因為序列不同的 DNA 在未變性前會形成不同的二級和三級結構，SSCA 可以將長度相同但序列不同的單鏈 DNA 在不變性的情況下通過凝膠電泳分離。SSCA 對於只有一個核苷酸發生改變的兩條 DNA 鏈的敏感性較低；但在 DNA 甲基化的檢測中，往往有很多個胞嘧啶被轉化成胸腺嘧啶，所以 SSCA 的敏感度接近 100%。同時該檢測手段還能根據 DNA 鏈的結合強度提供 DNA 的甲基化程度。這種方法主要獲得的是某個區域的總體而非某一具體位點的甲基化情況。

#### 高解析度熔解分析

高解析度熔解（high resolution melting， HRM）分析是另一種從序列總體水平分析 DNA 甲基化水平的技術。HRM 分析首先將 PCR 產物用飽和螢光染料充分染色。在對 PCR 的擴增產物逐漸升溫過程中，擴增子逐漸解鏈，隨著雙鏈 DNA 結構逐漸減少，螢光強度也逐漸降低，從而得出樣本的溶解曲線。將溶解曲線和標準曲線對比就可以得到目的片段的甲基化情況。

#### 甲基化敏感的單核苷酸引物擴增

在使用亞硫酸鹽處理 DNA 片段後，設計亞硫酸鹽特異性的引物，使 PCR 反應恰好停止在第一個 CpG 位點的 C 位。由於非甲基化位點已變為 T 而甲基化位點仍是 C，PCR 產物中 C 和 T 的比例可以衡量該位點甲基化與否。

分析 CT 比例有很多方法。最開始使用的是放射標記的 ddNTP，螢光標記和焦磷酸測序也被使用。此外，基質輔助雷射解吸 / 電離（MALDI）高通量分析法、高效液相色譜法（HPLC）等技術也能用於區分引物擴增產物。

#### 鹼基特異性切割 / 基質輔助雷射解吸 - 電離

該技術是由 Ehrich 等人報導的。首先，通過在 PCR 引物中加入 RNA 聚合酶啟動子將目的 DNA 片段轉錄為 RNA 片段。向產物中加入 dTTP 和 dCTP 後，使用 RNase A 切割 C、T 和 U 的 3』端。由於 RNase A 對 dTTP 和 dCTP 沒有切割效果，最後的結果是只有被甲基化的胞嘧啶的 3』端被切割。通過 MALDI 法對切割產物的分析可以得到甲基化的具體位點。這種方法可以用於高通量篩選，具有高效和低成本的優點。

### 甲基化特異性 PCR

甲基化特異性 PCR（methylation-specific PCR, MSP）可以免除對目的片段的測序。 這種 PCR 的引物被設計為只和甲基化的胞嘧啶互補，或者是只和被亞硫酸鹽從胞嘧啶轉化為的胸腺嘧啶互補（「非甲基化」特異性）。由於引物中 CpG 位點的增加能增強檢測的特異性，這種方法對高密度 CpG 位點的區域尤為實用。把 CpG 位點置於引物的 3』端能增強敏感度。一般來說，MSP 和其相關方法被認為是檢測單個位點甲基化敏感度最高的方法，可達到檢測出低至 0.1% 的甲基化比例。

MethyLight 是基於 MSP 的技術，能進行定量測定。該方法使用甲基化特異性引物和甲基化特異性螢光報告探針。如果需要區分相關 CpG 位點，引物或探針則可以低非甲基化特異性的。

還有學者使用改良的 MSP 法分析 DNA 片段 —— 溶解曲線分析法（Mc-MSP）。這種方法同時擴增原序列和亞硫酸鹽處理後的序列，通過對不同峰值的比較得到定量關係。將 mc-MSP 和定量 PCR 結合則可以對低水平的甲基化進行精確測定。

#### 基於微陣列的檢測方法

基於微陣列的檢測方法是對上述各種方法的邏輯延伸，可用於對整個基因組甲基化水平的檢測。DNA 微陣列檢測使用針對目標 CpG 位點的寡核苷酸雜交探針，分別與原序列和亞硫酸鹽處理後的序列互補。探針同樣也是亞硫酸鹽特異性的以避免和反應不完全的 DNA 序列結合。illumina 公司甲基化分析是常用的使基於陣列檢測全基因組甲基化情況的全套手段。

## 局限

### 5 - 羥甲基胞嘧啶

5 - 羥甲基胞嘧啶是一種新的哺乳動物 DNA 鹼基。亞硫酸鹽會把 5 - 羥甲基胞嘧啶轉化為 5 - 甲基磺酸胞嘧啶，而 5 - 甲基磺酸胞嘧啶則在測序中被認為是胞嘧啶。也就是說，通過亞硫酸鹽測序得到的甲基化結果實際上是 5 - 甲基胞嘧啶和 5 - 甲基磺酸胞嘧啶的總和。Chuan He 等人設計的新方法已經可以在單鹼基水平上區分以上兩種胞嘧啶。

轉化反應不完全

亞硫酸鹽測序要求反應必須完全 —— 每一個未被甲基化的胞嘧啶都被轉化為尿嘧啶。如果轉化反應不完全則會導致結果出現假陽性。此外，由於只有在單鏈 DNA 中的胞嘧啶才能被亞硫酸鹽攻擊，DNA 的變性也是至關重要的。對於實驗條件的控制，如溫度和鹽濃度也是是反應完成的重要因素。將 DNA 在瓊脂糖膠中反應可使 DNA 片段互相分離而提高反應質量。

### DNA 的降解

另一個影響測試結果的原因是 DNA 在反應過程中被降解。那些使轉化反應完全的必要條件，如長時間孵育、提高溫度和高亞硫酸鹽濃度，會導致多達 90% 的 DNA 被降解。由於反應起始時的 DNA 總量不多，這種降解會影響到最終的檢測。降解會導致 DNA 脫嘌呤，形成隨機的斷裂。因此，PCR 的擴增序列越長，完整模板分子的期望就越低。這可能導致 PCR 擴增失敗或者因 DNA 樣本數太少而失去數量的準確性。因此，在設計測序實驗過程中要考慮反應條件對 DNA 降解的影響。一些技術能降低 DNA 的降解，如設置孵育溫度循環。

### 其他問題

一個潛在的問題是由於鹼性不夠導致的嘧啶脫磺酸基不完全。這可能會抑制某些 DNA 聚合酶，最終導致 PCR 產物合成困難。這種現象可以通過調整反映環境的 PH 值來避免。

最後一個問題是亞硫酸鹽處理會大大降低樣本的複雜性，這在多個 PCR 反應同時進行時會導致問題：引物設計更加困難，錯誤的雜交頻率也會提高。

## 應用：全基因組甲基化檢測（WGBS）

亞硫酸鹽測序正在取代限制性標記基因組掃描，成為檢測全基因組甲基化情況的主流技術。人類的表觀基因組正在逐步完善中。表觀基因組的信息對於基因序列的應用和調控功能的理解十分重要。

表觀基因組的穩定性比基因組低，因此對它的了解也更困難。一個個體的表觀基因組和年齡、組織相關，被環境所調控，在疾病發生時會出現異常。對於表觀基因組的研究可以對正常表觀遺傳和疾病相關的改變做出深入了解。

表觀基因組圖譜研究的直接好處之一就是克隆技術的提高。諸多研究表明，對正常的生物進行克隆失敗的原因是表觀遺傳信息的錯誤。基因的甲基化異常在多種腫瘤中存在。全基因組的低甲基化會導致基因組的不穩定，而局部的抑癌基因啟動子高甲基化則會導致基因失活。特定位點的甲基化對腫瘤的診斷和治療有指導作用。

大規模的表觀遺傳圖譜繪製已在全球展開。由於亞硫酸鹽全基因組測序費用高昂，它只應用於小部分高精確度的測序中，其他更粗略的分析法則應用較為廣泛。

## 外部連結

* http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC38513/ （頁面存檔備份，存於網際網路檔案館） - PNAS
* http://www.epigenome.org/ （頁面存檔備份，存於網際網路檔案館） - Human Epigenome Project
* https://web.archive.org/web/20070124172616/http://www.sanger.ac.uk/PostGenomics/epigenome/ - Sanger Institute
* https://web.archive.org/web/20070929211948/http://www.methylogix.com/genetics/protocols.shtml.htm - Bisulfite Sequencing Protocols

## 參考文獻