ペプチド合成
酸処理によりN上のカルボキシ基を除去してから、さらに別のN-カルボキシアミノ酸無水物を作用させるプロセスを繰り返せば、ペプチド鎖を延長していくことが可能である。しかし、それぞれのアミノ酸のN-カルボキシアミノ酸無水物を調製するのは、猛毒のホスゲンを用いることもあってかなりの熟練を要する。そのため、現在ではまず用いることがない。
アジド法
現在の縮合剤による方法が確立するまで、α-炭素のエピ化が少ない方法として用いられていた方法である。特にペプチド鎖同士を結合させるセグメント縮合にこの方法が使用された。
まず、結合させるペプチド鎖のカルボキシ基をカルボン酸ヒドラジドへと変換する。これにはエステル保護されたカルボキシ基に直接ヒドラジンを反応させる方法と、遊離のカルボキシ基にBoc保護したヒドラジンを縮合剤で縮合させた後、Bocを脱保護する方法がある。次に酸ヒドラジドを亜硝酸エステルによって酸化してカルボン酸アジドへ変換する。これをトリエチルアミンの存在下に相手のペプチド鎖のアミノ基と縮合させる。
アジド法はカルボン酸アジドの反応性が低いため、側鎖のアミノ基、スルフヒドリル基以外の官能基は保護せずに行なえるメリットがある。しかし、反応操作に厳密性が要求されること、また毒性のあるアジ化水素が副生し、爆発性を持つアジ化物が残存したりすること、にもかかわらず収率が良くないことから、縮合剤を用いる方法にとって代わられた。
ベクターを取り込んでいない細胞や制限酵素による切断がなされなかったことによりDNA断片が取り込まれていないベクターを取り込んでしまった細胞も存在しているため、DNA断片が組み込まれたベクターを取り込んだ細胞だけを選別することが必要となる。これにはベクター上にある遺伝子を利用した2段階選別法が用いられる。
ベクター上にはある種の抗生物質への耐性を与える遺伝子があるため、ベクターを取り込んだ細胞は培地にその抗生物質が含まれていても増殖が可能である。そこで抗生物質を添加した培地でコロニーを形成した細胞はベクターを取り込んでいることが分かる。
またDNA断片がベクターに組み込まれた際に、DNA断片が挿入された位置にあった遺伝子はその機能が失われる。DNA断片はある酵素の遺伝子上に挿入されるため、その酵素の働きが失われることになる。例えばβ-ガラクトシダーゼの働きが失われたことは、X-galを分解して青色の色素を形成する能力が失われたことで知ることができる。このようにしてDNA断片が組み込まれたベクターを取り込んだ細胞だけを選別できる。