タンパク質工学
このin vitroの方法は、キメラ遺伝子を生成するためのテンプレートスイッチングに基づくものである。このPCRに基づく方法は、テンプレートの最初の変性から始まり、プライマーのアニーリングと短い伸長時間が続く。その後のすべてのサイクルで、前のサイクルで生成された短い断片とテンプレートの異なる部分との間にアニーリングが生じる。これらの短い断片とテンプレートは、配列の相補性に基づいて一緒にアニールする。このように断片がテンプレートDNAとアニールするプロセスは、テンプレートスイッチングとして知られている。そして、これらのアニールした断片は、さらに伸長するためのプライマーとして機能することになる。この方法は、親長さのキメラ遺伝子配列が得られるまで実行される。この方法の実行には、フランキングプライマーが必要なだけである。また、DnaseI酵素も必要ない。
この方法は、まず相同な遺伝子のアライメントを行い、次に多型の領域を特定する。次に、遺伝子の上鎖を小さな変性オリゴヌクレオチドに分割する。下側の鎖もオリゴヌクレオチドに切断され、足場となる。これらの断片は溶液中で結合され、トップ鎖のオリゴヌクレオチドはボトム鎖のオリゴヌクレオチドに組み合わされる。これらの断片間の隙間はポリメラーゼで埋められ、ライゲーションされる。
また、系統的な組換えアルゴリズムを用いて、有益な残基を特定することにより、ライブラリーのサイズはよりスクリーニング可能なサイズに縮小された。最後に、タンパク質の機能に対する変異の影響を定量化し予測する、より正確な統計モデルとアルゴリズムの開発により、酵素の効率的なリエンジニアリングに向けて大きな前進を遂げた。
一般に、指向性進化は、タンパク質の変異体ライブラリーを作成し、ハイスループットスクリーニングを行い、形質が改善された変異体を選択する、2段階の反復プロセスとして要約されることがある。この手法では、タンパク質の構造と機能の関係についての予備知識は必要ない。指向性進化は、ランダムまたはフォーカスされた変異導入を利用して、変異タンパク質のライブラリーを作成するものである。ランダム変異は、エラープローンPCRや部位飽和変異導入法を用いて導入することができる。また、複数の相同遺伝子の組換えによって変異体を生成することもある。自然界では、限られた数の有益な配列が進化してきた。指向性進化は、新しい機能を持つ未発見のタンパク質配列を同定することを可能にする。この能力は、タンパク質がフォールディングや安定性を損なうことなくアミノ酸残基の置換に耐えられるかどうかにかかっている。
指向性進化法は、無性進化法と有性進化法の2つの戦略に大別される。
この方法では、挿入変異や欠失変異によって遺伝子の長さを変化させることができる。例えば、タンデムリピート挿入(TRINS)法である。これは、ローリングサークル増幅法によって標的遺伝子のランダムな断片のタンデムリピートを生成し、このリピートを標的遺伝子に同時に組み込むという手法である。