蛍光顕微鏡
蛍光観察のための特殊な染色法として、蛍光染色・化学的蛍光染色・抗体蛍光染色などが行われる。
蛍光染色では各細胞内小器官やpH・イオンなどに対して染色性の特異性が高い蛍光色素を用い、蛍光染色が行われる。場合によっては複数の蛍光色素を用い、器官ごとに染め分けること(多重染色)も行われる。 蛍光色素にはDAPI・ローダミン・フルオレセインやその類縁化合物などが用いられる。化学物質の他に、粒径に応じて様々な蛍光特性を持つ量子ドットも染色に用いられる。
抗体蛍光染色では抗原抗体反応を利用し、蛍光色素で標識(蛍光ラベル)した抗体を試料に取り込ませて染色を行う。抗原となる物質に対して高い特異性で染色が行えるため、臨床検査などに用いられる。
これらの蛍光色素は、照射する励起光の強度が高すぎると褪色してしまうことがある。そのため励起光の強さを絞ったり、褪色防止剤を加えるなどの対策が行われる。
化学的蛍光染色では、試料を試薬で処理して蛍光性の物質に転換させ、蛍光性となった部位を観察する手法である。
他に、緑色蛍光タンパク質 (GFP) などの蛍光タンパク質を誘導する遺伝子を遺伝子組み替えによって導入し、観察する手法もある。(これについてはレポーター遺伝子で詳述されている)
右の光源から出た光(虹色のライン)は励起フィルタで励起波長の光のみに制限されて励起光(紺色のライン)となる。
励起光はダイクロイックミラーで反射され、対物レンズを通して試料を照明する。
励起された試料から発生した蛍光(黄緑色のライン)は対物レンズを通して接眼部に向かう。
蛍光はダイクロイックミラーで反射されず直進する。
吸収フィルタでは蛍光以外の波長の光が除かれる。
蛍光は接眼部に届き、肉眼で観察/カメラ等で撮影される
落射照明(同軸照明)で励起光を照射する。落射照明の反射鏡としてダイクロイックミラーを用い(励起フィルタを補助的に用いることもある)、励起光の波長のみを試料に照射する。
試料から発生した蛍光と、試料によって散乱された励起光のみが接眼部に向かう
目的とする蛍光の波長のみを透過する吸収フィルタを用い、蛍光のみを取り出す
蛍光を観察する
透過型蛍光顕微鏡は構造が簡単で安価であったが、励起光の強度を上げるのに限界があること、位相差観察と組み合わせることができないこと・厚みのある試料は接眼レンズ側で蛍光を発生させることが難しいことなどから関連光学技術の革新が進んだ現在では落射型蛍光顕微鏡が主流である。なお、光源の付け替えによって透過・落射の両方の観察法に対応している顕微鏡もある。
対物レンズを通して励起光を照射するという原理上、紫外線を用いた励起を行うには紫外線の透過率が高く、レンズ素材による蛍光の発生(自家蛍光、後述)の少ない対物レンズが必要である。この目的に開発された対物レンズはフルオール(Fluor/Fluar,ドイツ語で蛍石を意味する・FLとも略される)と呼ばれる。