Hisタグ
一般にタンパク質はその表面で金属イオンを配位する性質を多少なりとも持っており、その親和性の差を利用したクロマトグラフィーによってタンパク質を分離することが可能である。これが1975年に発表された固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィーである。その後の研究で、タンパク質を構成するアミノ酸のうち、特にヒスチジンが金属イオンとの配位結合に強く関わっていることがわかってきた。そこで遺伝子工学によりタンパク質の末端にヒスチジンを多数付加すれば、そのタンパク質の金属イオンに対する親和性が著しく増大し、容易に精製が可能になるというのが基本的な考え方である。Hisタグを持つタンパク質がpH 8以上の条件でニッケルなどの金属イオンが固定化された担体と接すると、ヒスチジン残基が金属イオンをキレートすることで担体に結合する。それ以外のタンパク質は担体には結合しないか、ごく弱く結合するのみであるので、適切なバッファーで担体を洗浄することで除去することができる。その後、イミダゾールを添加するなどして担体から外すことで、Hisタグを持つタンパク質を高い純度で回収することができる。
Hisタグは大腸菌などの原核生物を用いて発現させた組換えタンパク質をアフィニティ精製する際に使われる。 タンパク質を発現させた菌体は、遠心分離で集菌したのちに、機械的にもしくは界面活性剤やリゾチームなどの酵素を用いて溶菌させる。溶菌液中には、組換えタンパク質以外にも細菌を構成する様々なタンパク質が存在しているが、Hisタグのついた組換えタンパク質はアフィニティ担体と強く結合するため特異的に精製することができる。タンパク質の精製度や収量はSDS-PAGE(英語版)やウェスタンブロッティングで評価できる。
実際には目的の組換えタンパク質以外にも担体に結合してしまうタンパク質が存在する。担体を洗浄する際に20 mM程度のイミダゾールを添加することで、弱く結合している夾雑タンパク質を洗い流すことができ純度が改善する。しかし中には担体と強く結合して不純物となるタンパク質、例えばおよそ27 kDa程度のタンパク質SlyDのようなものも知られている。こうした不純物は他の精製法を使って除去できるが、そもそも該当する遺伝子(上の例ならばslyD)を欠損した大腸菌を用いて発現する方法もある。なおSlyDの場合には金属イオンとしてコバルトを使った場合には結合しない。
酵母などの真核生物で発現させた場合には、原核生物の場合よりも夾雑するタンパク質が多くなる傾向がある。そのためHisタグに加えて他のアフィニティタグも使ったタンデム精製を行う場合もある。