流加培養
流加培養では、基質(溶液)の流加によって、バイオリアクター内の培養液量は多かれ少なかれ、増大する。増加量が無視できる場合と、無視できない場合に大別される。前者を培養液量一定流加培養 (constant-volume fed-batch culture)、後者を培養液量可変流加培養 (variable-volume fed-batch culture) と区別できる。前者は液状基質(メタノール、エタノール、グリセリンなど)や粉末状のグルコースや濃厚基質溶液を流加する場合であり、後者はそうでない場合である。基質の水溶液をフィードする場合は、基質と共に水がフィードされるが、実用的な観点からすると、水を供給しても培養液が希釈され培養液量が増えるだけで、何のメリットもない。運転・解析の容易さを考えると、出来るだけ濃厚な溶液をフィードすべきである。 さて、流加培養の要点は、流加基質濃度を制御することであるから、その中心的問題は、何を流加するかということと、いかに流加するかということである。後者には、いつ流加を開始するかという問題も含まれる。前者を決定するには、微生物生理学、生化学、遺伝学の知識が必要である。エンジニアリングは後者とかかわりがある。流加の仕方により流加培養を分類できる。表1に各種流加方式として、その分類を示す。
なお、流加培養で収穫時に培養液を一部残し、同じバイオリアクター内で次の流加培養の種菌として使い、これを繰り返すような操作法は反復流加培養(Repeated fed-batch culture (fermentation))と呼ばれる。
表1 流加培養法の分類
(1) フィードバック制御のない流加法
1.1 定流量流加法 1.2 指数的流加法 1.3 最適化流加法(最大原理(MP),動的計画法(DP)など) 1.4 間欠的添加法
(2) フィードバック制御のある流加法
2.1 直接的
(培養液中の流加基質濃度を測定して、その値を直接的に制御指標とする。)
2.2 間接的
(微生物反応に密接に関連している可観測なパラメータを制御指標とする。
パラメータとしては、pH、DO,qo2, RQ,濁度、アンモニア添加量、排ガス中のCO2分圧、などがある。)
2.a 定値制御(PID制御) 2.b プログラム制御 2.c 最適制御 2.d 知的制御(ファジー制御(FC)、ニューラルネットワーク(NN)など)
4.1 定流量流加培養
定流量流加培養 (Constantly fed-batch culture, CFBC) は基質の質量流量、fmass [単位はg/h]、あるいは体積流量、fvol [単位はL/h]、が一定の場合で、最も簡単な流加培養である。流加液中の基質濃度をsin [単位はg/L]とすると、 f m a s s = f v o l × s i n {\displaystyle f_{mass}=f_{vol}\times s_{in}} である。なお、流量とは単位時間当たりの流体の移動量であり、流速とは区別されねばならない。流速とは、文字通り、流体の流れの速度(速さ)であり、単位は例えばm/hである。この流加方式の数学的解析および実験的研究がある。 この流加方式の最大の特色は、直線増殖 (linear growth) が起こることである。
このタイプの流加法については多くの研究報告があるが、工業的な実施例の情報は少ない。
4.4 フィードバック制御がある流加培養
基質をあらかじめ決められた通りに流加する方式では、途中、発酵が好ましくない状態に陥っても、それに対処するのが困難である。したがって、可能ならば、何らかのフィードバック制御を行いたいと考えるのは当然である。ある場合には、これは直接現場の技術者が手動で行う。
フィードバック制御のある流加発酵は、制御方式の観点から、間接的なものと直接的なものとに分類できよう。また、制御される流加基質濃度の観点から、一定値に保つ場合(定値制御)と、濃度を時間的に変化させて制御する場合(プログラム制御)とに分類できよう。後者は、たとえば、発酵の初期、濃度を高く保ち、後半に入って低く保つ、といった場合を想定している。
間接的フィードバック制御のある場合: プロセスに密接に関連している可観測なパラメータを制御指標とする方式である。制御指標としては、溶存酸素 (DO)、呼吸速度、排ガス中のCO2分圧、呼吸商 (RQ)、pH、代謝産物、濁度、蛍光、などが報告されている。DOを一定に保つ方式では、基質濃度が臨界値より低下するとDOが上昇し、基質がある程度以上に存在するとDOが減少する現象を利用する。培養の進行とともに菌体濃度が上昇し、それにつれて酸素需要も多くなるから、通気量・攪拌速度を増やすかして気液間酸素移動容量係数 k L a {\displaystyle k_{L}a} を増加させるか、もしくは、空気に純酸素を補充して推進力を高めるかして、いずれにしても酸素移動速度を大きくしていかねばならない。
絶えず制限して培養するために、栄養要求物質は流加される。
3.6 抑制性プロモーターを持つ遺伝子の発現制御
組替え微生物による異種タンパク質生産に影響する因子は多数存在するが、遺伝子の分子構造上の因子のうち、特に重要なのはプロモーターの種類と強さである。プロモーターはその発現様式から、構成的 (constitutive) なものと調節性 (regulable) なものに大別され、後者はさらに誘導性 (inducible) なものと抑制性 (repressible) なものとに細分される。抑制性プロモーターでは、培地中にある化合物が存在すると、その化合物(もしくはその代謝産物)がコリプレッサーとしてアポリプレッサーと結合しホロレプレッサーとなり、これが遺伝子上流のオペレーターに結合して転写ができなくなる。しかし、通常その化合物は菌の増殖には必須である。よって、遺伝子発現に好適な非常に低い濃度に保ちつつ培養する。そのため、その化合物は流加される。trp(トリプトファン)やphoA(リン酸塩)などがその例である。
3.7 反応時間の延長、水分損失の補填、培養液粘度の低下
目的代謝産物の生成が指数期から減速期にかけて顕著である場合、この期間を引き延ばし1回当たりの生産量を増大させることが可能である。長時間、好気培養を続けると、排気ガスによって、培養液量が減少することがある。また、目的代謝産物が多糖類などの場合は、培養液の粘度が異常に高くなって、発酵の続行が難しいこともある。これらの問題を解決するために、時として、流加法が適用される。