新選組!
演:荘司優希
長州藩の支藩の長府藩士。薩長同盟を結ぼうと上洛した坂本龍馬の護衛を行う。寺田屋に宿泊中襲われた坂本と共に戦う。
演:中村福助
第121代天皇。攘夷を願っているが、過激なことは好んでいなかった。京の治安を守る松平容保を何よりの頼みとし、錦の衣を与え陣羽織を作らせた。14代将軍家茂の死後、後を追うように亡くなった。その死は新選組の将来に大きな影響を与えた。
演:岩崎加根子
近藤ふでと牛込の置屋で一緒に働いていた古い友人でありかつての芸者仲間。ふでが勇とつねと縁談の件で周助と喧嘩をして家を飛び出した際にはなつの家に向かった。なつの口添えもありふでは試衛館に戻った。その際に「息子いじめもほどほどにしなさい」とふでをたしなめた。居候が増え、嫁のつねが口答えするようになったことなどに腹を立てたふでは再び家を飛び出した時は再びなつの家に世話になった。
後に自分の家を周助・ふで夫妻の隠居先として提供して三人で暮らす。京へ旅立とうとする勇がふでに挨拶をしようとした時、「言いたい事は、後に残さない方がいいわよ」と促し、二人のわだかまりを解く懸け橋となった。
演:矢部太郎
井上源三郎に誘われ、病弱で江戸に帰る気力がないという理由で壬生浪士組に参加する。
壬生狂言を見に会津藩公用方が訪れた際に体調が悪く、席を外している時に佐々木の配下の柳が芹沢・近藤への牽制の為、殿内・根岸に同志を募るよう告げているのを目撃し、それを近藤たちに告げる。その後、大津の親戚の元で静養する為に隊を離れた。彼の脱退をもって、壬生浪士組は近藤派・芹沢派で完全に二分される事となる。
演:森田ガンツ
幕臣。捕縛された佐久間象山を尋問する。
香取が出演するテレビ朝日系の番組『SmaSTATION-4』では、香取や所属するSMAPのメンバーが出演したドラマ・映画のプロモーションを兼ねて共演者がスタジオに登場することがあり、『新選組!』の主要キャストも例に漏れず最終回放映前日に番組出演したが、NHKの作品を他局の番組で本編映像も織りまぜながらプロモーションするというのは異例であった。また、フジテレビ系の番組『笑っていいとも!』では香取がドラマの衣装で登場したこともある。最終回の翌日の関西テレビ・フジテレビ系『SMAP×SMAP』では脚本・三谷、主演・香取のパロディコント「局長!」が作られた。2007年7月29日には、フジテレビ系『FNS27時間テレビ みんな なまか だっ!ウッキー!ハッピー!西遊記!』内で放送された『クイズ!ヘキサゴンII 今夜はクイズパレード』において、新選組代表として香取、山本耕史、山本太郎、山口智充、小林隆、矢部太郎がドラマの衣装で出演している。2015年に放送された朝の連続テレビ小説『あさが来た』では、山本が本作と同じ衣装を着用し土方を演じた。 2022年10月29日に放送された『ワルイコあつまれ 秋の大感謝祭SP』では、同番組内コーナーである『慎吾ママの部屋』にて、山本が土方歳三として出演。同コーナーにおいて香取は慎吾ママに扮しているものの、山本と香取が『かっちゃん』『トシ』と呼び合う、香取が近藤勇として山本扮する土方歳三に語りかける等、当時の視聴者層を沸かせる演出が盛り込まれた。
演:瑳川哲朗
大坂小野川部屋親方。冷静かつ良識的な性格で、小野川部屋の力士猪熊が芹沢に傷を負わされた時は、報復を申し出る力士達に「奉行所に届けて沙汰を待つ」と諭す。
しかし、これを機に浪士組の壊滅を目論んだ内山によって力士達が唆された事で、再び乱闘が起き、熊次郎が殺されるなど大きな被害を受けた。後に謝罪に訪れた近藤の実直な人柄に感心し、自ら和解を申し出た上、熊次郎の弔問を希望した近藤を快く受け入れた。
演:高橋一生
桑名藩主。松平容保の実弟。京都所司代として守護職の兄を助ける。
演:佐藤B作
大目付、のち若年寄格。長州処分を決めるため、広島に向かう。その際に近藤、伊東達も広島へ向かう。しかし長州藩との交渉は決裂する。大政奉還の後に坂本龍馬の訪問を受け、徳川慶喜を中心とする政権構想を聞いたことから、坂本が徳川にとって必要な人物と認識し、幕臣に反感を持たれていた坂本を守るよう、近藤に指示する。王政復古の大号令の後は、見廻組を新遊撃隊、新選組を新遊撃隊御雇とした編成替えを伝える。しかし、近藤は二条城から伏見への配置換えを永井に命ぜられた際、新遊撃隊御雇の名を返上した。鳥羽・伏見の戦いの後は、近藤に慶喜が江戸に戻ったことを苦々しげに告げる。
『新選組!! 土方歳三 最期の一日』では箱館奉行として登場。土方はじめ新選組の隊士たちに生き延びるべきと説く。最終的には新政府軍に敗れるのが確定する中、それまで共に戦ってきた者達に向けて、生き延びる道を作るべく降伏のための交渉に取り掛かる旨を言う。
演:増沢望
坂本龍馬と共に薩長同盟に尽力する。龍馬と共に近江屋で暗殺される。斬られてしばらくは息があり、近藤の意向で龍馬を救出すべく踏み込んできた原田左之助が伊予弁で「こなくそ」と叫んだのを聞いたことから彼が刺客と勘違いし、皮肉にも近藤を土佐藩士の仇敵に仕立て上げてしまう。
演:小日向文世
日野宿の名主。土方歳三の義兄にあたる。近藤勇とは義兄弟の契りを結んでいる。酒に弱い。新選組を支援する。春日隊を組織し、甲陽鎮撫隊に加わった。終盤勇が官軍に捕らわれ斬首されると知ったときには、我を忘れて救出に向かおうとした。
演:三谷昇
砲兵隊長。鳥羽・伏見の戦いの際、まるで戦国時代のような旧式の鎧冑姿で参戦し、土方に「いつの時代の人間だよ」とぼやかれる。戦が始まると、薩長軍の火力の前に傷を負い担架で運ばれていった。
演:政岡泰志
八月十八日の政変を前に会津藩との連絡役を務める。