ルーニー・テューンズ
吹き替え:石丸博也⇒玄田哲章
鶏のキャラクター。かなり大柄。おしゃべりでジョークやギャグばかりを言うが、自分はおしゃべりではないと思っている。スティーブン・フォスター作曲の「草競馬」をよく口ずさんでいる。一見、迷惑な奴に見えるが、情に厚く、ヘンリー・ホークの嘘の身の上話を信じてしまうような素直さを持っている。よくバーンヤード・ドッグにちょっかいを出して遊んでいる。「そりゃお前」を言葉の前につけて話すのが癖。
吹き替え:武藤礼子(まんがキッドボックス放送時)⇒広川太一郎(「マンガ大作戦」)⇒(原語版流用)
アメリカの野鳥オオミチバシリをモデルとしたキャラクター。道路の上を高速で走り回っている。「ミッミッ(Beep! Beep!)」と車のクラクションのような声で鳴く。コヨーテとは文章が書かれたプラカードを提示しあうことで意思の疎通ができる。「ロードランナーは字が読めない」というプラカードを出したことがあるが、その後何度も標識やコヨーテとのやり取りで文章の意味を理解しているので字は読める模様。基本的に喋らない。また、コヨーテの描いた絵の中に入っていったり、つり橋のロープを切られても逆につり橋を繋いでいた岩場が落ちていくなど、物理の法則を無視することができる。かつてはクライスラー社のスポーツカー、プリムス・ロードランナーのマスコットキャラ契約を行い、劇中のミッミッ音をクラクション音として使用して有った。なお、ロードランナーの翻訳はプラカードを読んだりと主にナレーターが担当しており、その際の一人称は「僕」。
吹き替え:鈴木やすし(まんがキッドボックス放送時)⇒江原正士⇒梅津秀行
コヨーテのキャラクター。多くの学名を持つがどれも語呂合わせ。アメリカ南西部の砂漠に住んでいて、いつも腹を空かしている。あらゆる計画や発明品を駆使してロード・ランナーの生け捕りに挑戦しているが不注意な行動が災いし毎回失敗に終わっている。そのたび落下、爆発、激突、下敷きなどの目に遭っているが、決して諦めない不屈の精神と異常と言うに相応しい回復力の持ち主。本物と見間違えてしまいそうになるほど非常に絵が上手く、よく崖の手前に設置した大型キャンバスや岩壁にトンネルや道路の絵を描いてロードランナーを誘導する事があるが、その度にロードランナーは絵の中に入り込んで行ったり、絵の向こう側からトラックなどの大型自動車が通過してくる。しかし、一方のコヨーテだけは絵の中に入れず、入ろうとする度に谷底に落ちたり壁に衝突して粉々になってしまう(稀に逆のパターンもある)。よく計画に役立てるためアクメ社などの企業から通販で商品を購入しては使いこなせなかったり、不良品や粗悪品を掴まされている。なお、コヨーテの翻訳はロードランナー同様主にナレーターが担当しており、その際の一人称は「俺」。
普段は叫び声以外は口にせず看板で話すなど寡黙な印象が強いが、『コヨーテ 天才の証明』でバッグス・バニーと共演した時や『タイニー・トゥーンズ』では普通に喋っている。実は饒舌でエリート意識が高い。本来の姿はIQ207の超天才を自称する気取り屋。一見、ロードランナーと仲が悪いように見えるが『バッグス・バニー・ショー』の楽屋(カメラが入ったのに気づいた際はいつものように追いかけっこをした)や『ロジャー・ラビット』などプライベートでは、肩を組むほど仲良しである。
アメリカン・アニメーションの黄金時代が舞台となる本作では、実在するアニメーション短編・長編映画のキャラクターが会社の垣根を越えカメオ出演した。ルーニー・テューンズのキャラクターも多数貸し出されたので、バッグス・バニーとミッキーマウス、ダフィー・ダックとドナルドダックといった夢の共演が実現した。