ポルトガル王女イザベルの肖像
イサベル・デ・ポルトゥガル・イ・アラゴンは1503年にポルトガル国王マヌエル1世と2度目の王妃マリア・デ・アラゴン・イ・カスティーリャとの間に生まれた。彼女がカール5世と結婚したのは1526年のことである。政略結婚ではあったが夫婦の仲は良かった。カール5世は広大な帝国を統治するため各地を遍歴したが、結婚後は7年間スペインに留まった。その後カール5世は1529年から1533年4月までスペインに戻らず、2年間スペインに留まったのち1536年末に再び出発した。カール5世との間にはスペインの最盛期を築き上げたフェリペ2世を含む3人の息子と2人の娘が生まれた。夫が留守にしている間、イザベルは摂政としてスペインを統治し、その政治的手腕を発揮した。しかし彼女は若くして世を去ることとなる。1539年、イザベルは7度目の妊娠をしたが、熱病のため子供は死産し、その2週間後の5月1日に35歳で死去した。このときカール5世は40歳、フェリペ2世は13歳であり、カール5世はイザベルの死に立ち会うことができなかった。その後、カール5世が再婚することはなかった。カール5世は1556年に退位すると、マドリードから遠く離れたカセレス県のユステ修道院に隠棲した。カール5世が死去したのはその2年後の1558年9月21日であった。その手にはイザベラが死去したときに持っていた十字架が握られていたという。
イザベルが1539年に死去したとき、妻の肖像画がないことに気づいたカール5世はかつてイザベルがマルグリット・ドートリッシュに送った肖像画を取り戻そうとした。同年11月、カール5世は妹のマリア・フォン・エスターライヒから肖像画を受け取ったが、イザベルと似ていなかったことに不満を感じた。そこでカール5世は生前のイザベルを描いた図像があれば、ティツィアーノに肖像画を依頼することができると考えた。
1543年、ピエトロ・アレティーノによれば、カール5世はブッセートにいたティツィアーノにイザベルの小さな肖像画を送った。この肖像画は、おそらく現在はポーランドのポズナン国立美術館(英語版)に所蔵されているウィリアム・スクロツ(英語版)が制作したものと考えられている。ティツィアーノはこの肖像画に基づいて2年後の1545年にイザベルの肖像画を完成させた。そこではイザベルは黒い服を身にまとい、膝の上に花を載せた姿で描かれており、彼女の背後には王冠が置かれていた。しかしカール5世は肖像画の鼻に不満を感じ、1547年に絵画をアウグスブルクに運んでティツィアーノに修正を依頼した。