聖ヨハネ騎士団
再び本拠地をなくした騎士団だが、教皇クレメンス7世と神聖ローマ皇帝カール5世の斡旋により、シチリア王からマルタ島を借りることになった。賃貸料は毎年「マルタの鷹」1羽である。このマルタ島でも、ロドス島のときと同様にイスラームやヴェネツィアのユダヤ人に対し海賊行為を行い、マルタ島はイスラーム教徒やユダヤ人の奴隷売買の中心地となった。
1565年に再びオスマン帝国の大船団に襲われることになるが、スペインの救援とスレイマン1世の死(1566年)によって、辛うじて防衛に成功した。このときオスマン軍撃退に活躍した騎士団総長ジャン・ド・ラ・ヴァレットにちなんでマルタ島の主要港がヴァレッタと名付けられた。続く1571年のレパントの海戦でもマルタ騎士団の船が参加している。
16世紀に宗教改革が盛んになると、西欧各地の騎士団領は没収されるようになり、その力と存在意義は次第に失われていった。17世紀には、ロシア海軍やフランス海軍の一部として組み込まれるようになった。
1798年、ナポレオン・ボナパルトがエジプト遠征の際にマルタ島を奪ったため、根拠地を失った騎士団は正教国家であるロシア帝国を頼り、1801年にロシア皇帝パーヴェル1世を騎士団総長に選んだ。1803年には再びカトリックの総長に戻るが、これ以降は求心力を失い、各地の支部が独自に活動するようになる。1834年に本部はローマに移った。