ペプチド合成
組み換えDNAから産生されるペプチドは細胞の機能に影響して増殖を不可能にしてしまうことがある。そのためオペレーターによって遺伝子の発現は抑えられている。インデューサーを添加することによって遺伝子が発現し、ペプチドの産生が開始される。
産生されるペプチドはDNAの導入されたベクターによって欲しいペプチドそのものではないことがある。ソマトスタチンの例ではβ-ガラクトシダーゼの遺伝子の途中にソマトスタチンの遺伝子を挿入したため、ソマトスタチンのN末端側にβ-ガラクトシダーゼのN末端側アミノ酸配列の一部が結合した融合タンパク質として得られてきた。なお、ガラクトシダーゼのC末端側の配列はソマトスタチンの遺伝子の終止コドンによって翻訳が停止するため付加されない。ソマトスタチンの遺伝子の手前にメチオニンのコドンを導入しておき、臭化シアンでこのメチオニンを分解することによってソマトスタチンの切り出しを行なっている。他にペプチダーゼの酵素認識部位をコードする遺伝子を導入しておき、ペプチダーゼで目的のペプチドを切り出す方法なども知られている。
低温でカルボキシ基にクロロギ酸エステルやカルボン酸クロリドを反応させて混合酸無水物とし、これにアミノ酸を反応させる方法が混合酸無水物法である。非常に反応活性が高いため、かさ高いアミノ酸同士の結合など縮合剤による方法では反応が進行しない場合でも反応が進行することがある。
目的とするペプチドを産生している細胞内には、そのペプチドの翻訳元であるmRNAが必ず存在しているはずである。まず、その細胞内に存在するすべてのmRNAを混合物として取り出した後、mRNAの3'末端のポリアデノシン一リン酸配列に結合するオリゴデオキシチミジン一リン酸の5'末端に後でベクターと結合させるために必要な制限酵素認識配列を結合させたDNA断片をプライマーとして加え、逆転写酵素によりcDNA(にプライマーが結合したもの)を調製する。こうして調製したcDNA混合物に対し、目的のcDNAと結合する塩基配列に制限酵素認識配列を結合させたプライマーを添加してPCR法を行う。すると目的とするcDNAのみが増幅されて得られる。得られるcDNAは目的とするアミノ酸配列をコードする塩基配列の前に制限酵素認識部位を、後ろにポリアデノシン一リン酸配列と制限酵素認識配列を結合したものになる。
例えばBzl(4Me)基は強酸で脱保護され、Acm基は強酸で脱保護されないがヨウ素で選択的に脱保護されると同時にジスルフィド結合を形成する。そこでジスルフィド結合をつくりたい2対のシステイン残基がある場合、それぞれの対をBzl(4Me)基とAcm基で保護する。まず最初に強酸でBzl(4Me)基を脱保護した後、ジスルフィド結合の形成を行うと1対目のジスルフィド結合が選択的に形成される。そのあとでヨウ素で処理すれば、もう1対のジスルフィド結合も選択的に形成することができる。
アルギニンのグアニジノ基は求核性が強いため、電子求引基であるスルホニル基を保護基として末端のアミノ窒素と縮合させて反応性を落とす。 p-トルエンスルホニル基(p-Ts)などが使用される。
ヒスチジンのイミダゾール環は求核性を持ち、また塩基性によりα-炭素のエピ化を促進する。π-窒素をベンジルオキシメチル基(Bom)やtert-ブトキシメチル基 (Bum) で保護したり、τ-窒素を2,4-ジニトロフェニル基 (Dnp)、トリチル基などで保護する。なおこれらの保護基を脱保護した際に生じる副生成物はスルフヒドリル基と強い親和性を持つ。