カール5世 (神聖ローマ皇帝)
1526年3月10日にセビリアの王宮で、ポルトガルの先王マヌエル1世の王女で、互いに母方の従兄妹であるイサベル(イザベル、イザベラ)と結婚した。前年の1525年にイサベルの兄ジョアン3世とカール5世の妹カタリナが結婚するという二重結婚であった。また、カール5世の姉レオノールは1518年にマヌエル1世の3番目の王妃となったが、マヌエル1世とは1521年に死別していた。
イサベルとの間には3男2女が生まれた。うち男子2人は夭逝した。
フェリペ2世(1527年 - 1598年) - スペイン王及びポルトガル王
マリア(1528年 - 1603年) - 神聖ローマ皇帝マクシミリアン2世の皇后
フェルナンド(1530年)
フアナ(1535年 - 1573年) - ポルトガル王ジョアン3世の子ジョアン・マヌエル王太子の妃、セバスティアン1世の母
フアン(1539年)
人の良い性格であったため、貴族身分の母から庶子が生まれれば認知し、商人・工人身分の母から子が生まれれば修道院などへ入れた。うち有名なのは、ヨハンナ・ファン・デル・ヘインストが儲けたマルガリータ(1522年 - 1586年)と、バルバラ・ブロムベルクが儲けたレパント海戦の英雄ドン・フアン・デ・アウストリア(1547年 - 1578年)である。事跡の不明な子女としては、祖父フェルナンド2世の後妻ジェルメーヌ・ド・フォワが儲けた女子イサベル (es) と夭折した子、オルソリーナ・デッラ・ペンナが儲けた女子タデア、母不詳の女子フアナ、などが知られている。