スーパーマリオ64
3Dコレクション同様、画面の高解像度化がなされている。
炎エフェクトが暗い半透明になっている。
地上にあるものはノコノコを踏むか、特定のブロックを叩くと出現する。サーフボードのように乗る事ができ、乗っている間はぶつかるだけでほとんどの敵を倒せる。壁に激突するまたは竜巻に飲み込まれるか、Zトリガーを押してしゃがむか、スターを取得すると消える。高所からの落下ダメージがなく、急な坂道でもジャンプし続ければ登ることができ、水や溶岩の上も移動可能。さらに制限時間もない。ただしジャンプと移動以外の行動はできなくなる。
水中にあるものは貝の中から出現する。ビート板のように使う事で普段より速く泳ぐ事が出来る。こちらは制限時間がある。
頑丈で黒い大きなブロックで、スーパーキノコで巨大化している時に体当たりするか、ワリオのパワフルパンチでしか壊れない。アイスブロック同様、中にコインやパワースターが入っていることもある。
船で発生する風が強くなった。
『スーパーマリオワールド』以来の登場。パワーフラワーを取ると風船マリオに変身し、一定時間だけBボタンを連打し宙を浮かぶ事が出来る。
ダメージを受けると変身が解けてしまう。また、途中でヒップドロップを使うといつでも変身解除する事ができる。
64版には無かったため、この効果が必要不可欠となるパワースターは全てDS版オリジナルである。
救出コース「どつけ!キングアイスどんけつ」クリア後に使用可能(幽閉されている間は怒号を上げていた)。
2回目のクッパ戦をクリアしてないと救出コースのあるところに進めない。また、通常はルイージでないとコースの入り口に入れないのでルイージも救出しておく必要がある。
パワーが高く壊せないものを壊す事ができたり、看板を持ち上げられたり、クッパを投げ飛ばす時の飛距離が長い反面、ジャンプ力とスピードが低い。
木の棒や看板などヒップドロップが通常2、3回必要なところを、1回で済ませられる。黒レンガや鉄球はワリオでしか破壊できない。
木でうたた寝している。隠れている木に登ると姿を現し、ジャンプで掴まればしばらくの間、ぶらさがって空を飛べる。ずっと掴まっていると次第に高度が下がっていき、最終的にはフクロウが疲れて強制的に離される。マリオ単独では登れない上空のパワースターを取る時に必要な存在。
完全に水没しているコース。
息継ぎができないため、コイン以外でライフを回復する事ができない。赤コインを全て集めてスターを取ればクリア。
上記の檻の落下地点付近にいる小猿。捕まえるとマリオの帽子を奪って逃げ回る(帽子が吹き飛ばされた場合もワッキィが持っている)。もう一度捕まえると返してくれる。
天空アスレチックコース。天空船やお屋敷など全てが空に浮き離れている為、足場同士は虹の上を進むじゅうたんなどで移動しなければならない。
天空船後部には大砲が設置されており、この大砲で天空船近くの虹の輪の先にある浮き島まで行く事が出来る。天空屋敷もあり、中には炎を吹く暖炉がある(暖炉に突っ込むと溶岩同様のダメージを受ける)。
アスレチックエリアには巨大ブランコや、スイッチを踏むと足場に変わるピラミッドブロックがある。
『大乱闘スマッシュブラザーズDX』・『大乱闘スマッシュブラザーズX』でも対戦ステージとして使われている。 15-1 にじをわたる ふね 15-2 てんくうの おやしき 15-3 タテめいろの あかコイン 15-4 かぜきる きょだいブランコ 15-5 おおぞら アスレチック 15-6 にじの かなたの しま 15-7 おやしきの スイッチスター(DS版)
また雪国のコース(さむいさむいマウンテン、スノーマンズランド)やレインボークルーズのコースでは寝ることはないが、一定時間操作しないとマリオが凍えた様子を見せる。
一部のコースにおいて、取ることのできないコインが存在する。(『マリオ視点』に切り替えて、地面や壁の裏側を覗くと発見できる)
2021年7月11日にアメリカで行われたオークションにおいて、同オークションに出品された未開封の本ソフトがゲームソフト史上最高額である156万ドル(日本円で約1億7200万円)で落札されたことがオークション会社から発表された。これまでの最高額は同月9日に同じオークション会社に出品され、87万ドル(日本円で約9600万円)で落札された『ゼルダの伝説』(1987年発売)の未開封品であり、2日後に再び記録を更新すると共にゲームソフトの落札額が100万ドル(日本円で約1億1000万円)を超える初めての事例となった。
通称「ケツワープ」(海外での呼称は「Backwards Long Jump」、通称「BLJ」)と呼ばれる座標バグは本作における実用性とネタ性を兼ねたバグ技として有名であり、ゲーム系のメディアでも取り上げられることが多い。この作品をRTA最大手種目たらしめている要因ともなっている(2021年6月時点)。研究され尽くした結果タイムの短縮が熾烈を極めるものとなり、2015年8月に更新された世界記録を3秒縮めるのに約3年を要したという報告がある。
「テレサのホラーハウス」内の2階に入口がある新コースで、ルイージが捕らわれているコース。ヨッシーは入れず、ワリオも通常はルイージでしか救出できないのでマリオが救出することになる。
スタートから4つ目の部屋まではキングテレサの笑い声が聞こえ、4つのドアのうち正しいドアを開けないとスタート地点に戻されてしまう。また、穴に落ちてもミスにならず、スタート地点に戻される。
BGMは「テレサのホラーハウス」と同じである。
レインボータワーの?スイッチを押すと全コースに出現する?ブロックから出現。それぞれ対応した特殊能力を持つ事ができる(これにより、スケスケメタル状態になることはできなくなった)。なお、?ブロックはマリオで叩くとハネ(下記参照)が出てくるものや、ボム兵が出てくるものも存在する(このボム兵は特殊で、出現するとすぐ爆発するほか、コインは出現しない)。ヨッシー以外のキャラで帽子がない場合は必ずボム兵(ハズレ)しか出てこなくなる。
ジャンプ中にBボタンを押し続ける事で落下速度が遅くなる。
ヨッシーのふんばりジャンプと比べて、浮遊時間は短いが移動は速い。
落下時のダメージ防止には使えない。