タンパク質工学
相同組換えは、in vivoとin vitroに分類されることがある。in vitroの相同組換えは、in vivoの自然な組換えを模倣したものである。これらのin vitro組換え法では、親配列間の高い配列相同性が必要とされる。これらの手法は、親遺伝子の自然な多様性を利用し、それらを組み替えてキメラ遺伝子を得るものである。得られたキメラは、親の特徴が混在したものとなる。
エクソンシャッフリングとは、イントロンで起こる組換え現象によって、異なるタンパク質のエクソンが組み合わされることである。オルソログエクソンシャッフルは、異なる生物種のオルソログ遺伝子のエクソンを結合する。オルソログドメインシャッフリングは、異なる種のオルソログ遺伝子からタンパク質ドメイン全体をシャッフルするものである。パラロガスエクソンシャッフリングは、同一種の異なる遺伝子からのエクソンをシャッフルする。パラロガスドメインシャッフリングは、同じ生物種のパラログタンパク質からタンパク質ドメイン全体をシャッフルする。機能的相同ドメインシャッフルは、機能的に関連する非相同ドメインのシャッフルを行う。これらのプロセスはすべて、キメラ合成オリゴヌクレオチドを用いて、異なる遺伝子から目的のエクソンを増幅することから始まる。この増幅産物は、プライマーレスPCRを用いて全長の遺伝子に再構成される。このPCRサイクルの間、断片はテンプレートおよびプライマーとして機能する。この結果、キメラ全長遺伝子が得られ、スクリーニングに供される。
タンパク質の構造情報がない場合、配列解析はタンパク質に関する情報を解明するのに役立つことが多い。これらの手法では、対象となるタンパク質の配列を、他の関連するタンパク質の配列とアライメントする。このアラインメントにより、どのアミノ酸が生物種間で保存され、タンパク質の機能にとって重要であるかを示すことができる。これらの分析により、変異の標的部位となりうるホットスポットアミノ酸を特定することができる。多重配列アライメントは、PREFAB、SABMARK、OXBENCH、IRMBASE、BALIBASEなどのデータベースを利用して、ターゲットタンパク質の配列を既知の配列と相互参照するものである。多重配列アライメントの手法を以下に示す。
この方法は、まずk-tuple法またはNeedleman-Wunsch法を用いて配列のペアワイズアライメントを行う。これらの方法は、配列ペア間のペアワイズ類似性を表すマトリックスを計算する。類似度スコアは距離スコアに変換され、近隣結合法を用いてガイドツリーを作成するために使用される。このガイドツリーを用いて、多重配列アライメントが行われる。
親遺伝子の断片は、エキソヌクレアーゼIIIによる制御切断で作られる。これらの断片はエンドヌクレアーゼで平滑末端化され、ハイブリッド遺伝子を生成するためにライゲーションされる。THIOITCHYは、ITCHYを改良したもので、α-ホスホチオエートdNTPなどのヌクレオチド三リン酸アナログを利用した手法である。これらのヌクレオチドを組み込むことで、エキソヌクレアーゼIIIによる切断を阻害することができる。このエキソヌクレアーゼIIIによる切断の阻害をスパイクと呼ぶ。スパイキングは、まずエキソヌクレアーゼで遺伝子を切断し、短い一本鎖のオーバーハングを持つ断片を作ることで達成できる。これらの断片は、少量のホスホチオエートdNTPsの存在下でDNAポリメラーゼによる増幅のためのテンプレートとして機能する。これらの断片は、その後、全長の遺伝子を形成するために一緒にライゲーションされる。あるいは、インタクトな親遺伝子を、通常のdNTPおよびホスホチオエートdNTPの存在下でPCRにより増幅することもできる。これらの全長増幅産物は、次にエキソヌクレアーゼによる切断に供される。切断はエキソヌクレアーゼがα-pdNTPに出会うまで続けられ、異なる長さの断片ができる。これらの断片をライゲーションしてキメラ遺伝子を生成する。