アレッサンドロ・デ・メディチ
亡命したイッポーリトら反対派は皇帝への直訴を計画、1535年のイッポーリト急死(アレッサンドロによる毒殺とも)にもひるまなかった反対派により皇帝へ暴政を訴えられる危機に遭遇したが、グイチャルディーニら側近がアレッサンドロを弁護、皇帝がアレッサンドロ支持に回ったため事なきを得た。
1536年1月18日にはカール5世の庶出の娘であるマルゲリータ・ダズブルゴと結婚、4月にフィレンツェへ入城した皇帝へ一旦市門の鍵を渡し、改めて皇帝から鍵を受け取った。これはフィレンツェ公の権威が皇帝から与えられたこと、外国によるフィレンツェの支配を象徴していた。更にアレッサンドロに嫡子が無いまま死去した場合は皇帝がフィレンツェ・ピサ・リヴォルノの所有権を得るという協定も結び、フィレンツェの自立が脅かされていった。
1537年1月5日夜、アレッサンドロはメディチ家の同族ロレンツィーノ・デ・メディチ(ロレンザッチョ)によって暗殺された。事件はアレッサンドロが悪友だったロレンザッチョに彼の従姉である人妻との逢引をそそのかされ、寝室で待機していた所を殺し屋を連れたロレンザッチョに殺されたという状況だった(暗殺の動機は不明)。死後、グイチャルディーニら政治顧問たちが後継者について協議、フィレンツェ公には黒隊長ことジョヴァンニ・デ・メディチの子コジモ1世が後継者として選ばれた。