永禄の変
こうして一乗院覚慶(義秋)が次期将軍に向けて着々と手を打っていく間、三好家中では分裂が生じていた。事件から半年後の永禄8年11月、河内飯盛山城に入った三好長逸・三好宗渭・石成友通は、若年の当主義継に迫り、覚慶を逃した責任などを追及して松永久秀を失脚させた。そして三好一門の長逸・宗渭に加え久秀に替わって家臣を代表する地位に上った石成とが一体となり、以後家中の実権を掌握する(三好三人衆の成立)。事実上の阿波国主三好長治(実休の子)を補佐する三好康長(義継・長治の大叔父)もこれを支持した。
大和では興福寺衆徒であった筒井氏が戦国大名化していたが、久秀が筒井氏の所領と中世を通じて興福寺が保持してきた大和守護の地位を奪い取った関係から、三人衆は筒井順慶と興福寺に久秀討伐を持ちかけて秘かに手を結んだ。かくして12月に三人衆の軍は大和に侵攻を開始し、筒井氏と共同して久秀を多聞山城(現在の奈良市法蓮町)に包囲した。だが城は強固で松永軍の士気は高く、翌年2月には筒井軍を打ち破った。三好氏家臣を含む畿内の諸城主には久秀に与する者も多かった。久秀は城を息子の久通に任せると5月に摂津野田(現在の大阪市福島区)まで進撃し、義秋を支持する河内の畠山氏と共同して和泉堺において三人衆方と戦ったが、大敗を喫し行方知れずとなった。
だが、将軍と対立し幕府機構に頼らないまま京都の支配を維持することは困難であった。その上、義輝が朽木へ動座した後も断続的に六角氏や畠山氏の攻撃を受け、京都支配は一向に安定する兆しを見せなかった。永禄元年(1558年)、長慶は六角義賢の支援する義輝や細川晴元の攻撃を受け、戦況は優位に推移していたものの、六角の仲介を容れて和睦した。義輝は5年ぶりに帰洛し、長慶は御相伴衆に列せられて有力大名としての待遇を受けることとなり、幕府は将軍・三好氏が協調する形で復活した。三好政長の子でこれまで敵対してきた三好宗渭も長慶に従った。
長慶はこの頃から政権を支える有力な一族を相次いで失う。永禄4年(1561年)に弟の十河一存が病死。翌5年(1562年)には阿波衆を率いる弟三好実休が畠山高政との戦いで戦死(久米田の戦い)。6年(1563年)には嫡男義興も22歳の若さで病死した。さらに7年(1564年)には弟の安宅冬康に嫌疑をかけて自害させたが、長慶自身すでに衰弱しており同年7月に没した。三好氏の当主は、十河一存の子で長慶の養子となっていた義継が相続した。
三好氏の勢威に陰りが見える一方で、将軍義輝は全国の大名に紛争調停を行なったり幕府の役職を与えたりして将軍権威の回復を図った。永禄2年(1559年)には、美濃の斎藤義龍、尾張の織田信長、越後の長尾景虎(上杉謙信)が相次いで上洛した。また、永禄7年には敵対していた政所執事の伊勢貞孝を敗死に追い込み、新たな政所執事に義輝の義従兄弟にあたる摂津晴門を起用し、従来将軍の意向が及ばなかった政所を掌握して幕府決裁に対する影響力を強め将軍親政を進めようとした。
ただ、幕権強化を目指す将軍側はこの体制を従容として受け入れていたわけではなく、山田康弘は「雑々聞検書」から永禄2年(1559年)と思しき二月二十六日付の書状を引用し、当時三好氏や伊勢氏の間に不慮の雑説が流れていたことを紹介し、将軍側から三好氏・伊勢氏の分断工作や伊勢貞孝の孤立化を目指した工作が行なわれていた可能性も考えられると指摘する。織田信長の家臣太田牛一が記した『信長公記』も、将軍側が三好氏に対して謀反を企てたため殺害されたとする。
近年では、三好側には明応の政変(1493年)以来70年に及ぶ将軍家の分裂(足利義稙系と足利義澄系)を解消させる積極的な意図があったとする説や、三好勢による二条御所包囲は室町時代に繰り返されたいわゆる「御所巻」(大名らが将軍邸を包囲して政敵の失脚などを強要する行為)の一つに過ぎず、実際に訴訟(要求)を目的としていたところ、取次の際の齟齬あるいはその過大な要求と将軍側の強硬な姿勢から両者の衝突に発展してしまったもので、将軍殺害は当初の計画ではなかったとする説も出されている。もっとも、両説共に矛盾を抱えているとする指摘もあり、三好側の真意が何処にあったのかは確定できない。