Real-time_RT-PCR

**即時聚合酶連鎖反應**（英語：**R**eal-**t**ime **p**olymerase **c**hain **r**eaction）是一種在 DNA 擴增反應中，以螢光染劑偵測每次聚合酶鏈鎖反應（PCR）循環後產物總量的方法。

此實驗法已被眾多科學家採用，因為其偵測範圍廣、靈敏度高、準確、專一及快速。PCR 的發展因為偵測感染病患的病毒（不過 RNA 病毒須先反轉錄成 DNA 才進行 PCR）或細菌量、癌症監測、診斷個別基因差異的用藥反應等應用而大幅提高。

PCR 的方法是基於偵測目標物在反應前及 PCR 後產物的量化關係，越早探測到指定螢光值表示目標基因組越多。相對於終端 PCR 方式（end-point PCR，傳統的 PCR 配合凝膠電泳，在反應後偵測），qPCR（定量即時聚合酶連鎖反應）有許多優點。其結果可以較快取得且穩定，因為是採用非常敏感的化學螢光，而且不需要再繼續處理 PCR 反應後的偵測，花費時間與精神的工作步驟便可以省下。此外，因為反應後不需打開管子而減少了操作污染。qPCR 分析亦適於更具挑戰性的應用，如多重偵測與高通量分析。

## 染劑

使用於 PCR 偵測的化學物基本可分為兩類：非專一性化學物，通常是與 DNA 結合的螢光染劑；目標專一性化學物，是使用螢光探針或引子。

* 非專一性偵測：SybrGreen （頁面存檔備份，存於網際網路檔案館）、HRM (High Resolution Melt) （頁面存檔備份，存於網際網路檔案館）
* 目標專一性偵測：TaqMan probe （頁面存檔備份，存於網際網路檔案館）、Molecular Beacon （頁面存檔備份，存於網際網路檔案館）、LightUp、FRET （頁面存檔備份，存於網際網路檔案館）(Fluorescence Resonance Energy Transfer)
  * TaqMan probe 是選取 PCR 上下游引子之間的一段序列作為探針，並在探針的 5`- 端標記上螢光基團，3`- 端標記上相應的淬滅基團 (由於兩個基團靠得很近，構成螢光能量傳遞的關係，沒有螢光信號產生，在每一個循環的黏合 (annealing （頁面存檔備份，存於網際網路檔案館）) 過程中，該探針可以與模板相結合，隨後的延伸反應中，當引子合成至探針與模板結合處時，Taq 酶的 5`- 外切酶活性可以降解探針的 5`- 端，並因此使螢光基團與淬滅基團分離，釋放螢光，理論上每合成一次新鏈就有一次螢光信號釋放)。
  * Molecular Beacon 是探針片段在游離狀態下呈莖環 (stem-loop) 結構，其中莖的部分一般是 5 至 7 個高 GC 含量的核苷酸，環的部分是 15 至 30 個可以與 PCR 模板互補的核苷酸序列，而且探針的 5`- 端和 3`- 端分別標記有螢光報告基團和淬滅基團 (由於這兩個基團處於莖的結構中，靠得很近，沒有螢光信號產生，在 PCR 每一個循環的變性過程中，處於莖環結構的探針被打開，並在黏合過程中與模板結合，使螢光基團遠離淬滅基團並釋放螢光信號，因而螢光強度與被擴增的模板量成正比)。

## 儀器

* 光源：氙氣燈、雷射、發光二極體（LED）
* 濾鏡
* 偵測方式：光電倍增管（photomultiplier tube, PMT）、光電耦合元件（charge-coupled device, CCD）、光電二極體（photodiodes）
* 控溫方式：熱電效應元件（peltier elements）、旋轉式氣流升降溫、微流體式
* 容器：聚丙烯（PP）容器、玻璃毛細管

## 資料分析

* 門檻循環（MIQE 中定義為 Cq 值 (quantification cycle)；過去通稱為 Ct, Threshold cycle，Ct 值，又稱閾值循環數）
* 解離曲線分析（melting curve）
* 高解析度解離分析（High Resolution Melt, HRM）
* FRET 分析

## 應用

PCR 的一些應用包括：

1. 基因表現分析：例如結核分岔桿菌（Mycobacterium tuberculosis）是一種生長相當緩慢的細菌，傳統培養及鑑定一般需要花數週時間，但 2015 年時 Watanabe Pinhata 和 Cergole-Novella 以自己發展的 real time PCR 檢測 mpt64，直接檢測病人痰液中的結核分岔桿菌，分析 715 個檢體 657 個病人，其檢測靈敏度（sensitivity）及特異性（specificity）分別為 90.3% 及 98.6%，而傳統培養方法的靈敏度及特異性分別為 90.3% 及 99.7%。整個實驗流程可以在 5 個小時內完成，此方法可以用於沒有套裝試劑（kit）可以使用的實驗室。

2. 檢驗生物晶片的結果、

3.siRNA 與 miRNA 診斷、

4. 基因型鑑定

5. 飲食分析

6. 獸醫微生物檢測

## 實驗比較

### qPCR 的特點

* 螢光實時定量 PCR 的基本原理有兩個要點：首先是對 PCR 反應中的每一個循環的反應產物進行實時檢測並記錄下來；其次，用於檢測 PCR 產物實時檢測的螢光染料標記在一段可以與單鏈 PCR 產物 (模板) 特異性雜交的探針上，並且處於淬滅狀態，只有當探針與模板特異性結合以後才有可能釋放出螢光信號。
* 每一輪循環中 PCR 的產出量都以螢光信號的形式被 PCR 儀的光學檢測系統記錄下來，在某一循環中螢光信號的強度達到預先設定的閾值時，此時的循環數稱為 CT (Threshold Cycle)，Ct 值與起始的模板量成反比，起始的核酸量越多，達到閾值的循環數就越少，換句話說 CT 值會越小。如果要確定量的話，需要做出標準曲線，以 Ct 值為縱坐標，起始模板數為橫坐標作圖。在新的 MIQE 規範中 Ct 這個慣用的名詞被重新定義為 Cq 值 (quantification cycle)。

### 和 PCR 比較

* 常規 PCR 的產物在理論上呈指數級增長，而在實際反應中，由於反應物濃度、酶活性等條件的變化，在循環數不斷增加時，反應進入平台期，PCR 產物不再呈指數級增長。螢光實時定量 PCR 的優點在於它避免了常規 PCR 的平台效應對起始模板量和最終產物量之間相關性的干擾。
* 專一性探針的優點是只有正確的擴增產物才能和用於定量的探針結合併產生螢光信號，這樣就避免了假陽性污染，對於臨床診斷等工作特別有效。但相對來說，合成螢光探針的價格較於昂貴，不利於小規模的實驗檢測；因此在研究型實驗室還是以 SYBR Green 的非專一型 qPCR 為主要選擇。

### 普及性

* 因為價格、耗材較貴的因素，qPCR 多了光學配件及螢光物質的費用，在普及度上 qPCR 的機器較 PCR 機台少。

## 參考文獻

## 參考文獻

## 外部連結

* The Reference in qPCR - Academic & Industrial Information Platform（頁面存檔備份，存於網際網路檔案館）
* MIQE: The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments
* RDML: Real-time PCR Data Markup Language （頁面存檔備份，存於網際網路檔案館）
* 實時定量 PCR 中參照基因的選擇