希釈平板法
試料を懸濁させる前、あるいはその際に薬品や熱を加える等の処理をすることで特定の生物を選択することが出来る。例えばアオカビやコウジカビの完全世代(テレオモルフ)を得るためには前処理で加熱をした方が出現しやすいことが知られている。また、下記のように希釈液を寒天が固まる前に加え、そのまま混ぜて固める混釈法ではさほど高温でなく、また短時間であるとはいえ40 °C程度の熱が加わることになり、これが加熱の前処理をしたことになると考えられる。海産の細菌には温度に感受性が高いものがあるため、それを対象にする場合には寒天を固めてからその表面に広げる塗抹法を用いなければならない。
懸濁液は試料を液体に混ぜ、均等になるようによく攪拌振盪をすることで作る。固形物であれば粉砕して混ぜる。より均等な懸濁液を得るためにマグネチックスターラーを用いたり、超音波を利用する例もある。
加える液体は淡水および陸上のものを対象とする場合、単純には蒸留水でよく(もちろん滅菌は必要)、菌類学では水道水を滅菌したものを用いる場合もある。他方でより特殊な溶液を用いる例もある。0.05-0.15%程度のごく薄い寒天溶液を用いるのは良い懸濁液を選るのに適している。また界面活性剤であるポリソルベートもよく用いられ、また緩衝液を用いる例もある。
例えば青島他編(1983)の土壌菌類の分離法として以下のような方法が解説されている。
2 mmメッシュのふるいに掛けた土壌30 gを滅菌水270 mLに投下して10分間振盪して懸濁液とする(10倍希釈液)。
これを10 mL取り、90 mLの滅菌水を加えて振盪する(100倍希釈液)。同様の手法で更に希釈率の高い液も作れる。
希釈液1 mLを取って滅菌シャーレに入れ、固形化直前の温度にまで冷やした寒天培地を注ぎ入れ、よく混ざり合うように手でシャーレを回す。
寒天が固まるまで放置し、その後に室温で培養する。
菌が出現するとその菌糸か胞子を採取し、培養用の培地に移し、純粋培養を試みる。
これは比較的単純な希釈平板法の手順である。
塗抹法はあらかじめ固めておいた寒天平板の表面に希釈液を塗り広げる方法である。そのための方法はいくつかあり、例えば白金線を使う場合、試料を白金線の先端につけ、その先端を寒天表面に押しつけて引っ張り、寒天上に塗りつけてゆく。先端は幅の狭い線を描くので、寒天表面にぐねぐねと曲線を描くように長く引っ張る。
この方法では白金線の軌跡に沿ってコロニーが点々と生じる形となる。特に最初に触れたところでは細胞数が多く、密度が高くなることが多く、後の方になるに従ってコロニーの間隔が大きくなるので、その部分で分離を行うことになる。したがって計数を行うには向いていない。
より全面に均等に塗抹するにはガラス棒を使う方法がある。ガラス棒の先端を三角など、とにかく先端が横棒となる形に折り曲げたものをコンラジ棒と言い、これを用いる。まず寒天の表面に試料を滴下し、その上からこの横棒の部分を寒天に密着させて滑らせることで寒天表面全体に塗り広げるものである。そのさい試料が多すぎると寒天の表面が乾かず、コロニーが密着しがちになるので0.1 mL程度にする。なお、均等に塗付するために寒天培地を回転させるターンテーブルが市販されている。