タンパク質工学
この方法は、構造要素やタンパク質ドメイン全体の組み換えに使用することができる。この方法は、ホスホロチオエート化学に基づいており、ホスホロチオジエステル結合を特異的に切断することができる。プロセスの最初のステップは、ベクターバックボーンと一緒に組み換える必要があるフラグメントの増幅から始まる。この増幅は、5'末端にホスホロチオール化ヌクレオチドを持つプライマーを用いて達成される。増幅されたPCR産物は、エタノール-ヨウ素溶液中で高温で切断される。次に、これらの断片は室温でハイブリダイズされ、大腸菌に形質転換され、あらゆるニックが修復される。
このin vitro技術は、組換え時代の最初の技術の1つである。まず、相同な親遺伝子をDNaseIによって小さな断片に切断することから始まる。これらの小さな断片は、未切断の親遺伝子から精製される。精製された断片は、プライマーレスPCRを用いて再組み立てされる。このPCRでは、異なる親遺伝子からの相同断片が互いにプライミングし合い、キメラDNAが得られる。このキメラDNAを、末端プライマーを用いて通常のPCRで増幅する。
これらの方法は、タンパク質が配列の相同性を欠きながら、類似した構造の同一性を示すことがあるという事実に基づいている。
タンパク質工学(タンパクしつこうがく)は、有用または価値のあるタンパク質を開発するプロセスであり、多くの場合、自然界に存在するアミノ酸配列を変更することによって、人工的なポリペプチドを設計・製造する。タンパク質のフォールディングの理解や、タンパク質の設計原理の認識などに多くの研究が行われている新しい学問分野である。 工業用触媒(生体触媒)として多くの酵素の機能向上に利用されている。また、製品・サービス市場において、2017年には1680億米ドルの市場場規模になると推定されている。
タンパク質工学には、合理的なタンパク質設計と指向性進化という2つの一般的な戦略がある。これらの方法は互いに排他的なものではなく、研究者はしばしばその両方をもちいることになる。将来的には、タンパク質の構造と機能に関するより詳細な知識と、ハイスループットスクリーニングの進歩により、タンパク質工学の能力は大きく向上する可能性がある。最終的には、拡張遺伝暗号のような、遺伝暗号に新規アミノ酸をコード化する新しい手法によって、非天然アミノ酸も含めることができるようになるかもしれない。
オーバーラップエクステンションPCRに基づく部位飽和変異導入法である。環状プラスミド中の任意の部位に変異を導入するために使用される。
この方法は、進化した遺伝子を宿主から宿主に移すために、ライフサイクルを変更したバクテリオファージを利用するものである。ファージのライフサイクルは、転送が酵素からの目的の活性と相関するように設計されている。この方法は、遺伝子を継続的に進化させるために、人間の介入を最小限に抑えられるという利点がある。
多価タンパク質は、翻訳後修飾やタンパク質をコードするDNA配列の多重化によって、比較的容易につくることができる。多価および多特異性タンパク質の主な利点は、既知のタンパク質の標的に対する有効な親和性を高めることができることである。不均一な標的の場合、タンパク質の組み合わせによって多特異的な結合をもたらすことで特異性を高めることができ、タンパク質治療薬として高い応用性を持つ。
多価結合の最も一般的な例は抗体であり、二重特異性抗体の研究が盛んに行われている。二重特異性抗体の応用は、診断、イメージング、予防、治療など幅広い分野に及んでいる。
タンパク質が指向性進化、合理的設計、半合理的設計を受けたら、どの変異体がより優れた特性を示すかを決定するために、変異タンパク質のライブラリーをスクリーニングする必要がある。ファージディスプレイ法は、タンパク質をスクリーニングするための一つの選択肢である。この方法では、変異型ポリペプチドをコードする遺伝子とファージのコートタンパク質遺伝子を融合させる。ファージ表面に発現したタンパク質変異体は、in vitroで固定化されたターゲットとの結合によって選択される。次に、選択されたタンパク質変異体を持つファージを細菌中で増幅し、ELISA法により陽性クローンを同定する。これらの選択されたファージは、DNAシークエンシングが行われる。
細胞表面ディスプレイシステムは、変異ポリペプチドライブラリーのスクリーニングにも利用することができる。ライブラリーの変異遺伝子を発現ベクターに組み込んで、適切な宿主細胞に形質転換する。これらの宿主細胞は、さらにハイスループットなスクリーニングにかけられ、所望の表現型を持つ細胞を同定することができる。
in vitroでのタンパク質翻訳や無細胞翻訳を利用するために、セルフリーディスプレイシステムが開発されてきた。これらの方法には、mRNAディスプレイ、リボソームディスプレイ、共有結合および非共有結合のDNAディスプレイ、in vitroコンパートメント化などが含まれる。
コンピューティングの手法により、Top7と名付けられた新しいフォールドを持つタンパク質や 、非天然分子のセンサーが設計されている 。融合タンパク質の設計により、クリオピリン関連周期性症候群の治療薬としてFDA(米国食品医薬品局)の認可を得た「リロナセプト」が誕生した。
もう一つの計算手法であるIPROは、Candida boidiniiのキシロース還元酵素の補酵素特異性を変えることに成功した。 IPRO(Iterative Protein Redesign and Optimization)は、タンパク質を再設計し、本来の基質や新規の補酵素に対する特異性を高める、または与えるものである。これは、指定された設計位置の周囲でタンパク質の構造を繰り返しランダムに摂動させ、ロータマーの最も低いエネルギーの組み合わせを特定し、新しい設計が以前のものよりも低い結合エネルギーを持つかどうかを決定することによって行われる。
計算支援設計は、高度に秩序化されたナノタンパク質集合体の複雑な特性を設計するためにも使用されている。 大腸菌バクテリオフェリチン(EcBfr)は、2つのオリゴマー状態を持つことで構造的に不安定で不完全な自己組織化挙動を示すタンパク質ケージであり、本研究のモデルタンパク質である。