足利義昭
元亀3年5月13日、義昭は甲斐の武田信玄に対して、「天下静謐」のために軍事行動を起こすように命じた御内書を下した。これにより、信玄はその眼を西に向けるようになった。すでに、元亀3年1月に信玄は縁戚関係にある顕如より、信長の背後を突くように依頼を受けていた。
9月、信長は義昭に対して、自身の意見書である異見十七ヶ条を送付した。この意見書は義昭の様々な点を批判しており、とくにかつて殺害された過去の将軍の名を出したこともあって、信長と義昭の対立は抜き差しならないものとなった。
10月3日、武田信玄が朝倉義景や浅井長政に出陣を告げ、同日に甲府より進軍を開始し、徳川氏の領国である三河・遠江に侵攻した(西上作戦)。通説では、義昭が異見十七ヶ条に反発し、信玄に内通した結果とされてきたが、近年ではこの侵攻は徳川家康を標的にしたものであり、義昭が通じたものではないとする見方もある。
また、同月に信長は妙心寺に寺領安堵の朱印状を発給したが、これは義昭の意思に基づいて安堵されたものであった。この時点では、義昭は信長と表面的には対立することなく、協調して京都の支配を行っている。
とはいえ、信長にとって、徳川家康は盟友であり、信玄が徳川領に侵攻したことは、信長に矛を向けるということに等しかった。これまで、信長は武田氏と上杉氏の和睦を仲裁してきたこともあって、この侵攻に激怒して武田氏と絶交し、家康に援軍を送った。
元亀4年2月13日、義昭は遂に反信長の兵を挙げ、朝倉義景や浅井長政、武田信玄らに御内書を下した。さらには、三好義継に挙兵の意思を伝えるとともに、安芸の毛利輝元、備前の浦上宗景にも参陣を促した。義昭は信長のみに依存する現在の体制から、朝倉義景や浅井長政、武田信玄、三好義継、顕如、毛利輝元、浦上宗景らによって構成される幕府へと再編しようとしたと考えられている。
義昭の信長からの離反を、反信長派の諸将は大いに喜んだ。浅井長政が直ちに「公方様から御内書を下された」と各所へ喧伝したように、将軍が味方したこと大々的に喧伝し、どちらに付くか決めかねている者達を味方にしようとした。
一方、信長は義昭の離反に大変驚き、挙兵は義昭の意志ではなく、側近の幕臣が勝手に企てたことだと言って、当初は信じようとしなかったという。信長としては、義昭はこれまで自身が支援してきた主君であり、その義昭に見限られたということは、信長派の大量離反、つまり総崩れに繋がることを危惧せざるを得なかった。そのため、信長は義昭に使者を急派し、息子を人質とすることで講和を申し入れた。状況は信長にとって、圧倒的に不利であった。
同月、義昭は朝倉義景の軍事力に期待し、上洛を命じた。だが、義景は一向に上洛する気配はなく、義昭は越前に使者を急派して、急ぎ上洛するように命じた。義昭は義景に対して、5,000から6,000の兵を京都郊外の岩倉の山本まで出兵するようにと催促したが、義景は大雪で進軍が困難だと返答するのみであった。
義秋の構想は、相互に敵対していた斎藤氏と織田氏、六角氏と浅井氏、更には武田氏・上杉氏・後北条氏らを和解させ、彼らの協力で上洛を目指すものであったと考えられている。
和田惟政と細川藤孝の説得により、信長と斎藤龍興は和解に応じ、信長は美濃から六角氏の勢力圏である北伊勢・南近江を経由して上洛することになった。和議の成立によって、信長は8月22日に出兵することを約束した。
8月3日、義秋の行動に対して、三好三人衆の三好長逸に矢島御所で内通する者がおり、その軍勢3,000余騎が矢島を攻撃すべく、坂本まで進出した。だが、この時は坂本で迎撃し、奉公衆の奮戦により、からくも撃退することが出来た。信長の上洛計画が現実味を帯びたことで、三好氏が先制攻撃を仕掛けたと考えられる。
8月29日、義秋から幕府再興の呼びかけを受けて上洛の兵を起こした信長の軍は、斎藤龍興の襲撃にあって、美濃を通過できなくなってしまった(河野島の戦い)。このとき、敗れた信長の軍勢は「前代未聞」の敗戦ぶりであったといい、斎藤氏から嘲笑を受ける程であったという。
同日、近江の六角義賢・義治父子が叛意を見せた。斎藤龍興と六角義賢の離反がほぼ同時に起きているのは、三好方による巻き返しの調略があったとみられている。信長は美濃を通過できず、さらにはその先の近江も不穏となったため、撤退せざるを得なくなった。