コンビナトリアル生合成
PKSやNRPSを対象とした部位特異的突然変異による基質の改変は、理論的には酵素の活性に大きく影響しないと考えられていたが、実際には変異によっては活性を著しく低下させたり、目的の基質選択性を自由に持たせることが簡単ではないことが判明している。この事実は、Aドメインの基質選択性が活性部位内のコードのみで決定しているわけではなく、それ以外のタンパク質構造の安定化のみに作用していると思われていた部位にも、活性や選択性に重要な役割があることを示している。
酵素内のアミノ酸配列や高次構造の役割を全て解明するには、現在の技術では途方もない時間がかかってしまう。そこで、自然界で起こる進化を模倣する技術である指向性進化が利用されている。指向性進化では、ヌクレオチド配列をランダムで変異させ、その変異を利用できる個体だけが選択され検査される。この手法では、酵素の全てを解明する必要がないため、効率よく新たな機能を持った酵素を創りだすことができる(図7)。
コンビナトリアル生合成による“非天然”天然物の生成は、1985年に初めてHopwoodらによって実現した。彼らは、ストレプトマイセス・コエリカラー内のアクチノロージン生合成遺伝子を、メデルマイシンやジヒドログラナチシンを生成するストレプトマイセス属AM-7161やストレプトマイセス・ビオラセオルバーTü 22へと導入することで、それぞれメデロジンAやジヒドログラナチロジンといった新たな物質を生成させることに成功した(図1)。
1990年代に入ると、ポリケチド(PK)や非リボソームペプチド(NRP)の生合成経路改変に大きな注目が集まるようになった。すなわち、複数ドメインの組み合わせによって、マロン酸やアミノ酸といった単位ブロックを組み立てライン様に合成・誘導体化する酵素の、組み合わせを入れ替えることで異なるブロックを組み込もうといった試みである。例えば、あるNRPのアミノ酸一部分を自由に入れ替えられるようになれば、それだけで19の新たな物質が生成できることになり、二部分であれば361と鼠算式に増えていく。初期の研究では、PKの一種アクチノロージンやエリスロマイシンの誘導体化が進められ、数多くの“非天然”天然物が生成された(図2)。
当初の手法では、単に各ドメインやモジュールの削除や交換などに主眼が置かれ、ドメイン間、モジュール間、またタンパク質間の連結にはさほど注意が払われることはなかった。