DNA複製
細胞分裂におけるミトコンドリアおよび葉緑体の分裂機構に研究において、単細胞紅藻シゾンCyanidioschyzon merolaeがモデル生物としてよく用いられている。C. merolaeにおける研究から、ミトコンドリアと葉緑体のDNA複製は核のそれより先んじて行われ、オルガネラにおけるDNA複製の開始はG1期/S期に特異的なサイクリン依存性キナーゼCDKA (cyclin-dependent kinase A) を活性化し、これが核の複製を開始させることが明らかとなっている。この知見はオルガネラの複製開始をCDKAの活性化につなげるシグナル伝達の存在を示唆する。このような、オルガネラから核へのシグナル伝達をレトログレードシグナルという。
C. merolaeにおいて、葉緑体から発信されてCDKAの活性化を引き起こすレトログレードシグナルのシグナル分子は、テトラピロールの一種であるMg-プロトポルフィリンIX (Mg-protoporphyrin IX:Mg-ProtoIX) である。また、Mg-プロトポルフィリンIXのレトログレードシグナルはタバコの培養細胞BY-2においても確認されているため、このシグナルは高等植物一般である可能性がある。
ウイルスの中には線状ゲノムを末端から複製するという珍しい例が存在する。代表的なのはアデノウイルスとφ29ファージにおける鎖置換である。両3'末端からそれぞれ一本の娘鎖が合成されるが、これは同時期ではない。すなわち、一度の複製フォーク出発に1つのDNAポリメラーゼしか伴わず、別時期のリーディング鎖合成が2回行われる。ほかの生物ならラギング鎖が合成されるだろう5'→3'の親鎖は複製が進み、遊離してもssDNAのまま放置。複製が反対側の末端に到達すると、完全に塩基対が置き換えられた親ssDNAは遊離する。このssDNAも独自に複製されるが、そのためには短くとも3'末端に塩基対が作られ、複製起点が二重らせんであることが必要である。
鎖置換を複製機構とするいくつかのウイルスは、それぞれの5'末端に末端タンパク質が共有結合している。例えば、アデノウイルスではセリンがホスホジエステル結合でつながっている。
#ニックトランスレーションにおけるプライマー除去は真正細菌と異なる過程を経る。プライマー除去には5’→3’のエキソヌクレアーゼが必要だが、真正細菌と異なり真核生物でそれを担うのはDNAポリメラーゼではない。中心的な役割を果たすのはフラップエンドヌクレアーゼであるFEN1(Flap structure-specific endonuclease 1、以前はMF1と呼ばれていた)である。これは岡崎フラグメントの3‘末端でDNAポリメラーゼδ複合体に結合し、その隣接プライマーを分解する。ただし、分解活性はプライマー5’最末端部のリボヌクレオチドにある三リン酸基により阻害される。これを真核生物がどのように乗り越えるかはまだはっきりと判明していない。
実際のプライマー除去機構には様々な仮説が考えられている。その一つは、プライマーの大部分はFEN1ではなくRNアーゼHによって除去されるというものである。RNアーゼHはRNA間のホスホジエステル結合を切断できるが、RNA-DNAのそれはできないという特徴を持つ。そのため、少なくともDNAと隣接する最後のプライマーRNAは残ってしまうはずである。ここで、ホスホジエステル結合切断から生じた5‘末端は三リン酸ではなく一リン酸基なので除去作業はFEN1が引き継ぐ。しかし、RNアーゼを持たない細胞でもラギング鎖複製が行われることが確認された。もう一つの仮説では、ヘリカーゼがプライマーと親鎖間の塩基対を切断し、はがれた部分(フラップ flap )をDNAポリメラーゼδが隣の岡崎フラグメントから伸長して補う。フラップはFEN1が切断する。
複製焦点の形成は、複製起点の点火が空間的にも時間的にも調節されていることにより引き起こされる。Drew M. Pardollらは、哺乳動物の細胞において隣接する複製起点は同時に点火されることを発見した。複製部位が空間的に並列することにより複製フォークの密集化(クラスター化)がもたらされる。クラスター化は、隣接複製起点の一方が点火前に何らかの原因で巻き戻されて点火されなくなる、もしくは複製フォークの進行が阻害されて停止したとき(原因として、転写装置などのDNAと強く結合しているタンパク質との衝突、伸長反応の基質であるdNTPの枯渇、DNA損傷による妨害などがある)に、複製に失敗した領域をもう一方からの複製フォークがすぐに複製に再挑戦するようにするためと考えられている(停止複製フォークのレスキュー)。停止複製フォークのレスキューの機構には、正常なDNA複製には点火されない休眠複製起点の利用もある。
DNAへリカーゼが二重らせんをほどく際、dsDNAによじれ torsion が生じるという重大な問題が発生する。dsDNAは10 bp(10塩基対)ごとに1巻きのらせん(ターン)であるため、10 bp巻き戻すたびに他の領域までも縦軸を中心に1回転する。この回転は、両端の切れた不自然に短い直鎖状のDNAならば問題にならない。しかし、細菌や大多数のウイルスのdsDNAは環状である。そのまま巻き戻そうとすると必ずどこかが強くよじれてしまう。また、真核生物の染色体は直鎖状とはいえ巨大であり、しかも、各所で核マトリックス同士が結合してループ構造を形成している。このループ構造は環状同様に閉鎖的であるため、やはりよじれの発生は必至である。
この結果、自由に回転できないDNAは巻き戻しによるよじれのために、さらに大きならせん(DNA超らせん、あるいはDNAスーパーコイル)が生じる。ちょうど、電気コードの両端を持って数回ねじると大きな輪が生まれるのに似ている(360度回すごとにコードは1回交差する)。DNAらせんは右回りであるため、複製フォークの進行方向で形成される超らせんも右回り(正の超らせん)。正の超らせんが長くなると巻き戻しに対する抵抗となり、複製フォークの進行を止めてしまう。DNA複製がスムーズに行われるためには逆向きの超らせん(負の超らせん)を導入するようDNAを巻き、正の超らせんを中和させればよい。先ほどのねじれたコードで例えると、一方の手を放すと逆方向に回転してねじれのストレスは解消する。
1つの複製起点によって巻き戻しが及ぶ範囲をDNA複製の単位とし、これをレプリコン(replicon)と呼ぶ。この言葉は、フランソワ・ジャコブ、シドニー・ブレナー、Jacques Cuzin らが1963年に提唱した「レプリコン説」で定義された。レプリコン説は、もともと細菌の複製開始(レプリコンの点火)を制御する仕組みのモデルだったが、生物一般に成り立つことがわかっている。
レプリコンには、複製起点を含めたレプリケーターと呼ばれる塩基配列が存在する。レプリケーターは、比較的結合が弱い塩基対であるアデニンとチミンが多いATリッチ配列を含み、イニシエーターと呼ばれるタンパク質がレプリケーター内の複製起点に結合するとATリッチ配列の巻き戻しが起こる。一般に、イニシエーターには少なくとも、複製起点への結合によるレプリコンの点火と、複製開始に必要なほかの因子をレプリケーターに引き寄せることの2つの役割を持つことが知られている。また、イニシエーターには、結合部位近くのDNAを曲げたり、その二重らせんをほどいたりするという第3の働きをして、複製開始後の伸長段階でのヘリカーゼによる巻き戻しを促進しているものもある。例えば、大腸菌のイニシエーターであるDnaAはレプリケーター (oriC) に5つある9bpの反復配列にまず結合してATPによる制御を受けるが、リン酸化前の、ATPと結合している状態のDnaAはoriCに3つある13bpの反復配列にも結合する。その結果、その13bp配列からそれぞれ20bp以上の巻き戻しが起こる。
レプリコンは原核細胞の染色体に1つしかないが、真核細胞の場合は複数存在する。複製の開始位置の分散はDNA複製の早期終結に寄与していると考えられている。
レプリソームとは、DNA複製伸長段階において複製フォークに形成される酵素の総称である。複数の複合体が集合し、1つの「工場」として機能していると考えられている。その詳細が最も明らかになっているのは大腸菌であるが、大腸菌における酵素の構成とそれらの協調的機能を紹介する。
レプリソームにおいて最も重要なのはやはりDNAポリメラーゼだろう。大腸菌においてこれを含み、実際にDNAを伸長させる複合体はDNA Pol IIIホロ酵素である。構成するタンパク質は2つのpol IIIコア酵素とγ複合体(クランプローダータンパク質)、さらにSSBと相互作用するχとφサブユニットである。pol IIIコア酵素はDNAポリメラーゼたるpol III(αサブユニット)と3’→5’方向のDNA修復をするエキソヌクレアーゼ(εサブユニット)、θサブユニット、さらにDNAクランプであるβクランプ(βサブユニット二量体)で構成される。一方、γ複合体はγ、δ、δ’および2つのτサブユニットから成る。見た目から言えば、βクランプを構える5本のサブユニットと、その五本指の手のような巨大部位に伸びている細長いτサブユニットがある。τタンパク質の先端はpol III(とDnaB)に結合し、一方、装着部位との連結鎖は柔軟である。
限られた複製因子を取り合うために、染色体外のリボソームRNAをコードしている多コピーのリボソームDNA (rDNA) 領域と単一コピー領域のDNA複製は競合しており、Sir2がDNA複製される活性なrDNAの複製起点の分布を低く抑えることにより正常なDNA複製が行われる。S. cerevisiaeの複製開始点の約30%が、ヒトの場合は50%がrDNA領域といった多コピーの繰り返し配列に存在する。S. cerevisiaeのrDNAには150~200コピーの繰り返し配列があり、各繰り返し配列に複製起点があるが、1回のS期においてDNA複製される活性な複製起点はそのうち20%に過ぎない。rDNAの活性な複製起点は転写が活性な遺伝子の下流に存在する。また、rDNAにおける活性な複製起点の分布はSir2により決定されている。rDNAにおいて隣接する3~4個の活性な複製起点の集団が形成されており、各集団はSir2によるヒストン脱アセチル化により不活性化された領域で隔てられている。
Sir2がrDNA領域の複製における負の制御効果を持つのに対し、Rpd3は正の制御効果を持つ。吉田和真は、複製プログラムの制御においてヒストン脱アセチル化酵素の各複製起点への作用よりもむしろrDNA領域の複製開始点の活性の操作の重要性が大きいとする説を提唱した。
複製プログラムは、細胞の系統や分化および発生の過程に応じて柔軟に変化する。複製プログラムの制御の生理的意義については、DNA複製を転写や修復といった染色体の他の機能と協調させることが遺伝情報の継承において重要であると考えられている。
上記の過程(複製開始、伸長)はレプリコンの終わりまで続く。レプリコンの終わり、すなわち複製終結点に複製フォークがたどり着いたときに終結段階が始まり、複製は完了する。この段階でレプリソームはDNAから解離する。この後に2つの大きな問題が待ち構えている。カテナンによる娘鎖の絡まりと末端複製問題である。