アルティメット・スパイダーマン
声 - 松丸幸太郎 / 英:マックス・ミトルマン(初登場時)→ダリル・サバラ
第32話(第29話)「ライノ」で初登場したひ弱な高校生。ピーターと同様にフラッシュ・トンプソンにいじめられていたが、ドクター・オクトパスの製造した犀の遺伝子薬物を手に入れ、犀の力を持つ怪力の巨人へと姿を変え、フラッシュへの復讐を果たそうとする。「ライノの怒り」ではシールドに捕獲され調査を受けていたが、元の姿に戻れないと告げられた上に、エージェント・ベノム(フラッシュ)がヒーロー候補生としてシールドアカデミーに入学したと知って逆上して脱走。ハルクと互角の戦いを繰り広げるが、スパイダーマンとハルクの「怪物になってもヒーローになれる」との説得を受け改心し、シールドアカデミーで訓練を受けることになる。高校時代の関係からエージェント・ベノムとの仲は悪いが、力を合わせることもある。シニスター・シックスが台頭したことでヒーローからヴィランに戻った。それでもドクター・オクトパスにエージェント・ベノムが実験されそうになった際は「友達を見捨てられない」と妨害したりとシールドアカデミーへの友情は消えていない。それが原因で薬を投与され、後に登場した際に洗脳されて登場する。
最終話である第104話「卒業の日」では中和剤を投与されたことにより元に戻った。
声 - 優希知冴 / 英:ダヴ・キャメロン
第4シリーズに登場。マイルス・モラレスの世界のスパイダーウーマン。クモのパワーはないため、マグネットブーツとデジタル・スパイダーセンスでスパイダーマンの能力を再現している。
マイルスがいなくなっため彼に代わり街を守るためスパイダーウーマンとなった。マイルスの世界の初代スパイダーマンであるピーターとは友人であった。ピーターの伯母であるメイおばさんが彼女を補佐している。
声 - 広田みのる / 英:ダニー・ジェイコブス
ヒドラの悪の魔術師。
声 - / 英:マット・ランター
声 - 志田有彩 / 英:ケイトリン・テイラー・ラブ
ピーター・パーカーの級友の一人で、ヒーローチームの紅一点。鋭い爪を武器とする女忍者で、ホワイトタイガーとして活動するときは白い覆面と衣装を身に着ける。
アミュレットの力を制御出来ないと理性を失い、非常に攻撃的になってしまう。普段は平常心を維持する為、優等生を演じている。
第56話「クローク・アンド・ダガー」においてダガーの浄化力でパワーアップし、原作寄りのコスチュームにチェンジした。
声 - 櫛田泰道 / 英:フレッド・タタショア
ニューヨークにZzzaxを追ってやってきた大男。 「独占インタビュー」でスパイダーマンと出会い、周囲に誤解されながらもZzzaxを倒した。このとき、スパイダーマンを虫男と呼び、ぶん殴るのがうまいから気に入った、と言っていた。
「ハルクのウイルス感染」で再登場したときはファランクス(英語版)に寄生され体調を崩し、スパイダーマンに自宅へかくまわれた。その後、スパイダーマンの提案によりS.H.I.E.L.D.のヘリキャリア内に住んでいたが、「超人スパイダー・ハルク」でメスメロによりスパイダーマンと精神が入れかわる珍事に見舞われたことが原因で、S.H.I.E.L.D.を去った。
第3シーズン(シーズン3)以降ではアベンジャーズの一員として登場しているほか、「ライノの怒り」ではライノの更生にも携わった。
第75話、第76話、第77話、第78話「真のチャンピオン決定戦」では1回戦に登場。
声 - / 英:ケビン・マイケル・リチャードソン
アメリカ合衆国での初回放送前日にあたる2012年3月31日にはニューヨークとロサンゼルスで記念パーティーが開かれた。ニューヨークでのパーティーはマンハッタンにある漫画専門店ミッドタウン・コミックス・ダウンタウン(英語版)で行われ、マーベルコミックのチーフ・クリエイティブ・オフィサーである、ジョー・ケサダや、この番組に携わっているジョー・ケリー、この番組の同時宣伝にあたる漫画の第1号のライターを務めたen:Chris Eliopoulosが参加した。ロサンゼル¥スでのパーティーは、ハリウッドのメルトダウン・コミックスで行われ、こちらにはマーベル・コミックのテレビ部門のチーフであるジェフ・ローブや、ダンカン・ルロー、スティーブン・T・シーグル、この番組のパイロット版を手掛けたポール・ディニのほかにも、声優のクラーク・グレッグとミスティ・リーも来た。
本作を基にした漫画 Ultimate Spider-Man Adventures(ストーリー:en:Dan Slott&en:Ty Templeton、作画:Nuno Plati)が2012年4月25日から開始され、同じくテレビ番組を基にした作品 The Avengers: Earth's Mightiest Heroes Adventuresとともに現在も連載が続いている。
声 - / 英:ジェームズ・アーノルド・テイラー
グランドマスターに召喚されたヴィラン。第75話、第76話、第77話、第78話「真のチャンピオン決定戦」2回戦でレッドハルクを倒すが、アイアンフィストに倒される。