Pre-mRNA スプライシング
U4とU6はステムIとステムIIの形成に関与する。また、U4はスプライシング反応に直接参加せず、U6と結合して適当な時期にスプライソソームから解離する。その役割は、U6がスプライシングに参加するまでの間にこれを保護することであると予想されている。ステムIを形成するためにU4と塩基対形成するU6の配列は、U2との重要な配列に必要でもある。U4の解離は、U6とU2の塩基対形成によるスプライソソームの活性化の合図かもしれない。
真核生物の核内mRNA前駆体
つまり、翻訳配列が実際に切り貼り(スプライシング)されるのはこの段階である。二番目に、一番目と同じ反応でイントロンはエクソンから完全に切り離される。
図7.エステル転移反応の簡略図。図では炭素が攻撃されているが、スプライシングではリン酸基のリンが水酸基から求核攻撃を受ける。
ここまでの説明では、あるエクソンの5'側末端はイントロンを挟んで隣接するエクソンの3'側と結合するとしてきた。しかし、いつもそうとは限らない。2つの例外があるが、1つ目は、エクソンが間のエクソンを飛ばしてはるか下流で結合する選択的スプライシングである。これについては#選択的スプライシングを参照せよ。2つ目はトランススプライシング trans-splicing で、別々のRNA上のエクソン同士が結合する。通常ほとんど起こらないが、トリパノソーマではほとんどのmRNAがトランススプライシングを受ける。線虫でもすべてのmRNAが5'リーダー配列を付加されるためにトランススプライシングされ、さらに同一分子内でのスプライシングを受ける場合も多い。トランススプライシングによって排出されるイントロンは、通常のラリアット構造ではなくY字型をしている。
U6 snRNPもまたU1と同様に5'-スプライス部位と塩基対形成をする。この塩基対形成についてChristine GuthrieとJoan Steitzは、U6の普遍配列ACAGAGとイントロンの+4から+6にあるUGUとの間で行われると仮定し、塩基対はスプライシングの第一の反応前から第二の反応後まで存在することを示した。
少なくとも二種類の酵母で、U6 snRNPの遺伝子はmRNA成熟後にも、スプライシング後に残存するタイプのイントロンによって分断されている。