参預会議
孝明天皇は熱心な攘夷論者であり、国政の諮問にあたる参預会議でも通商条約の破棄(破約攘夷)・海外貿易を許可した諸港の閉鎖(鎖港)が議題となった。しかし参預諸侯は元来開国的な考えを持っており、そもそも攘夷は不可能であることを認識していたため、鎖港には反対であり、かえって天皇の失望を買う。この時期、一部の攘夷派を除き、すでに諸外国との条約破棄は非現実的と見なされており、「攘夷」の具体的施策は兵庫(神戸)港の開港阻止、および横浜港の鎖港を意味するようになっていた。
一方、元々諸外国と条約を締結して開国を行った当事者である幕府も攘夷には反対していたが、前年の家茂上洛の際、孝明天皇から攘夷実行を約束させられており、すでに文久3年(1863年)12月に不可能を承知の上で横浜鎖港の交渉のため、フランスへ外国奉行・池田長発を全権とする交渉団(横浜鎖港談判使節団)を派遣していた。参預会議においても、当初横浜鎖港に難色を示していたはずの慶喜が、薩摩藩の擡頭を警戒し、久光の主張には同調できないとして、ことさら横浜鎖港の実行を主張することになる。2月15日に行われた参預会議では、久光と慶喜がこの問題で激しく衝突した。
慶喜は3月25日に将軍後見職を辞し、朝廷から新設の禁裏御守衛総督(摂海防禦指揮を兼任)に任ぜられ、二条城において江戸の幕府から距離を置き、独自の行動をとるようになった。この後慶喜は、松平容保および京都所司代となった松平定敬(桑名藩主)とともに、幕府中央とは半ば独立した勢力を構築するようになる(一会桑政権)。なお、フランス派遣の幕府使節は予想通り交渉不調で帰国、独断でパリ約定を結んだ池田長発や田辺太一ら使節団は処罰されるが、その後幕府も一会桑も横浜鎖港を積極的に推進することはなかった。
一方、久光主導による薩摩藩の幕府改革路線も参預会議の崩壊によって頓挫し、以後同藩は幕府より朝廷への支持に傾斜していく。同年の禁門の変の後には、倒幕も見据えて幕府弱体化を企図し、雄藩連合路線で政治運動を行っていくことになった。