ニトロゲナーゼ
ニトロゲナーゼは原核生物(細菌、古細菌)に広く分布しており、ゲノム解析や微生物生態学的アプローチからもその分布範囲は拡大の一途をたどっている。しかしながら、窒素固定の研究の特に進んでいる微生物群については嫌気性細菌、シアノバクテリアそして根粒菌が主としてあげられる。また、その生活様態から共生的窒素固定生物と非共生的窒素固定生物に分類される。
非共生的窒素固定生物
絶対嫌気性細菌・・・Clostridium, Desulfovibrio, Desulfotomaculum
通性嫌気性細菌・・・Klebisiella, Bacillus
好気性細菌・・・Azotobacter, Azomonas, Beijerinckia
光合成細菌・・・Chromatium, Rhodospirillum, Rhodobacter
シアノバクテリア・・・Anabaena, Nostoc, Gloeocapsa
ニトロゲナーゼの窒素固定反応は以下のように表される。大気中の窒素を還元し、アンモニアとして固定化する。アンモニアとして固定された窒素は他の細菌によってグルタミン酸塩や硝酸塩に変換され、植物が利用可能な形となる。
N2 + 8H + 8e + 16 ATP → 2NH3 + H2 + 16ADP + 16Pi・・・反応式2
上述のアンモニア生産反応との相違点は、ニトロゲナーゼの反応特異性の低さによる。ニトロゲナーゼの代表的な副反応の一つとしてATPの加水分解と共役したプロトン還元活性(水素生産)があり、本活性は還元的ATPアーゼ活性と呼ばれている。
2H + 2e + 4ATP + 4H2O → H2 + 4ADP + 4Pi・・・反応式3
この還元的ATPアーゼ活性と反応式1が合わさり、見かけのニトロゲナーゼ活性である反応式2の反応が得られる。なお、反応式2は至適条件における式であり、実際の生理状態においては20 - 30ATPが必要であるとされている。
ニトロゲナーゼ反応に用いられる電子は主要な代謝系(発酵、ピルビン酸の酸化など)によって還元された電子伝達体によって供与される。嫌気性のグラム陽性菌であるClostridium pasteurianumはフェレドキシンを電子供与体として用いている。また、Azotobacter vinelandiiのような共生的な窒素固定微生物は、フェレドキシンと比べて酸化還元電位の高いフラボドキシンを用いている。また、根粒菌やThiocapsa roseopersicinaのような光合成細菌においては、還元的ATPアーゼ活性によって生じた水素をuptake-ヒドロゲナーゼによって再酸化し、電子供与体の再還元に用いている。
還元的ATPアーゼ活性にも示されるようにニトロゲナーゼは反応特異性が低く、様々な窒素あるいは有機化合物を触媒できる。主要なものとして、一酸化二窒素、シアン、アセトニトリル、アジド、アセチレン、シクロプロペン、シアナミドそしてジアジリンなどがある。
N2O + 2H + 2e → N2 + H2O
CN + 7H + 6e → CH4 + NH3
CH3NC + 6H + 6e → CH3NH2 + CH4
N3 + 3H + 2e → N2 + NH3
C2H2 + 2H + 2e → C2H4
CH2CHCH + 2H + 2e → CH2CH2CH2
H2N-CN + 6H + 6e → NH3 + CH3NH2
CH2NN + 6H + 6e → CH3NH2 + NH3
上記の反応の中で窒素を生産する一酸化二窒素のみが拮抗阻害剤であり、他の基質は非拮抗阻害剤となる。一酸化二窒素の還元によって生じた窒素は、そのまま通常の窒素固定化反応に用いられる。アセチレン還元反応はニトロゲナーゼの簡易測定法として有効であり、生じたエチレンをガスクロマトグラフィーによって分析することによってニトロゲナーゼ活性を検出することができる。また、根粒菌による窒素固定化について、窒素の安定同位体であるNを蓄積する現象が知られているが、その理由については現在説明は得られていない。