膜電位感受性色素
1,000種類以上の色素がスクリーニングテストにかけられ、まずmerocyanine-rhodanine系 (Ross, et al, 1977), merocyanine-oxazolone系 (Gupta, et al, 1981) 色素が選び出された。その際、色素の選定基準としては、
信号対雑音比 (S/N) が大きい、
背景光に対する光学的変化ができるだけ大きい、
神経線維に対する薬理的、光化学的毒性ができるだけ小さいか無視できる、
色素の退色時間ができるだけ長いということと、
膜電位変化に対する応答時間(時定数)が短い
ということがあげられた。色素の毒性や光化学的影響は光学的測定で深刻な問題であり、これについては、膜電位固定したときの内向き電流、いわゆるNa電流が減衰する時間を調べることによって厳しくテストされた。その結果、Merocyanine 540は大きなシグナルが得られるにもかかわらず、光化学的毒性が大きいことから (Ross, et al, 1977), 膜電位測定用のプローブとして適していないと判定された。しかし、この色素が見いだされたことが膜電位に高感受性をもつmerocyanine-rhodanine系やmerocyanine-oxazolone系色素の合成につながったのである。その後も、主として、Grinvaldの研究室で、Rina Hildesheimにより色素の合成が続けられ、merocyanine系色素に加えて、現在用いられているoxonol系、styryl系色素が選びだされた (Grinvald, et al, 1980, 1982a)。色素についてはまだ改良すべき多くが残されており、その探索は現在も続けられている。
J Gen Physiol 95 : 867-890, 1990
↑ Grinvald A, Ross WN, Farber I. (1981) Simultaneous Optical Measurements of Electrical-Activity From Multiple Sites on Processes of Cultured Neurons. PNAS 78, 3245-3249.
↑ Grinvald A, Farber I : Optical recording of calcium action potentials from growth cones of cultured neurons with a laser microbeam. Science 212 : 1164-1167, 1981b
↑ Ross WN, Arechiga H, Nicholls JG : Optical recording of calcium and voltage transients following impulses in cell bodies and processes of identified Leech neurons in culture. J Neurosci 7 : 3877-3887, 1987
↑ Ross WN : Changes in intracellular calcium during neuron activity. Annu Rev Physiol 51 : 491-506, 1989
Merocyanine-rhodanine系色素を用いた実験でも、ローダニン核についたアルキル基の長さと吸光変化との間に関係があること、分子吸光係数の大きい色素が膜電位依存性の吸光変化も大きいという結果が得られている (Kamino, et al, 1989)。
もう1つは、Loew (1982) によって提出されたもので、electrochromism effect, すなわち色素の発色団における電荷移動 (charge shift) によって説明しようとするものである。これは主として、styryl系色素について考察が進められている。膜に吸着した色素で、膜をはさんで電場がない場合、励起光によって発色団の荷電状態に変化が引き起こされ、放射光によってその荷電状態は可逆的に変化する。膜に電場がかかったとき、すなわち、電位差(膜電位)があると、それは荷電の移動を阻止するように働くため、荷電移動を引き起こすためには余分な励起光あるいは放射光を必要とすることになる。Loewのグループ (Hassner, et al, 1984) は、このメカニズムに基づいて、より高感度の膜電位感受性をデザインすることを試みている。このようなelectrochromism effectによる光学的な変化は0.1μ 秒以下の時間内に起こるはずである。ところが、merocyanine系での膜電位変化に対する応答時間は2.0-5.0μ秒ぐらいであり、electrochromismによる電荷移動の仮定をそのままmerocyanine系に適用することは難しい。
さらに色素開発の発展に伴い、上記以外のメカニズムに基づく様々な膜電位感受性色素が登場している。膜電位イメージングに詳細されている。