アルティメット・スパイダーマン
声 - / 英:エリック・バウザ(「スワーム」)、ドレイク・ベル(第50話「帰ってきたサンドマン」)
第37話「スワーム」にて初登場した、元スターク・インダストリーズ社員。粒子レベルで人間の身体と機械を融合させる研究を行っていた。自身の研究に大きな自信を抱いていたが、その研究が周囲へ甚大な被害を与えていたことを理解できなかったため解雇された。その際、身体を粒子化して社内にとどまり、その場にいたスパイダーマンが作った追跡装置を乗っ取り、虫型ロボットの大群へと変化して、自分の研究を認めなかったアイアンマンへの復讐を実行に移した。追跡装置の原作者であるスパイダーマンが装置へアクセスできるようになっていたのが弱点となり、アイアンマンの手助けを受けたスパイダーマンにより装置を初期化され、装置から追い出された。
その後はS.H.I.E.L.D.に収容されていたが、第79話「ヒドラの攻撃パート1」で連行されたドクター・オクトパスが密かに放った小型ロボットにより暴走し、アーニム・ゾラに利用された。
シリーズを通じて容姿が変わっており、第3シーズン(シーズン3)までは髪を伸ばしていたが、第4シーズン(シーズン4)の第79話「ヒドラの攻撃パート1」でスウォームを利用した結果、スキンヘッドに近い髪形になったが、第93話、第94話、第95話(第91話、第92話、第93話)「カーネイジの脅威」でカーネイジと分離した結果、元の容姿に戻った。その後、第101話(第100話)「スパイダースレイヤーズ パート2」でヒドラアイランドに乗り込んださいに盗まれた自身の技術を取り込みパワーアップを果たし、原作に近い容姿に変わった。
同シリーズ第62話、第63話、第64話、第65話(第61話、第62話、第63話、第64話)「異世界のスパイダーマン、再び」では様々な世界のドク・オックが登場。様々な立場でスパイダーマンとアラクニッドに敵対する。
なお、ドクター・オクトパスという名前は本名の「オクタビアス」をもじってピーターが命名したもので(略して「ドック・オク」あるいは「ドク・オック」)、本人はオクトパスと呼ばれているのを嫌がっている。 タコロボット ドクター・オクトパスが操る4本足のタコ型ロボット。 オクトパス・アイランド
第18話「レッキング・クルーとの戦い」にて初登場した犯罪者4人組。アスガルド由来の魔力を秘めた道具によって超人的なパワーを発揮する。
声 - 宮本淳 / 英:ベンジャミン・ディスキン
第4シリーズに登場。バンパイアが支配する世界でバンパイアと戦うスパイダーマン。彼のウェブシューターには対バンパイア用の針射出機能がついている。
声 - 倉富亮 / 英:グレッグ・サイプス
ピーター・パーカーの級友の一人で、ヒーローチームの一人。穏やかな人物だが、カンフーの達人でもある。
御曹司という地位を捨て秘境都市クン・ルンで修行を積み、シャオラオを倒して鋼鉄の拳を手に入れた。
第56話「クローク・アンド・ダガー」においてダガーの浄化力でパワーアップし、原作寄りのコスチュームにチェンジした。
声 - 小林優子 / 英:グレイ・デリスル
博物館にあった鎧に封じられていた魔女。
声 - / 英:ディー・ブラッドリー・ベイカー
第75話、第76話、第77話、第78話「真のチャンピオン決定戦」1回戦に登場。スパイダーマンに倒される。
第3シーズン(シーズン3)はオープニング映像のみ放送された(Dlifeでは第3シーズン(シーズン3)の第14話から第25話までオープニング映像とヒーロー紹介と次回予告放送された。さらにDlifeでも第4シーズン(シーズン4)のオープニング映像とヒーロー紹介と次回予告放送される)。
Dlifeでも2016年11月5日から2017年4月29日まで第4シーズン(シーズン4)を毎週放送。テレビ東京より215日遅れで放送。
Dlifeでは第25話(第4シーズン(シーズン4))と第26話は2017年4月22日と2017年4月29日にディズニーXDより先行放送。
また、第3シーズン(シーズン3)は『アルティメット・スパイダーマン ウェブ・ウォーリアーズ』という表題で2015年4月7日からテレビ東京系6局ネットでも放送が開始され、それに合わせてニコニコ動画での配信も開始された。テレビ東京で放送する際、落合隼亮のナレーションが入ったオープニング映像が追加され、エンディングでヒーローの紹介が行われている(ただし、第26話((シーズン3))では、落合隼亮のナレーションが入ったオープニング映像が追加されず、落合隼亮のナレーションが入ったエンディングのみのヒーローの紹介が行われている)。
日本のディズニーXDよりの遅れ日数、第1話から第4話までは7ヶ月遅れ、第5話から第8話までは6ヶ月遅れ、第9話から第13話までは2ヶ月遅れで放送した。
2015年7月7日から8月4日まではテレビ東京系で第14話(第3シーズン(シーズン3))から第18話までアメリカ合衆国のディズニーXDと同時に放送された(日本のディズニーXDより日本最速放送された)。
声 - 烏丸祐一 / 英:トム・ケニー
第58話「バルチャー」にて初登場。ドクター・オクトパスによってハゲタカの遺伝子を組み込まれた青年で、興奮すると鳥人になり、飛行能力と口から強力な破壊力を持つ超音波を発する。悪人ではないが、改造前の失われた記憶を持たないため、自身を改造したオクトパスを恨み、自身の過去のデータを知っているグリーンゴブリンに従っている。
その後、ドックオックに意思を奪われ、ドックオックの手駒となる。
最終話である第104話「卒業の日」では中和剤を投与されたことにより元に戻った。
声 - / 英:フィル・ラマール
ダークディメンションの王。クロークらを洗脳して地球征服を企てた。
演出 - 鍛治谷功
翻訳 - 石山祐子、瀬尾友子
録音制作 - HALF H・P STUDIO
制作 - ウォルト・ディズニー・ジャパン
声 - 志村知幸 / 英:クリストファー・ダニエル・バーンズ
ピーターの古くからの敵。当初は原作どおりのコスチュームで発電能力を持つだけの小悪党だったが、あるとき大型ヴィジョンとクモ糸スタンガン(命名:ピーター)の影響で肉体そのものが電気と化した「エレクトロVer2.0」になり、電気を利用する全てのものを乗っ取るも、電気を使いすぎて元のエレクトロに戻り、倒された。
シニスター・シックスとしてはVer.2.0で戦ったが、Ver.2.0は全身が電気でできているため、ドクター・オクトパスのラボが水浸しになった際に一時的にショートした。ピーターによれば、また、それを聞いたエレクトロ本人によれば、口に電球を入れると明かりがつく。
第62話、第63話、第64話、第65話(第61話、第62話、第63話、第64話)「異次元のスパイダーマン」ではグリーンゴブリンに脅されて次元移動装置の電源にされた。装置からの解放を条件にスパイダーマンの要請を受け、グリーンゴブリンのパワーを奪い取った。その後、放置されていたヘリキャリアのシステムをのっとって巨大ロボットに仕立て、ニューヨークで暴れまわったが、クモ糸スタンガンの絶縁機能で電気を防いだスパイダーマンにより、アースに触れさせられ敗北した。
声 - 山本兼平 / 英:クラーク・グレッグ
S.H.I.E.L.D.のエージェント。ピーター・パーカーの通う高校の校長代理として、校内でのヒーローチームを監督している。何の説明もなく途中から登場しなくなった。
メイとは良い関係を築いている模様。
声 - 安井邦彦 / 英:スティーヴン・ウェバー
ハリーの父で、ドクター・オクトパスを傘下に置いて悪事を働いていた。一時はアンドロイドドラゴンマン(英語版)を多数動員して、ブラックスパイダーマンであるハリーのヒーロー活動を演出していた。
第25話「衝撃の事実」では、かねてより恨まれていたオクトパスにヴェノムとスパイダーマンの血の混合物を注入され、グリーンゴブリンという怪物に変貌した。グリーンゴブリンに変異した後、息子に会いに行くとして彼の高校を訪れた後、S.H.I.E.L.Dの戦闘機をのっとってヘリキャリアに殴りこんだ。一時はスパイダーマンらに追い詰められたものの、彼が殺すのを躊躇い、逃亡を許す結果となった。
その後、一時は元の姿に戻り、罪滅ぼしのためにアイアンマンによく似たアーマーを着用して「アイアンパトリオット」と名乗ってヒーロー活動をしていたが、アーマーを着用してパワーアップしたシニスターシックスとの戦いでドクター・オクトパスに再び薬物を投与され、グリーンゴブリンに戻ってしまう。
第62話、第63話、第64話、第65話(第61話、第62話、第63話、第64話)「異次元のスパイダーマン PART1-4」ではあらゆる次元のスパイダーマンのDNAを採取し、元の世界に戻って自らに投与してパワーアップした。