RNAポリメラーゼ
↑ 「ポリメラーゼ」は、より英語発音に近い「ポリメレース」と表記されることもある。
1 2 3 4 タンパク質は様々な立体構造をとっているが、本来はアミノ酸が鎖のようにつながった直鎖状高分子である。この直鎖の末端は残基がアミノ基か酢酸かでそれぞれN末端、C末端と区別する。RNAポリメラーゼおよびDNAポリメラーゼの酵素活性、すなわち転写とDNA複製はN末端からC末端へと進む。したがって、タンパク質のアミノ酸構成を示すとき、N末端を左に順番にアミノ酸を書き並べる。この中の特定のアミノ酸の位置および区間はN末端から数えた番号で示す。
1 2 3 4 転写は開始、伸長、終了の3段階からなる。開始段階では、RNAポリメラーゼがホロ酵素を形成してDNAのプロモーターに結合する。初め、DNAは二重らせんを形成したままで、このときのホロ酵素を閉鎖型複合体と呼ぶ。その後、二重らせんはほどかれ、開放型複合体になる。アボーティブ転写産物と呼ぶ数ヌクレオチドのRNAが合成される。伸長段階に入って遺伝子が本格的に転写される。
1 2 転写の開始段階において、DNAポリメラーゼがRNA合成をできるようにするべく本来二重らせんであるDNAを一本に巻き戻す。まず、DNAポリメラーゼは二重らせんDNAに結合してする。次に巻き戻しを行うが、このとき一本鎖DNAとホロ酵素とを開放型複合体と呼ぶ。
1 2 DNAは二重らせんを形成しているが、RNAポリメラーゼが転写を行うのはこのうち1本である。転写されるほうを鋳型鎖、されないほうを非鋳型鎖と呼ぶ。
この解離は、閉鎖型複合体に保護されていたのが、開放型複合体への移行でドメイン1.1がヒドロキシルラジカルにさらされるためのようである。リチャード・エブライトは閉鎖型複合体のドメイン1.1が開放型複合体では消えていることを蛍光共鳴エネルギー移動実験で証明した。
3番目の見解には2つの解釈がある。第一に、σ因子は活性部位に近づくことでリン酸ジエステル結合の形成に携わる。第二に、ループの連結鎖は転写産物の出口を塞ぐことで、アボーティブ転写産物の形成を行う。アボーティブ転写産物形成については、連結鎖と開始段階で合成されるRNAは出口を占有するための競合をするという仮説がある。連結鎖が勝つとRNAの伸長は中断され、短いアボーティブ転写産物として放出される。アボーティブ転写産物は完成した転写産物より過剰に合成される (大腸菌では11倍過剰) ので、この過程はおそらく何度も繰り返される。約12nt以上にうまく成長できたときにRNAはようやく競合に勝つ。連結鎖はRNAにどかされ、結果、コア酵素とσ因子との結合は弱くなる。もしくはコア酵素から解離して伸長への移行に備える。ダーストらは、連結鎖を欠損したσ因子でアボーティブ転写産物は多量に生産されないことを確認した。アボーティブ転写産物はσ因子が活性部位に存在するための副産物であると推測される。伸長の礎となる短いDNAを結合させるためσ因子が活性部位に接近することで、必然的に連結鎖は出口を塞いでいると考えられる。
ホロ酵素とDNAによって形成される複合体は、転写時の状態であるためRF複合体 (replicative form complex、RFは複製型) と呼ばれる。ダーストらは下図のフォークジャンクションDNAにT. aquaticus のDNAポリメラーゼホロ酵素を結合させた、RF複合体を作成した。このDNAは、-35ボックスを含むほとんどが二本鎖だが、-10ボックス中の非鋳型鎖に-11位から始まる一本鎖の突出部分を持つ。これは開放型複合体における状態を模倣したものである (詳しくは#真正細菌のβサブユニット)。
RF複合体の立体構造から、様々な事実が判明した。ホロ酵素に結合するDNAはσサブユニットがある場所を横切る。大腸菌のプロモーターにおいては、-12位の塩基がσ因子の領域2.4のGln437およびThr440と相互作用している。T. aquaticus のσで2つのアミノ酸はGln260とAsn263とに相当する。
Trp256は-10ボックス直前の-12位に非常に近い。T. aquaticus σのPhe248、Tyr253、Trp256や大腸菌σにおける一部の3 芳香族アミノ酸は高度に保存されている。これらは開放型複合体の-10ボックスの非鋳型鎖に結合することで、プロモーターの融解に関与すると予測される。観察されたTrp256の位置から-11位の塩基対の代わりとなり、融解を促進する可能性が高い。
σの領域2.2と2.3における2つの保存された塩基性アミノ酸(Arg237とLys241)が 静電相互作用で結合していることが観察された。しかし、領域4.
2の残基は35ボックスに結合していない。ダーストらは、RF複合体の結晶化の際に、-35ボックスが領域4.2に対する正常な位置から押し出されてしまったと結論付けた。ダーストらは自身の撮影したRF複合体の構造やその他の証拠から以下の仮説を提唱した。DNAの上流で二本鎖DNAが曲がることによって、DNaseIの標的部位が生じる。一方、下流領域では二重らせんが融解する。こうして閉鎖型から開放型へと複合体が移行する。開放型複合体でのDNAや各タンパク質の相互作用も立体的に解析された。-10ボックスがβとβ‘サブユニットの間で融解するが、これはβ’舵型構造によって維持される。この構造はβ’サブユニットの表面から隣接するβサブユニットに向けて、また分離した2つのDNA鎖の間隙に突き出す。これによって、DNAの再会合は阻止される。
活性部位には2つのMgが3つのアスパラギン酸によって支えられる。
少なくとも開放型複合体になった時点で、ホロ酵素には内部に通じる5つの通路がある。NTP取り込み通路は基質であるリボヌクレオチドを触媒活性中心に迎え入れる。RNA出口通路は後の伸長段階で合成したRNA鎖の部分を出すためにある。ほかの3つの通路はDNAが出入りするために使う。下流のDNAは下流DNA用通路から二重らせんのまま活性中心溝に入る。そこでDNAは+3から2本の一本鎖に分かれる。非鋳型鎖は非鋳型鎖用通路(NT通路)を抜けてホロ酵素の表面に沿って進む。一方、鋳型鎖は触媒活性溝を突き進み、鋳型鎖用通路(T通路)から外に出る。2つの一本鎖はホロ酵素の後方にある上流DNAの-11の位置で二重らせんに戻る。