サブクローニング
まず、制限酵素を使って、親遺伝子から目的の遺伝子(インサートと呼ぶ)を切り出す。インサートは、他のDNA分子から単離するために精製される。一般的な精製方法はゲル分離である。その後、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して、遺伝子のコピーを増幅する。
同時に、同じ制限酵素を使用して挿入先を消化(切断)する。同じ制限酵素を使う背後にある考え方は、相補的な粘着末端(英語版)を作成することで、後のライゲーションを容易にするためである。目的ベクター(英: destination vector)のセルフライゲーションを防ぐために、ホスファターゼ(一般的には子牛腸アルカリホスファターゼ(英語版)、CIAP)も加えられる。消化された目的ベクターは単離し、精製される。
次に、インサートと目的ベクターをDNAリガーゼと混合する。インサート遺伝子と目的ベクターの典型的なモル比は3:1であり、インサート濃度を高めることにより、セルフライゲーションはさらに減少する。反応混合物を特定の温度で一定時間放置すると(ライゲーションする鎖のサイズに依存する。詳細はDNAリガーゼを参照)、インサートは目的プラスミド(英: destination plasmid)に正常に組み込まれるはずである。