ウイルス定量
フォーカス形成アッセイ(FFA)はプラークアッセイの一部であるが、FFAはウイルス抗原に特異的な蛍光標識抗体を使用して、感染した宿主細胞とプラークが形成される前の感染ウイルス粒子を検出する免疫染色技術を用いる。 FFAは、プラーク形成と異なり細胞溶解を必要としないことから、細胞膜を溶解しないプラークアッセイに適さないウイルス種の定量に特に用いられる。プラークアッセイと同様に、単層の宿主細胞に段階希釈したウイルスサンプルを感染させ、感染性ウイルスの拡散を制限する半固体重層培地の下で比較的短い培養時間(24〜72時間など)インキュベートし、局所的な感染細胞のクラスター(フォーカス、病巣)を形成する。続いてプレートをウイルス抗原に対する蛍光標識抗体で染色し、蛍光顕微鏡を使用してフォーカスの数を数え、定量する。 FFA法では、通常、プラークや50%組織培養感染量(TCID50)アッセイよりも短時間で結果が得られるが、必要な試薬や機器の点で高価になることがある。測定時間は、測定者が数える領域のサイズにも依存する。より大きな領域はより多くの時間を必要とするが、より正確な値となる。 FFAの結果は、ミリリットルあたりのフォーカス形成単位(FFU/mL)として表される。
ポアソン分布は、一定の空間において、既知の平均発生確率で発生するランダムなイベントの発生回数を表す確率分布である。観測された陰性のウェルは感染イベントが0回発生したとみなされることから、P(0)は陰性のウェルの比率であり、mは体積あたりの感染単位の平均数(PFU/ml)であることから、P(0) = eである。TCID50として表される力価の場合、P(0) = 0.5であるから、e = 0.5、すなわちm = -ln 0.5であり、これは約0.69と計算される。ただし、実際には、この関係は同じウイルスと細胞の組み合わせでも当てはまらないことがある。これは、2種類の測定法の測定条件が異なることや、ウイルスの感染力は細胞年齢、重層培地等に非常に影響を受けやすいことによる。しかし、次の文献では、この関係を異なる形で定義している。同じ細胞系を使用し、ウイルスがそれらの細胞上でプラークを形成し、プラーク形成を阻害するような処置を加えないと仮定すると、1 mlのウイルスストックはTCID50の約半分の数のプラーク形成単位(PFU)を持つことが予想される。これは推定に過ぎないが、添加した細胞層の50%に感染する限界希釈液では、感染した細胞層に最初に1つのプラークができると予想されることが多いという根拠に基づいている。場合によっては、偶然にも2つ以上のプラークが形成されることもあるので、実際のPFU数は実験的に決定されるべきである。(ATCC - Converting TCID50 to plaque forming units PFU-124を参照)