RAF1
このc-Rafの固定(他のRafやKSRでも起こる)は、14-3-3結合モチーフのリン酸化によって制御されている。リン酸化されていない14-3-3結合モチーフにはパートナーは結合せず、他のプロテインキナーゼによって保存されたセリン(Ser259とSer621)がリン酸化されている必要がある。このイベントへの関与が示唆されている最も重要なキナーゼはTAK1(TGF-β activated kinase 1)であり、リン酸基の除去を行う酵素はプロテインホスファターゼ1とプロテインホスファターゼ2A複合体である。
Rafへの14-3-3の結合は必ずしも阻害的に働くわけではないことには注意が必要である。いったんRafが開いた構造となって二量体化すると、14-3-3は2つのキナーゼの間を橋渡しするようにトランスに結合し、二量体を離すためではなく、結合を強化するための「手錠」として機能する。c-Rafと14-3-3の結合にはさらに他の様式も存在するが、それらの役割はあまり解明されていない。
二量体化もc-Rafの活性の調節に重要な機構であり、Rafの活性化ループのリン酸化に必要である。通常は、「開いた」構造のキナーゼドメインのみが二量体化を行う。c-Rafのホモ二量体も他の因子とのヘテロ二量体も同様な振る舞いを示す。
c-Rafが十分な活性を持ち、活性化状態が安定化されるためには、さらにc-Rafの活性化ループのリン酸化が必要である。
調査されたすべてのヒト腫瘍試料の約20%でB-Rafの遺伝子に変異がみられる。これらの変異の圧倒的多数はV600Eの1アミノ酸置換を伴うもので、この異常な遺伝子産物(BRAF-V600E)は臨床分子診断において免疫組織染色によって可視化することができる。この置換は活性化ループのリン酸化を模倣するものであり、正常な活性化制御段階の全てを飛び越えて、即座にキナーゼドメインを完全に活性化された状態にする。B-Rafはホモ二量体化によって自身を、そしてヘテロ二量体化によってc-Rafを活性化することができるため、この変異はERK1/2経路を恒常的に活性化して無制御な細胞分裂を駆動し、壊滅的な影響を与える。
代わりにKSRには、CA1、CA2と名付けられた特有の調節領域がN末端に存在する。長らくCA1ドメインの構造は不明であったが、2012年にKSR1のCA1領域の構造が解かれ、コイルドコイルが付加されたSAM(Sterile alpha motif)ドメイン(CC-SAM)構造であることが明らかにされた。この領域はKSRの膜結合を補助していると考えられている。Rafと同様、KSRにもリン酸化依存的な14-3-3結合モチーフが2つ存在するが、KSRのヒンジ領域にはさらにMAPK結合モチーフが存在する。このモチーフの典型的な配列はPhe-x-Phe-Pro(FxFP)であり、ERK1/2経路におけるRafキナーゼのフィードバック調節に重要である。これまで知られているところによると、KSRはRafと同じ経路に関与するが、副次的な役割しか持たない。KSRの内在的なキナーゼ活性は極めて弱いため、近年になってようやく活性が実証されるまで長らく不活性な因子であると考えられていた。しかしKSRのキナーゼ活性はMEK1やMEK2のリン酸化には無視できるほどの寄与しかしていない。KSRの主要な役割はRafのヘテロ二量体化のパートナーとなることであるようで、アロステリック機構によってRafの活性化を大きく促進する。同様の現象は他のMAP3Kに関しても記載されている。例えば、ASK2はそれ自身では活性の弱い酵素であるが、ASK1とのヘテロ二量体として活性を持つ。