アルティメット・スパイダーマン
声 - 甲斐田裕子 / 英:タラ・ストロング
声 - / 英:スティーヴン・ブルーム
甲虫型のアーマーを着た雇われ犯罪者。常に台詞を発しない。第16話「エムジェイの面接日」にて初登場。何者かにジェイムソン暗殺の依頼を受けデイリー・ビューグル本社を襲撃した。
第55話「エージェント・ヴェノム」では、タスクマスターからヴェノムを回収するよう命じられ、フラッシュに接触する。
声 - 佐藤美一 / 英:ディー・ブラッドリー・ベイカー
第17話「雪の日のバカンス」にて初登場。
砂を操る悪党で、逃走中にミュータント化した。子供の姿、大人の姿、サンドマン本来の姿、砂人間と、いくつかの種類の姿になれる。
陸地が広ければ広いほど力を増すことから、フューリーによってとある無人島に捨てられて以来フューリーをひどく憎んでいた。寂しさのあまり、無人島を訪れたピーターらの目の前に子供の姿であわられ、「かくれんぼをしよう」と誘うも、登場や誘い方を怪しんだピーター達に断られて逆上した。その後、スパイダーマンのスーツの中に入っていた砂がサンドマンになり、凍った川を渡って陸地を目指したが、直前にノヴァの攻撃でガラスに変化して動かなくなった。
第75話、第76話、第77話、第78話「真のチャンピオン決定戦」では2回戦で登場。レッドハルクに倒される。
第4シーズン(シーズン4)では、ヴァルチャーを追って孤島に来たスパイダーマンとアイアン・スパイダーを襲撃する。アイアンスパイダーから悪党だと決めつけられていたが、のちにドクター・オクトパスによって監禁されていて、襲った個体群もドクター・オクトパスの支配下にあるものだったことが判明した。同じく監禁されたアイアンスパイダーの助力もあってドクター・オクトパスから解放され、スパイダーマンの計らいによってシールド・アカデミー入りした。
声 - / 英:ロバート・クロットワーシー
グウェンの父。
第3シーズン(シーズン3)にてスパイダーマンが中心となって結成した若手ヒーローチームで、アイアンフィストをはじめとするレギュラー4人や、エージェント・ヴェノムも含まれる。全員S.H.I.E.L.D.アカデミーに通っている。
声 - 宝亀克寿 / 英:ドワイト・シュルツ
第9話(第10話)「スパイダーマンはウルヴァリン?」にて初登場。精神操作を得意とし、ウルヴァリンとスパイダーマンの精神を入れ替えた。
第40話「超人スパイダー・ハルク」でS.H.I.E.L.D.に拘束された状態で再登場し、スパイダーマンとハルクの精神を入れ替える実験に参加するが、トラブルに見舞われ、ヘリキャリアから脱走した。
第69話「ブリトー入手作戦」では、ショッカーをはじめとするヴィラン達を洗脳して携帯電話の電波の周波数を自らの精神操作の波長に合わせさせ、携帯電話を通じて一般市民を洗脳した。
声 - 中村浩太郎 / 英:ロバート・パトリック
キャプテンアメリカの戦友である老年の男性で、S.H.I.E.L.D.アカデミーの教官を務めている。超高速移動を武器にヒーロー活動を行ってきた。
声 - 青木崇 / 英:ベンジャミン・ディスキン
ヒドラの科学者。第86話「アンチ・ヴェノム」で初登場した際、ドック・オックと共同で新たなシンビオートを産み出す研究をヒドラから命じられる。アンチ・ヴェノムが完成した後、スパイダーマンに追い詰められて中和剤を渡した。
第93話、第94話、第95話(第91話、第92話、第93話)「カーネイジの脅威」ではこれまでドック・オックがしてきたことに対する仕返しとして、完成したシンビオート「カーネイジ」を取りつかせたが、同時にドック・オックが調合した薬品を浴び、ヴァンパイアと化す。一度はラボから脱走するが、高校でカーネイジクイーンと化したメリージェーンを操り、スパイダーマンらと対峙した。薬品を浴びた直後は蝙蝠のような姿をしていたが、高校でスパイダーマンらと再会したときは、よりヴァンパイアに近い姿に変化していた。
声 - / 英:ノーラン・ノース
脚本家兼プロデューサーのポール・ディニによると、この番組はスパイダーマンの設定を一新しており、番組内容はスパイダーマンが毎回様々なゲストキャラとともに活躍を繰り広げるというものになっている。多くの回は、『アルティメット・スパイダーマン(英語版)』を手掛けたブライアン・マイケル・ベンディスの漫画が元になっているが、一部ヒーローやヴィランのオリジンなどは番組オリジナルとなっている。実際、この番組におけるスパイダーマンはニック・フューリー率いるS.H.I.E.L.D.の一番新しいメンバーであり、同年代の4人のスーパーヒーローとともにチームを組んでいる。また、2011年に行われたサンディエゴ・コミコンでは、ヴェノムのほかにもDr.ドゥームやリビングレーザーといった様々な悪役も登場する予告編が公開された。
原作コミックにも『アルティメット・スパイダーマン(英語版)』という通常のマーベル作品とは異なるパラレルワールドを舞台としたリブートシリーズが存在するが、本作はアニメオリジナルの設定で、コミック版と直接の関連性はない。
2013年7月20日のサンディエゴ・コミコンにて、マーベル・コミックとディズニーXDは第3シーズン(シーズン3)の放送を発表した。第3シーズン(シーズン3)はテレビアニメ『アベンジャーズ・アッセンブル』に合わせた内容になっており、スパイダーマンがアベンジャーズ入りし、新ヒーローチーム結成を描いた内容になっている。それに合わせて、クローク・アンド・ダガー(英語版)やアマデウス・チョ(英語版)、エージェント・ヴェノム(英語版)といった新キャラクターも登場する。
声 - 森田了介 / 英 - イマリ・ウィリアムス 骨も切り裂く鋭い棘を身体中に持っている。
声 - / 英:ピーター・ルーリー
ウルヴァリンの宿敵。