タンパク質工学
この方法では、5'または3'末端の単一ブロック配列、ステムループ領域の相補配列、PCRのプライマー結合部位となるD分岐領域を含む一本鎖DNA鎖を生成する。5'側と3'側の両半鎖が等量ずつ混合され、ステム領域での相補性によりハイブリッドが形成される。3'半鎖の5'末端がリン酸化されたハイブリッドは、0.1 mM ATPの存在下でT4 DNAリガーゼを用いて5'半鎖の3'末端と結合される。ライゲーションした生成物を2種類のPCRで増幅し、pre 5' halfとpre 3' halfのPCR生成物を生成する。これらのPCR産物は、ビオチン標識されたステム配列を含むプライムの5'末端へのアビジン-ビオチン結合を介して一本鎖に変換される。次に、ビオチン標識された5'ハーフストランドとビオチン標識されていない3'ハーフストランドは、次のYライゲーションサイクルの5'と3'のハーフストランドとして使用される。
このシステムは、大腸菌の自然な部位特異的組換えシステムをベースにしている。このシステムはインテグロンシステムと呼ばれ、自然な遺伝子シャッフルを生じさせる。この方法を用いて、trp欠損大腸菌において、個々の組換えカセットまたはtrpA-E遺伝子と調節エレメントをインテグロンシステムで送り込むことにより、機能的なトリプトファン生合成オペロンを構築し最適化した。
この方法は、まず、ウラシルdNTPを使用して、組み換えが必要な遺伝子断片を増幅することから始まる。この増幅液には、プライマー、PfuTurbo、Cx Hotstart DNAポリメラーゼも含まれている。増幅された生成物は、次にUSER酵素とインキュベートされる。この酵素は、DNAからウラシル残基を除去して1塩基対のギャップを作ることを触媒する。USER酵素で処理した断片を混合し、T4 DNAリガーゼでライゲーションし、Dpn1切断でテンプレートDNAを除去する。得られた一本鎖の断片はPCRで増幅され、大腸菌に形質転換される。
これらの方法は、テンプレートに関する構造情報を一切使用せずに、自由なモデリングを行うものである。第一原理計算法は、タンパク質の自由エネルギーの大域的最小値に対応するネイティブな構造を予測することを目的としている。第一原理計算法の例としては、AMBER、GROMOS、GROMACS、CHARMM、OPLS、ENCEPP12がある。第一原理計算の一般的な手順は、 対象となるタンパク質を幾何学的に表現することから始まる。次に、 タンパク質のポテンシャルエネルギー関数モデルを作成する。このモデルは、分子力学ポテンシャルまたはタンパク質構造由来のポテンシャル関数のいずれかを使用して作成することができる。ポテンシャルモデルの開発に続いて、分子動力学シミュレーション、モンテカルロシミュレーション、遺伝的アルゴリズムなどのエネルギー探索技術がタンパク質に適用される。
この部位飽和変異導入技術は、1つの変異導入オリゴヌクレオチドと1つのユニバーサルフランキングプライマーから始まる。これら2つの反応物は最初のPCRサイクルに使用される。この最初のPCRサイクルからの生成物は、次のPCRのためのメガプライマーとして使用される。