タンパク質工学
自然界のダーウィン進化は、触媒作用を含む様々な用途のためにタンパク質の特性を調整するために、研究室内で効果的に模倣することができる。大規模で多様なタンパク質ライブラリーを作成し、フォールディングされた機能的な変異体をスクリーニングまたは選択するために、多くの実験技術が存在する。フォールディングされたタンパク質は、ランダムな配列空間において驚くほど頻繁に出現し、この現象を利用して選択的な結合剤や触媒を進化させることができる。深い配列空間から直接選択するよりも保守的ではあるが、ランダムな変異誘発と選択・スクリーニングによって既存のタンパク質を再設計することは、既存の特性を最適化したり変更したりするための特に強固な方法である。また、より野心的な工学的目標を達成するための優れた出発点でもある。実験的進化と最新の計算機的手法の組み合わせは、自然界に存在しない機能的な高分子を生み出すための、最も広範で実りある戦略であると思われる。
高品質な変異ライブラリーを設計するための主な課題は、近年大きな進展を見せている。この進歩は、タンパク質の形質に対する変異負荷の影響について、よりよく説明できるようになったという形で表れている。また、計算機によるアプローチでは、数え切れないほど大きな配列空間を、より管理しやすいスクリーニング可能なサイズにすることで、スマートな変異体ライブラリーを作成することに大きな進歩があった。
配列飽和変異導入法では、標的配列がすべてのヌクレオチド位置でランダム化される。この方法は、まず、3'末端に鋳型転写酵素を使用することにより、普遍的な塩基を持つ可変長のDNA断片を生成することから始まる。次に、これらの断片を一本鎖の鋳型を用いて全長まで伸ばす。万能塩基はランダムな標準塩基に置換され、変異を導入する。この方法には、SeSAM-Tv-II、SeSAM-Tv+、SeSAM-IIIなど、いくつかの改良版が存在する。
この方法では、制限部位の外側を切断する2型制限酵素を用いることで、少なくとも9種類の断片をアクセプターベクターに組み換えることができる。まず、断片を別々のベクターにサブクローニングし、両側にBsa1フランキング配列を作成する。次に、これらのベクターをII型制限酵素Bsa1で切断し、4ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを生成させる。相補的なオーバーハングを持つ断片はハイブリダイズされ、T4 DNAリガーゼを用いてライゲーションされる。最後に、これらのコンストラクトは大腸菌に形質転換され、発現レベルのスクリーニングが行われる。
合理的設計では、科学者がタンパク質の構造と機能に関する詳細な知識を用いて、所望の変更を加えることができる。一般に、部位特異的変異導入法が発達しているため、安価で技術的に容易であるという利点がある。しかし、タンパク質の詳細な構造情報が得られないことが多く、また、得られたとしても、構造情報はタンパク質の構造を静的に示すことが多いため、様々な変異の効果を予測することが非常に難しいという大きな欠点がある。しかし、Folding@homeやFolditのようなプログラムは、タンパク質の折り畳みモチーフを知るためにクラウドソーシング技術を利用している。
計算タンパク質設計アルゴリズムは、あらかじめ指定された標的構造に折り畳まれたときに低エネルギーである新規アミノ酸配列を同定することを目的としている。探索すべき配列-構造空間は広いが、計算タンパク質設計の最も困難な要件は、最適な配列と類似の最適でない配列を区別できる、高速かつ正確なエネルギー関数である。
この方法では、任意の長さの塩基の塊を同時に削除・挿入することで、配列の長さを変化させることができる。この方法では、新しい制限部位、特定のコドン、非天然アミノ酸の4塩基コドンの導入により、新しい機能性を持つタンパク質を作り出すことができることが示されている。
この方法では、キメラ遺伝子1個あたり平均14回のクロスオーバーでキメラ遺伝子ライブラリーを作成できることが確認されている。まず、親株のトップストランドの断片を、相同遺伝子のウラシルを含むテンプレートのボトムストランドにアライメントする。Pfuおよびtaq DNAポリメラーゼのエキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼ活性により、5'および3'オーバーハングフラップが切断され、ギャップが埋められる。その後、ウラシルを含む鋳型をウラシルDNAグルコシラーゼで処理することによりヘテロ二重鎖から除去し、さらにPCRを用いて増幅させる。この方法は、比較的高いクロスオーバー頻度でキメラを生成することができるため、有利である。しかし、一本鎖DNAやウラシル含有一本鎖鋳型DNAの作製が必要であり、複雑であるため、やや制限がある。
これらの方法は、構造に関するデータベース情報を利用して、作成されたタンパク質配列に相同な構造をマッチングさせるものである。これらの相同構造をスコアリングと最適化によりコンパクトな構造に組み上げ、ポテンシャルエネルギーが最も低くなることを目標とする。フラグメント情報のウェブサーバとしては、I-TASSER、ROSETTA、ROSETTA@home、FRAGFOLD、CABS fold、PROFESY、CREF、QUARK、UNDERTAKER、HMM、ANGLOR:72がある。
酵母で行われるクローニングでは、断片化した発現ベクターをPCRによって再集結する。この再構築されたベクターは、酵母に導入され、クローニングされる。酵母を使ってベクターをクローニングすることで、大腸菌でのライゲーションや増殖で生じる毒性や逆選択を回避することができる。