核酸医薬
ASOの機序はHybridization Arrest 機構と Cleavage 機構の2種類に分類されることが多い。Hybridization Arrest 機構は対象RNAとハイブリッドを形成し、RNAに作用する分子群と競合する機構をいう。対象RNAは切断など化学反応を受けない。すなわち、リボソーム、スプライソソームなどが認識するRNA部位をASO(英: antisense oligonucleotides, ASO)によって物理的に被蓋する機構である。Cleavage 機構はASOが結合することによって対象とするRNAを切断する方法である。RNaseHの作用が代表例である。D-オリゴやPS-オリゴなどが形成するRNA二重鎖はRNaseHのよい基質となり、ハイブリッドを形成した部位のRNAのみが切断される。この機構はRNA切断後、それまで結合していたASOが再度アンチセンス効果を発揮できる点で Hybridization Arrest 機構よりも効率的である。Hybridization Arrest 機構と Cleavage 機構のいずれかしか機能しないということは考えにくく、どちらの寄与がより大きいかということになる。また、ASOの機構を下記にまとめる。
NOD様受容体(NOD-like receptor、NLR)は細胞質のDAMPとPAMPを感受する細胞質の受容体の大きなファミリーである。インフラマソームがよく知られている。AIM2インフラマソームは二本鎖DNAを認識する。またNLRP3インフラマソームはATP、尿酸、遊離脂肪酸などを認識する。NLRP3インフラマソームは自己炎症症候群との関連が知られている。
東京医科歯科大学の仁科、横田らは核酸医薬のデリバリーとしてビタミンE(α-tocopherol、Toc)に注目した。彼らはTocをアミダイト化しsiRNAの5’末端に結合させたToc-siRNAを合成して、肝臓をターゲットとした生体内でのTocの生理学的輸送動態を用いたsiRNAのデリバリーを試みた。マウスに静脈注射し肝臓での標的mRNAの発現量を検討した。従来のコレステロール結合siRNAと比較して投与量を1/10に減らすことに成功した。次に彼らはTocをギャップマー型ASO(一本鎖DNAの両端をLNAで置換したASO)へ応用することを考えた。しかし脂質をはじめとした各種分子をASOに直接結合するとASOの有効性が減弱することが知られていた。そのためASOに対して相補となる両端を2'-OMeで化学修飾したRNA(complementary RNA、cRNA)を合成し、ASOとアニーリングすることで日本発の新規核酸医薬となるDNA/RNAヘテロ2本鎖核酸(DNA/RNA heteroduplex oligonucleotide、HDO)を開発した。
脳室内投与は血液脳関門を考慮する必要のない投与法であり、高い有効性を保って核酸医薬を神経細胞へデリバリーできる有力な方法であるが、最大の問題点は侵襲性が高いことである。siRNAとASOのいずれも数種の報告がなされている。ASOは静脈内投与と同様に核酸間リン酸結合のホスホロチオエート化された核酸を用いることが一般的であるため、ドラッグデリバリーシステムを考慮せず、そのまま投与されることがほとんどである。一方siRNAについては、そのまま脳室内投与した報告もあるが、より高い効果を得るために各種化学修飾を加えることやDDS素子を結合させる方法が報告されている。また通常二本鎖であるsiRNAを一本鎖にしたsiRNA(single-stranded siRNA、ss-siRNA)も報告されており、その脳室内投与でハンチントン病のモデルマウスを治療した報告がなされている。
哺乳類においては約30塩基以上の長いdsRNAを細胞内に導入すると抗ウイルス応答であるインターフェロン応答が生じ、アポトーシスの引き金となるPKRなどが活性化され細胞が死滅してします。化学的に合成されたsiRNAをヒトの培養細胞に導入することでインターフェロン応答を引き起こすことなく効果的に標的遺伝子の抑制が可能である。
配列
Tuschlらのグループが提唱した初期のガイドラインでは以下のようなものである。まず、5’、3’の非翻訳領域(UTR)を避けて、開始コドンから50~100塩基下流の翻訳領域からターゲットとなる領域を選択し、さらにGC含量が50%程度のAA(N19)TTという配列を選ぶ。もしターゲット領域内でそのような配列が見つからない場合にはAA(N21)もしくはCA(N21)で代用し、対応するsiRNAを作成するのがよいとされた。またオーバーハングに関しては、標的配列との相同性は必須ではなく、UUまたはTTが推奨された。しかしこのようなガイドラインには根拠がないという意見もある。
siRNA二本鎖あるいはmiRNA/miRNA*二本鎖が二本鎖のままArgonauteに入った状態をpre-RISCとよぶ。Pre-RISCは小分子RNAとArgonauteが自発的に結合することによって作られるわけではなく、Hsc70やHsp90を中心とする分子シャペロンによるATPの加水分解が必要であることが知られている。シャペロンはRNAと結合していないArgonauteの構造を大きく変化させることにより、ArgonauteがsiRNA二本鎖やmiRNA/miRNA*二本鎖を取り込めるような状態を作り出していると考えられている。piRNAのような一本鎖RNAもRISCを形成するがこの機序は十分に明らかになっていない。取り込まれた二本鎖のうちどちらの鎖がガイド鎖でどちらの鎖がパッセンジャー鎖になるかはRNA二本鎖がArgonauteに積み込まれる際の方向によってすでに運命づけられている。ArgonauteのMIDドメインとPIWIドメインの境界面付近には、リン酸基結合ポケットがあり二本鎖RNAがArgonauteに積み込まれる際にはガイド鎖の5’末端のリン酸残基がこのポケットに固定される。Argonauteとガイド鎖のリン酸骨格の間には多くの特異的相互作用が生じることが知られている。一方でパッセンジャー鎖とArgonauteの間に生じる相互作用は極めて少ない。
2'-O-メチル化RNAは天然にも存在する修飾核酸である。C3'-endo型が優性で熱力学的安定性が高く、ヌクレアーゼ耐性は高いがRNase H活性はないため、RNase H依存性のmRNAの分解をする場合はgap portionを非修飾DNAとしたgapmer type ASOとしてデザインすることが多い。