ゲル内消化
基本的には脱染色・還元アルキル化・タンパク質分解・抽出の4ステップで構成される。
続いてシスチンを還元しシステインをアルキル化する。これによりタンパク質にジスルフィド結合が存在していたとしても不可逆的に解離することになり、タンパク質分解に適したほどけた構造になる。還元にはジチオトレイトール(DTT)や塩酸トリス2-カルボキシエチルフォスフィン(TCEP)のように、スルヒドリル基やフォスフィン基をもつ化合物が用いられる。その後ヨードアセトアミドを用いてチオール基をアルキル化することで、システインはS-カルボキシアミドメチルシステイン(分子量160.03)となる。
この化学修飾により、ジスルフィド結合の多いタンパク質でも、高い収率と配列カバー率で同定することができるようになる。もっともたいていのタンパク質ではシステインはそれほど多くないため、還元アルキル化処理が同定結果に大きな影響を及ぼすことはない。 定量的で均一なアルキル化のためには修飾するタイミングが重要である。変性条件で電気泳動する場合、電気泳動の前にアルキル化することが推奨される。これはゲル中に存在するアクリルアミド単量体がシステインを修飾してしまう恐れがあるからである。 これによって生じるアクリルアミド付加体(分子量174.05)は取り除くことができない。この場合、チオール基の保護をアクリルアミド修飾で統一することにより、質量分析時のダブルピークを避けることができる。またPMF法などの場合には、データベース検索の際にアクリルアミド修飾の可能性を疑うことにより、ペプチド断片の質量変化をある程度吸収することができる。