アルティメット・スパイダーマン
声 - 水野ゆふ / 英 - ミスティ・リー(英語版)
ピーター・パーカーの伯母。原作に比べるとかなり若いキャリアウーマンで、仕事やカルチャーセンター通いで家を留守にしていることが多い。
第77話「真のチャンピオン決定戦 パート3」で、実はスパイダーマンの正体を知っていたことが明らかになった。
声 - 田谷隼 / 英:ベンジャミン・ディスキン
1960年代の低児童向けアニメ(カートゥーン)風のコミカルタッチで人間のように暮らす動物たちの世界にいるブタ・ポーカーが、ビタミンたっぷりのクモが入り混んだメイおばさん特製パンケーキを食べた結果クモの力を得たヒーロー。アニマルアベンジャーズの一員として悪党と戦っていた(ネズミのアイアンマン「アイアンマウス」も登場する)。
原典は動物パロディコミック『スパイダーハム(英語版)』。なお、第1シーズン(シーズン1)第20話「スパイダー・ハム」でも、スパイダーマンがロキの魔法でブタに変えられた際に同じ姿になっている(デザインには差異がある)。
声 - 蜂須賀智隆 / 英:トロイ・ベイカー
衝撃波を操る金庫やぶり。第69話「ブリトー入手作戦」にて初登場を果たした際、メスメロに洗脳され、彼の計画の片棒を担がされた。
声 - /英:マーク・ハミル
「ドクター・ストレンジ」にて初登場した、ドリームディメンションの王。
声 - 川田紳司 / 英:ドレイク・ベル
主人公。今作ではS.H.I.E.L.D.の技術者が開発したスパイダーサイクル(バイク)といったハイテクギミックを使用することもあるが、あまり使いこなすことが出来ていない。
葛藤する際に天使と悪魔のスパイダーマンが頭の横で争う表現が多用され、時折視聴者に向かって語りかけるときがある。
第3シーズン(シーズン3)では、タスクマスターに対抗すべくS.H.I.E.L.D.の一員として若手ヒーローチーム結成に奔走する。
第4シーズン(シーズン4)では、信頼できる一部の人物(ウェブ・ウォーリアーズ等)には正体を明かしている。
スーパーヒーローと悪役(スーパーヴィラン)の戦いによって破壊された町を再建する企業。創業者のマック・ポーター(声 - /英:ケビン・マイケル・リチャードソン)はこの企業のCEOでもある。第18話「レッキング・クルーとの戦い」で、スパイダーマンらは、管理人のスタンとともにこの企業の手伝いを行う。
声 - 下山田綾華 / 英:アシュリー・エクスタイン
クロークのパートナーであるヒロイン。名前の通り、聖なる光の短剣の力を持っている。
クロークやヒーローチームがドルマムゥに洗脳された際、その力で浄化させ更にパワーアップさせた。
その後、タスクマスターに唆され一時敵として現れるが、和解した。
声 - 杉村憲司 / 英:シャイ・マクブライド
S.H.I.E.L.D.長官で、スパイダーマン達の上司にあたる。
声 杉村憲司 / 英:クリストファー・ダニエル・バーンズ
第4シリーズに登場。多次元世界崩壊の危機を食い止めるカギとなる秘石「シージ・ペリルス」のカケラを集めようと、再び様々な異世界を巡るスパイダーマンとアラクニッドの前に立ちはだかる「謎のスパイダーマン」。彼もシージ・ペリルスを集めており、スパイダーマンの正体も知っている。
正体はスパイダーマンが悪党になっている次元のピーター・パーカー。シージ・ペリルスを使って全次元のスパイダーマンの生命エネルギーを吸収し、唯一無敵のスパイダーマンになろうとしたが、他のスパイダーマンたちの生命エネルギーは悪党の彼にとって毒であり、エネルギーの暴走で砕け散った。
声 - 田尻浩章 / 英:フレッド・タタショア
ヒドラに雇われていた傭兵。ゾラ無き後ヒドラのリーダーとなる。
最終話である第104話「卒業の日」ではリザードと化してスパイダーマンと対峙したが、中和剤を投与されて元の姿に戻った後は、自分の戦いではないと言ってその場を去った。
声 - / 英:アシュリー・エクスタイン
スパイダーマンらと敵対する女悪党。第93話、第94話、第95話(第91話、第92話、第93話)「カーネイジの脅威」ではカーネイジに身体を乗っ取られながらもスパイダーマンに助けを求めた。
声 - 三戸耕三 / 英:トロイ・ベイカー
第10話(第9話)「ロキと霜の巨人」にて初登場した、ソーの弟。
第20話「スパイダー・ハム」ではスパイダーマンへの復讐の為に再登場し、魔法でスパイダーマンを豚の姿に変え、ハンターに襲わせた。第53話、第54話「アベンジャーズ・スパイダーマン」ではドクターオクトパスと手を組み、スパイダーマンの姿でヴェノム化したアスガルドの怪物たちを率いてスパイダーマンとアベンジャーズを仲違いさせようとした。
声 - 後藤光祐 / 英:マット・ランター
ピーター・パーカーのクラスメイトであるジョックの少年。実はスパイダーマンの大ファン。幼い頃からピーター等を相手に弱い者いじめをしていたが、自分がいじめていた同級生のアレックスがライノと化し復讐されそうになったことで反省し、スパイダーマンの助言により改心する。
第4話「寄生生物 ヴェノム」でヴェノムに寄生されたが、その際ヴェノムは別の宿主を求めてフラッシュから離れた。その後、第86話「エージェント・ヴェノム」で再びヴェノムに寄生された際遺伝子レベルでの結合を果たして完全な共存関係になり、スパイダーマン同様クモ糸を出せるほか、ビートルから奪ったミサイル射出装置などを自分のものにすることができるようになった。しかし共存関係になったが故にヴェノム状態は解除出来ない為(顔を露出させることは可能)S.H.I.E.L.D.から出ることは許されず、通常の生活は出来なくなり、ニュー・ウォーリアーズへ加入することとなった。
第4シーズン(シーズン4)の第84話「エージェント・ヴェノムを救え」において、ヴェノムとの一時的な分離が原因で外見が変わった。