フアン・ホセ・デ・アウストリア
1665年6月17日のモンテス・クラロスの戦いでスペインの敗北が決定的となると、フェリペ4世から庶子フアン・ホセへの譲位を求める臣民の声が高まった。フアン・ホセは勢いづき、王位継承権の獲得のために異母妹マルガリータ・テレサとの結婚をフェリペ4世に申し出たが、近親婚への嫌悪と政治的な理由により父からマドリード宮廷への出入りを禁止され、臨終時の対面も拒否された。
1665年9月17日にフェリペ4世が亡くなると、遺言によりフアン・ホセは相応の地位を保証されはしたものの、マリアナにより異母弟カルロス2世から遠ざけられた。マリアナは輿入れの際にオーストリアから随行した司祭ナイトハルト伯爵ヨハン・エベールハルト(Johann Eberhard Graf Neidhardt)を重用し、スペイン国籍と大審問官の地位を与えた。政治的手腕を持たないナイトハルトの関与により枢密院の閣議は迷走し、ほどなくしてナイトハルトの手に余るようになった。ナイトハルトはマリアナに事態の収拾のためにフアン・ホセを呼び戻すよう要請し、マリアナは渋々それに従った。1667年6月にフアン・ホセが枢密院の主導権を握るとナイトハルトは孤立を深め、退任寸前まで追い込まれた。マリアナはナイトハルトの窮状を救うため、政情不安なネーデルラントへの派兵を企図し、フアン・ホセを司令官に任じて枢密院から遠ざけようとした。
1668年6月ナイトハルト暗殺の謀略が露見し、フアン・ホセの同志であったホセ・マラーダが首謀者として惨殺されると、フアン・ホセは内政の混乱を憂い、ネーデルラントへの出帆を拒否した。マリアナは彼の任を解き、コンスエグラに拘禁した。同年10月に、フアン・ホセの支持者を首謀者とするナイトハルト誘拐の企てが発覚すると、フアン・ホセはバルセロナへの逃亡を余儀なくされた。