膜電位感受性色素
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↑ http://www.
膜電位感受性色素の光学的変化のメカニズムについての研究は、生理学的研究と直結するものではないが、よりすぐれたポテンシャル・プローブとしての色素をデザインして、開発、合成するという面から重要である。そのメカニズムについては、すでにRossら (1977), TasakiとWarashina (1976), WaggonerとGrinvald (1977) およびDragstenとWebb (1977) によって論じられてきてはいるが、まだ完全に解明されているわけではない。 活動電位のような迅速な電位変化をモニターする、いわゆるfast-response dyesについては、可能性の大きい仮説(モデル)として、現在、次の2つが提出されている。
その1つは、A. S. Waggoner (1979) により提出されたもので、細胞膜に吸着した色素分子は、モノマー ダイマーの平衡状態にあり、静止電位の状態ではこの平衡はダイマーの方向へ傾いている。膜が脱分極状態となると、平衡はモノマーの方向へ移る。これに続いて色素の発色団 (chromophore) は双極子のようにふるまって回転し、その配列を変える。これに伴って色素の吸光スペクトルの移動や螢光の変化が引き起こされると考えるのである。実際、merocyanine-rhodanine系色素で染色したイカ巨大神経線維の実験で、神経線維の軸に対して垂直偏光で入射した場合と平行偏光で入射した場合とでは吸光変化のスペクトルに大きな違いがみられる (Gupta, et al, 1981)。これは色素の発色団の回転と再配列の可能性を示唆している。
intactの測定は両生類の場合と同じように、皮質におけるニューロン応答に限られている。これは、現在の光学的測定が二次元計測に限られ、三次元的計測に弱いという方法論的制約によるものであり、その適用の限界を示すものでもある。
Orbachら (1985) は、大脳皮質を露出した“まるごと”のラットを頭部が対物鏡の下になるようにして、顕微鏡の載物台の位置に固定し、口ひげを動かしたときの体性感覚野皮質でのニューロン応答と、眼球に光照射したときの視覚野皮質でのニューロン応答を、それぞれの124カ所の部位から記録した。皮質の染色にはstyryl系のRH414が用いられ、ニューロン活動は落射法により螢光シグナルとして測定されている。この測定によって、口ひげを動かした距離や、その持続時間により応答の空間的パターンが変化するという興味ある結果が得られている。なお、まるごとの動物を用いた大脳皮質におけるニューロン応答の測定では、この実験が最初のものである。これによって、光学的測定法を哺乳動物の中枢神経系にも適用できることが示された。slices : これに先鞭をつけたのはGrinvaldら (1982b) によるラット海馬スライスでの測定であり、これによって、海馬の研究に新しいルートがひらかれた。ラット脳から切り出された海馬のスライスをmerocyanine-rhodanine系色素 (WW401) で染色して、透過光の変化を10×10-素子のphotodiode arrayでdetectして、CA1錐体細胞におけるニューロン活動を見事に捉えている。
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このような一連の実験結果から、 「膜電位に感受性を持つ色素 (voltage-sensitive dyes) を膜電位のプローブ (potential probe)として膜電位を光学的に測定する方法」 のアイデアがはっきりとした形となり、Cohenの研究室で、まず、ポテンシャル・プローブとしてできるだけすぐれた膜電位感受性色素の探索が始められたのである。ここに至るまでのいきさつについてはCohen (1973), Cohen and DeWeer (1977), Cohen and Salzberg (1978) による総説に詳しく述べられている。 色素のスクリーニングが始められたとき、色素の化学構造とか物理化学的性状と膜電位感受性色素との相関性はもとより、どのような、そして、どれくらいの色素が膜電位に感受性を示すのか、皆目わからなかった。そこで、Cohenらは、ありとあらゆる色素を枚挙的に網羅してスクリーニングテストするという方法をとった。ヤリイカの巨大神経線維をいろいろな色素で染色し、それに膜電位固定を行い、それに伴う吸光、螢光の変化を測定して、膜電位変化に対する感受性がテストされた。そして、得られたデータから色素の構造と膜電位感受性との相関性を類推しながら、新しい色素を試行錯誤的にデザインし、それを合成して、ヤリイカの神経線維でテストを繰り返し、そこから得られた結果に基づいて、さらに新しい色素を合成していくという方法で進められた (Cohen, et al, 1974 ; Ross, et al, 1977 ; Gupta, et al, 1981)。 新しい色素の合成は A. S. Waggonerの研究室と日本感光色素研究所(現 林原生物化学研究所)の協力を得てなされた。
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