DNA複製
詳細は「ヘリカーゼ」を参照 親鎖の二重らせんをほどくことで、複製フォークを進行させる巻き戻し酵素。
原核細胞のゲノムは単一のレプリコンである。DNA複製は常に唯一の複製起点から、細胞周期の中ただ一度だけ実行される。この仕組みを単コピー型と呼ぶ。ただし、真正細菌の中にはコレラ菌のように複数の環状染色体を持つものや、ボレリア菌のように複数の線状染色体をもつものも存在する。原核細胞にはゲノムDNAだけでなく、自律的に増殖する染色体外DNAたるプラスミドも存在する場合が多い。こちらは染色体同様に単コピー型制御の場合もあれば、それとは異なる多コピー型制御を受ける場合もある。多コピー型の制御下では一回の細胞周期中にプラスミド複製が繰り返され、細胞中に複数のコピー体が存在することになる。
大腸菌と枯草菌の場合、DNA複製を終わらせるter配列に独特で面白い性質がみられる。両方向にほぼ同じ速さで進む2つの複製フォークは複製起点oriC から半周した位置に出会う。この遭遇点から約100kbにわたり、2か所の終了領域がある。大腸菌において一方はterE, D, Aが、他方はterC, A が集まっている領域。枯草菌ではterI とterII およびこのほかの2, 3の部位である。各領域は終了させる複製フォークの方向が特異的に決まっている。独特なのは、複製フォークが対応するter配列まで行くのに、他方に対応している終了領域を通り過ぎることである。この配置は複製フォークの待ち伏せを起こす。
葉緑体のDNA複製が行われると、葉緑体で合成されているMg-プロトポルフィリンIXが葉緑体外に放出されて細胞質に蓄積し、サイクリン1 (cyclin 1) の細胞内濃度を増大させる。サイクリン1がCDKAと結合すると、CDKAを活性化させる。
S期以外の細胞周期においてサイクリン1はポリユビキチン化され、ポリユビキチン化したタンパク質を標的とするプロテオソームによりサイクリン1が分解されている。サイクリン1のポリユビキチン化を行う酵素(ユビキチンリガーゼ)はSCF複合体であるとされている。SCF複合体はSkp1、Cullin 1、Fボックスタンパク質から構成され、標的の認識はFボックスタンパク質が行う。C. merolaeにおける典型的なFボックスタンパク質はFbx1~4の4種類があるが、サイクリン1を認識するFボックスタンパク質はFbx3である。Mg-プロトポルフィリンIXはFbx3との結合能を有しており、Mg-プロトポルフィリンIXがFbx3と結合することによりサイクリン1の結合を競合阻害すると考えられている。
伸長段階の始まりは前段階におけるDNAクランプとDnaBのプレプライミング複合体への結合を引き金とする。これらの相互作用はDnaAオリゴマー内でATP加水分解を起こす。すると、オリゴマーは分離するのでその複製起点からもう一度DNA複製が起こるのは防がれる。
真正細菌についての遺伝学的研究は大腸菌で際立って進んでいる。そこで、大腸菌において実際に伸長段階を担う複製装置であるレプリソームについて第一項で解説する。大腸菌ではDNA複製はまずリーディング複製から始まる。1000〜2000 ntが合成されてから次いで最初のラギング鎖合成へと続く。#伸長で前述したようにラギング鎖合成はリーディング鎖に比べ複雑である。その機構の精妙で興味深い特徴が大腸菌で発見された。トロンボーンモデルと名付けられたそれは第二項で紹介する。
ゲノムが直鎖状DNAである真核生物では、DNAポリメラーゼによって親鎖の3'側の最末端領域を複製できない。末端複製問題と呼ばれるこの問題は、DNAポリメラーゼが事前に用意されたプライマーの3'末端からしかでデオキシヌクレオチドの重合ができないために起こる(詳しくは#伸長)。すなわち、プライマーを置くためのスペースが3'側にないため、このままでは娘鎖は親鎖よりも短くなってしまう。
末端複製問題は次の3つの段階を経て解決する。合成が終わり、プライマーが除去された後、真核生物の新生DNAの娘鎖は5‘末端が欠けている。テロメラーゼという酵素がまず、親鎖の3’末端を鋳型鎖なしに伸長させる。次に、本来よりも長くなった3‘末端にプライマーは置かれ、DNAポリメラーゼが複製する。ここでもやはり短く複製されるが、娘鎖は本来の長さになる。
さらに、DNAを伸びた状態にする効果もあるので、後述する娘鎖合成やプライマー合成の鋳型になりやすい。こうして、巻き戻し(と後述する超らせんの解消)を経て生まれる部分的な1本鎖DNAの領域が複製バブル、二重らせんとの分岐点が複製フォークである。
複製起点に続いての水素結合の切断は、酵素であるDNAヘリカーゼが担う。複製起点では親鎖の巻き戻しと同時に、それぞれの親1本鎖で複製装置による娘鎖の合成が始まる。DNAヘリカーゼによりさらに親鎖が巻き戻ると、これと同時にほどけた親鎖に沿って複製が進行する。実際、複製は巻き戻しと同じ速度で、どんな場合でも、ほどけている親鎖で伸長中の娘鎖と対になっていない部分や複製途中の部分はごく短い。このことは、巻き戻しが伸長段階と強力に共役していることを表す。
場合によって、1つの複製バブルにおける2つの複製フォークのうち、DNAへリカーゼが進行させるのが両方共(双方向性)か、片方だけ(一方向性)かが異なる。双方向性が確認された最初の生物は枯草菌(Bacillus subtilis)である。その後、真核生物のキイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)やイモリでも発見された。現在では、真核生物でも原核生物でもほとんどのDNA複製は双方向性であると考えられている。一方で、colE1と呼ばれるプラスミド(染色体外の環状DNA)などで一方向性のDNA複製が確認されている。
真核生物におけるDNA複製のモデル生物は酵母である。複製開始が行われる領域は自立複製配列 (autonomously replicating sequence:ARS) であり、そこには複製開始点複製エレメント (origin replication element:ORE) が存在する。この11塩基対にタンパク質が結合し、複製開始点認識複合体 (origin recognition complex:ORC) は形成される。ORCに相当するイニシエーター-DNA複合体は、調べられた限りすべての真核生物に共通する。OREのすぐ隣はDNA開裂領域 (DNA unwinding element:DUE) である。約80塩基対のこの配列は、容易に分解するようAとTに富む。DUEは酵母における複製開始点であり、複製開始と伸長に関わるMCMタンパク質複合体が結合する。
真核生物の染色体上には複製起点が多数存在するが、全て細胞周期一回あたり一度しか複製が開始しないように調節されており、これを複製のライセンシングと呼ぶ。複製のライセンシングが破綻すると、ゲノムの一部が一度の細胞周期に2度複製される、また逆に複製されないなどの問題が生じる。
ライセシングの過程はG1期(S期の前)からS期にかけて起こる。ARSのレプリケーターにイニシエーターである複製起点認識複合体(Origin Recognition Complex:ORC。オークと読む)が結合することが複製開始の引き金である。ここで注目すべき、原核生物にはないライセシングの特徴は、レプリケーターとイニシエーターの結合が複製起点の点火と別である点である。
ライセシングの前にまず複製開始と伸長の機構を詳述する。
半保存的複製 (semiconservative replication) とは、一般に、DNA複製により合成された2本の二重らせんDNAが1本の娘鎖と1本の親鎖から構成されていることである。DNA複製の機構が半保存的複製であることは1958年にマシュー・メセルソンとフランクリン・シュタールにより証明された(メセルソン-スタールの実験)。
巻き戻しはTraIが5’末端から環に沿って移動しながら行う。遊離した5’末端は受容菌へと移動し(このとき供与菌と受容菌は接触し、つながっている)、次々と巻き戻されるssDNAを先導する。F因子がプラスミド型の場合、巻き戻しは環全体にわたり、(一本鎖の)F因子丸々1個が受容菌に伝達される。一方、染色体に組み込まれている場合、DNA伝達は伝達領域とは逆方向へ進む。プラスミド型と同様に5’末端から受容菌へと入っていくが、これは細菌間の接触が壊れるまで続く。細菌の染色体全体が伝達するのにおよそ100分かかるが、通常はその前に接合は中断する。
接合によって互いのF因子または染色体は一本鎖になるが、それはDNA複製によって二重らせんに戻る。DNA複製が巻き戻しと同時に起こっているなら、ウイルスのDNA複製で紹介するローリングサークル型複製に似ている。しかし、伝達は複製と全く独立した過程であり、これはローリングサークル型複製とは言えない。
接合においてDNA複製が利用される。接合とは細菌の生殖様式の一つで、一つの個体(供与菌、F)が別の個体(受容菌、F)に自身の(染色体やプラスミドの)DNAを移動させることである。その典型例は大腸菌のエピソームであるF因子(Fプラスミド)の仲介で起こる。すなわち、このF因子を、持つ供与菌が持たない受容菌に移す。
接合ではF因子(とそれと地続きの染色体)の巻き戻りが起こり、一方のssDNAは受容菌へと移動。もう片方は供与菌に残る。DNA複製はここで登場し、供与菌と受容菌両方のssDNAを正常なdsDNAに変換する。
具体的な過程を示す。接合には伝達領域と呼ばれるF因子の大きな(約33 kb)領域が必要で、伝達領域の一端にある伝達起点oriTから始まる。リラクセーズのTraIはoriTを認識し、nicと呼ばれる部位を切断する。生じた5’末端に共有結合し、約200bpにわたりdsDNAを巻き戻す。
DNA複製は複製開始 initiation 、伸長 elongation 、終結 termination の3段階で進む。なお、二重らせんをとる二本鎖DNAをdsDNA ( double-stranded DNA )、そうでない一本鎖DNAをssDNA (single-stranded DNA) と表記する。
複製は、DNA上の特別な塩基配列である複製起点(replication origin、起点:origin)から開始される。複製起点周辺で部分的に二重らせんが解かれ、親鎖の途中に2本のssDNAが現れる。直ちに、さまざまな酵素の複合体がssDNAに結合し、プライマーと呼ばれる短いRNAがssDNA上に合成される。ここまでが複製開始段階である。次の伸長段階で、DNA合成酵素のDNAポリメラーゼ (DNA polymerase) を含む複合体(複製装置、replication machinery)が親ssDNAに結合する。まずDNAポリメラーゼは、プライマーの3'末端と結合している親ssDNA上の塩基の隣の塩基を識別し、それと相補的なデオキシヌクレオチドをプライマーの末端に付加させる。それ以降、DNAポリメラーゼは親ssDNA上を5'から3'の方向へ移動しながら親ssDNAと相補的な塩基を娘鎖末端に付加させていく。同時に、娘鎖は親鎖と二重らせんを形成する。これと並行して、二重らせんのままの未複製部分は順次解かれていく。これが繰り返され、最終的に完全に複製した娘鎖が出来上がる。