DNAシークエンシング
現在主流となっているのは、塩基依存的にDNA断片を作製し、その長さを比べることで塩基の順序を知る方法である。例えば4種類の塩基に対応してサンプルを1回ずつ切断した結果、右表のような長さの断片ができたとする。この場合、断片長が短い方から並べ直したGTCTGAAACATGATTが、元々のDNAの塩基配列だったということになる。この方法では、どのように「塩基依存的」なDNA断片を作製するかという反応の部分と、どうやってその長さを調べるかという検出の部分に鍵がある。
例: 元の配列 GTCTGAAACATGATT
アデニン(A)で切断した場合 [06] GTCTGA <-> AACATGATT [07] GTCTGAA <-> ACATGATT [08] GTCTGAAA <-> CATGATT [10] GTCTGAAACA <-> TGATT [13] GTCTGAAACATGA <-> TT
グアニン(G)で切断した場合 [01] G <-> TCTGAAACATGATT [05] GTCTG <-> AAACATGATT [12] GTCTGAAACATG <-> ATT
一方、ターミネーターを蛍光標識する方法をダイターミネーター法(dye-terminator)と呼び、こちらが現在の主流となっている。この方法では4種類のターミネーターがそれぞれ異なる蛍光色素で標識されているため、1つの系に4種類のターミネーターを加えて反応を行い、それをそのまま泳動するだけで済む。プライマーを標識する必要がないため、サブクローニングせずに新しくプライマーを設計して続きの配列を読むこと(プライマーウォーキング法)もより安価にできる。逆にダイターミネーター法の欠点としてシグナル強度が不揃いになりやすく、ダイプライマー法と比べて一度に読める配列が短くなる傾向が挙げられる。ダイターミネーターには大きな蛍光発色団がついているため、通常のジデオキシヌクレオチドと比べてDNAへの取り込み効率が鋳型配列によって変化しやすいためである。かつてはダイターミネーターはダイプライマーの半分程度の長さしか読めないとされていた。しかしこれはDNAポリメラーゼと標識色素の改良によって大きく改善され、現在では1,000塩基程度とダイプライマー法と比べても遜色のない性能になっている。
プリン塩基(グアニン・アデニン)をメチル化する。ここでメチル化されたプリン塩基のグリコシド結合は不安定で塩基が遊離しやすく、その後アルカリ条件で加熱することでリン酸ジエステル結合が切断される。グアニンはアデニンと比べて5倍速くメチル化される一方、グリコシド結合はグアニンよりアデニンの方が不安定である。そこで塩基を遊離させるときに、強い条件(高温中性)にするとグアニン塩基で切断されやすく、弱い条件(低温酸性)にするとアデニン塩基で切断されやすい。この2つの反応産物を見比べることでグアニンとアデニンを判別する。