核酸医薬
代表例が収束超音波法(high-intensity focused ultrasound、HIFUまたはFocused ultrasound、FUS)である。収束超音波法は外科的処理を必要とせず一過性にタイトジャンクションに作用して送達される。しかし収束超音波法は無菌性の炎症を誘発すると報告されている。トリセルラータイトジャンクションに存在するangulin-1に結合するウェルシュ菌のイオタ毒素由来のリコンビナント蛋白質angubindin-1を利用してASOを中枢神経系へ送達したという報告もある。
また脳血管内皮細胞自体を標的としたデリバリーも選択肢の一つとなる。脳梗塞や多発性硬化症といった脳血管内皮細胞が病変の場となる疾患だけでなく、アルツハイマー病などの神経変性疾患においても脳血管内皮細胞が病変の一端を担っているという報告がなされている。脳血管内皮細胞に対する標的遺伝子の発現抑制の方法としては、siRNAを大量の輸液とともに静脈内投与することで圧力をかけて投与する方法(ハイドロダイナミクス法)やHDLをベクターとしてコレステロール結合siRNAを静脈内投与する方法が報告されている。血液脳関門と同様に血液脳脊髄液関門(blood-cerebrospinal fulid barrier、BCSFB)を構成する脳脈絡叢についても中枢神経疾患の病態への関与が指摘されており、ASOを静脈内投与することによって脳脈絡叢における有効な標的遺伝子発現抑制が報告されている。
脂質ナノ粒子(lipid nanoparticle、LNP)にトランスフェリン受容体に対するモノクローナル抗体を結合させ受容体介在性エンドサイトーシスの機序でASOを中枢神経に送達するという報告もある。
siRNAではペプチドを用いて神経細胞に送達させたという報告がある。またインスリン受容体やトランスフェリン受容体など、脳血管内皮細胞に発現している受容体に対するモノクローナル抗体をリポソームに結合させ、siRNAを内包してデリバリーさせる方法が報告されている。またsiRNAに狂犬病ウイルス外殻の一部の糖蛋白配列(rabies virus glycopretein、RVG)を結合させる方法が報告されている。RVGはアセチルコリン受容体に対するリガンド配列となっており、アセチルコリン受容体は脳血管内皮細胞および神経細胞に発現していることから、静脈内投与により神経細胞に特異的にデリバリーさせることが可能とされる。RVGをsiRNAに静電的に直接結合させる方法やエクソソームにRVGを発現させ、siRNAを内包させる方法などが報告されている。最大の問題はRVGの合成が容易でなく、医薬品化する際の精製は困難であると考えられている点である。グルコース修飾高分子ミセルといったナノマシンもASOやsiRNAのデリバリー方法となる可能性もある。
核酸自体を修飾するのではなく血液脳関門のタイトジャンクションを制御することでASOをはじめとした高分子医薬品を送達する方法も考案されている。
エクソンスキップ法はRNase H非依存性のASOを用いる。目的のRNAに強固に結合するが分解しない(steric blocking)機序でpre-mRNAを標的とする。スプライシング調節部位に結合することで選択的スプライシングを誘導する方法や5'-cap形成の阻害、3'末端のポリアデニル化調節がよく知られた機序である。特にスプライシング調節を行う核酸医薬はSSO(splice-switching oligonucleotide)と呼ばれsteric blocking法の中では最も開発が進んでいる。遺伝子内でスプライシングの促進・抑制に関わるモチーフはエクソンの内にも外にも存在し、それらモチーフにSSOが結合することでRNA結合蛋白や小核内RNAなどのスプライシング関連因子との相互作用を阻害する。SSOにより選択的スプライシングの調節が行われ、特定のエクソンのスプライシング促進(エクソンスキッピング)、スプライシング抑制(エクソンリテンション)を誘導して、関連疾患蛋白質の調節を行う。SSOはgapmer type ASOと異なりRNase H誘導性は必要がないため、生体内安定性向上のため20~30塩基の全長に人工核酸を用いていることが多い。
しかしそれでもArgonauteによってゆっくりと二本鎖が引きはがされ、Argonauteにしっかりと固定されていない方の鎖、すなわちパッセンジャー鎖が排出されRISCが形成される。このとき、二本鎖RNAのガイド鎖の5’末端から数えて2 - 7塩基目のseed領域あるいは12~15塩基目の3’supplementary領域にミスマッチがあると引き剥がしの速度は飛躍的に向上する。実際、天然のmiRNA/miRNA*二本鎖は中央部分に加えてこれらの領域にミスマッチを含むことが多く、RISC形成における二本鎖RNAの積み込みとパッセンジャー鎖の排出の両方のステップに適した構造をとっているといえる。
RISCの機能
RISCは自身がもつガイドRNAと相補的な標的配列をもつRNAに結合し、標的を切断したり、翻訳の抑制やポリA鎖の短縮などを引き起こす。一般に小分子RNAがどのように働くかはsmall RNAの生合成過程よりもむしろ、取り込まれるArgonaute蛋白質の性質に依存する。いいかえれば、small RNAはArgonauteを標的RNAへ導くガイドとしての働きをしているだけであり、実際の機能を発揮しているのはArgonaute蛋白質である。