定量PCR
定量PCRの中で最も正確で信頼できる方法である。この手法では、増幅領域両端の2種類のプライマーに加えて、増幅領域内に相補的に結合する蛍光プローブを用いる。 増幅される DNA に特異的なプローブを用いるので、目的の配列のみを定量できる。すなわち前述の方法の様にすべての二重鎖DNA に反応することはない。 通常はプローブはRNA を基にし、蛍光レポーターとその隣りにクエンチャー(励起エネルギー吸収剤)を入れる。クエンチャーの近くのレポーターは蛍光が抑制される。従って蛍光がみられるのはプローブが分解した時のみである。この過程は使用する DNAポリメラーゼの 5' → 3' エキソヌクレアーゼ活性による。
プローブを加えて PCR を行う。
反応を開始して DNA が一本鎖化するとプローブがその相補配列(すなわちその鋳型DNA)へ結合する。
ポリメラーゼが働く温度になると、それはプライマーの結合した一本鎖DNAに相補鎖を作る。DNA の合成がプローブの位置に達すると、プローブはエキソヌクレアーゼ活性によって「上書き」される。結果、元あったプローブはバラバラになり個々のヌクレオチドとなる。すると蛍光レポーターはクエンチャーと分離するので、蛍光を発する。
PCR が進むごとに蛍光レポーターはクエンチャーから分離するので、蛍光ははっきりと幾何級数的に増加していく。これにより DNA の最初の量を正確に計測することが可能である。