KIF11
ヒトキネシン-5のL5ポケット(L5、α2、α3)の特定の残基の役割についての研究は存在するもの、体系的な研究はまだ行われていない。こうした変異実験は、薬剤開発においてどの残基が薬理学的に重要であるかを明らかにすることを目的として行われており、その結果モナストロールやSTLCなどの阻害剤に対して耐性を示すKIF11遺伝子変異が明らかにされている。阻害剤結合ポケットのR119A、D130A、L132A、I136A、L214A、E215A変異はモナストロール耐性を付与し、R119A、D130A、L214A変異はSTLC耐性を付与する。 また、ショウジョウバエのキネシン-5を用いた機能獲得実験では、モータードメイン内のアロステリックなコミュニケーションは両阻害剤で異なることが示されている。
変異研究のもう1つの目的は、1残基の変化によってどのように薬剤耐性が生じるかを理解することである。阻害剤結合ポケット内の変化は、キネシン-5のモータードメイン中心部のβシートの構造的変化(ねじれ)と連動している。このように、L5ループはヌクレオチドの結合とβシートのねじれを直接的に制御し、隣接する微小管結合部位に影響を及ぼしている可能性がある。
こうした研究を通じて、哺乳類細胞ではキネシン-5は前期と前中期における紡錘体組み立ての初期段階に必要であるが、後期以降の過程には必要ではないことが明らかにされている。キネシン-5阻害剤はアロステリック部位に結合することで、ATPの加水分解を微小管を動かすための機械的な力へ変換する機構を阻害することが示されており、この酵素がどのように機能しているかに関する知見が得られている。
紡錘体の自己組織化過程は微小管を構造的な要素とし、キネシン-5などの一群のモーターが微小管を動かして秩序立てることによって行われているが、そのメカニズムとして多くのモデルが提唱されている。こうしたモデルの多くでは、中期の紡錘体の定常状態に関して、紡錘体微小管内で反対方向に作用するモーター間の力の平衡による説明が試みられている。しかしながら、紡錘体の組み立てに必要な全ての構造的構成要素が知られているかについては未だ明らかではなく、またキネシン-5を含むモーター群がどのような時空間的調節を受けているのかも明らかではない。こうした理由により、これらのモデルの評価は困難なものとなっている。近年のデータでは、昆虫細胞でみられるような、マイナス端指向性とプラス端指向性の微小管スライド機構の間の「力の平衡」によるモデルは、哺乳類細胞には当てはまらないことが報告されている。紡錘体の自己組織化過程は細胞生物学における大きな未解決問題であり、この装置を構成するさまざまな微小管モーターや構造的構成要素の調節や挙動について、さらなる詳細の解明が頑健なモデルの提唱のために求められている。
“Mechanistic analysis of the mitotic kinesin Eg5”. J. Biol. Chem. 279 (37): 38861–70. (September 2004). doi:10.1074/jbc.M404203200. PMC 1356567. PMID 15247293. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1356567/.
“Monastrol inhibition of the mitotic kinesin Eg5”. J. Biol. Chem. 280 (13): 12658–67. (April 2005). doi:10.1074/jbc.M413140200. PMC 1356610. PMID 15665380. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1356610/.
“Mutation screening of a haplotype block around the insulin degrading enzyme gene and association with Alzheimer's disease”. Am. J. Med. Genet. B Neuropsychiatr. Genet. 136B (1): 69–71. (July 2005). doi:10.1002/ajmg.b.30172. PMID 15858821.
これらの値は、微小管グライディングアッセイ(microtubule gliding assay)、1分子運動アッセイ(single molecule motility assay)、光トラップアッセイという3種類の実験から得られたものである。
微小管グライディングアッセイでは、キネシンはガラス表面に接着され、その上に微小管が置かれる。モーターはガラスに接着されているため、その運動性挙動はキネシン上の微小管の動きへ変換され、その動きを観察する。こうした実験により、キネシン-5の運動性の解析が初めて行われた。さらに、まず微小管をガラス表面に接着し、その後キネシン-5と遊離微小管を溶液で添加するという改変により、キネシン-5が2本の微小管の間を架橋し、逆方向の移動を行うことが示された。この実験では、紡錘体中で逆方向を向いた微小管をスライドさせるという、有糸分裂で提唱されていた役割を実際に発揮することが示された。
個々のキネシン-5分子の挙動の研究のため、微小管をガラス表面に接着し、そこへ蛍光色素が付加されたキネシン-5の希薄溶液を添加するという方法で、1分子運動性アッセイが行われた。この実験条件では、個々のキネシン-5分子が微小管上を「歩く」さまを追跡することができ、速度に関する情報だけでなく、プロセシビティ(英語版)(キネシンが微小管から解離することなく複数のステップを行うこと)に関する情報も得られる。
1995年に、キネシン-5はC末端テールがリン酸化による翻訳後修飾を受けることが明らかにされた。前期の序盤にこの残基がリン酸化されると、キネシン-5は紡錘体へ局在し、そこで微小管に結合する。2008年には他のリン酸化部位も同定されたが、この残基がリン酸化されているのは微小管に結合したキネシン-5の約3%である。キネシン-5のテール、ストーク、モータードメインに他のリン酸化部位やその他翻訳後修飾も同定されているが、有糸分裂時に機能を発揮するために必要であることが示されているものはない。
キネシン-5は他のタンパク質との直接的な相互作用によっても調節されている。微小管結合タンパク質TPX2は、有糸分裂時にキネシン-5と結合する。この相互作用はキネシン-5が紡錘体へ局在し、紡錘体を安定化し、紡錘体極を分離するために必要である。またキネシン-5は、ダイナクチンのサブユニットp150(英語版)や、その他多くの細胞周期関連タンパク質と相互作用することがin vitroやin vivoで示されている。