甲州勝沼の戦い
こうして、あえて地元にも足を留めず、目的地である甲府をめざした旧幕府軍だったが、4日、花咲宿で昼食を取っている最中、新政府軍が明日には甲府に到着する模様との情報がもたらされ、急ぎ駒飼宿まで向かうと新政府軍は既に昨日の時点で甲府に到着していたことが判明。さらに5日には新政府軍は甲府城への入城も果たしていることが判明した。この事態に土方は早駕籠にて帰府。これは援軍要請のためだったとされる。また、一計を案じた近藤は甲府町奉行の若菜三男三郎に書簡を出し、「自分は甲府城の取り締りを命じられ、鎮撫隊として当地に来たが、新政府軍がすでに入城していた。突然甲府に乗り込んでは不敬になり、また我々は新政府軍に抵抗する気は毛頭ないので、若菜の計らいで、しばらく新政府軍の進軍をやめるよう新政府軍の大将に申し出てほしい」と依頼。これは、新政府軍を油断させ、戦闘準備の時間稼ぎをするためだったとされる。
なお、永倉新八は勝沼に着いた時点で総員を点呼したところ「馬丁を合わせて僅に百二十一人、この小勢を以て雲霞のやうに押寄する官軍に対抗すべくもあらぬ」と書いており、これが事実ならば出陣時よりも数が減っていることになる。
この薩土密約に基づき、同年12月28日、京都にいる西郷隆盛から土佐の乾退助あてに、「討幕の開戦近し」との伝令が出された。その予想どおり、明けて慶応4年(1868年)1月3日、鳥羽・伏見の戦いが勃発する。1月4日、土佐藩・山田平左衛門、吉松速之助、山地元治、北村長兵衛、二川元助らの部隊が薩土密約に基づき参戦。その後、錦の御旗が翻る。さらに1月7日、朝廷より「徳川慶喜追討」の勅が出され、これに対抗する勢力は「朝敵」であるとの公式な判断が下った。
こうして両軍が態勢を整える中、3月6日(太陽暦3月29日)12時頃、柏尾坂附近で旧幕府軍が新政府軍に対して発砲したことを発端として戦闘が始まった。しかし、旧幕府軍は地理嚮導役兼大砲差図役を勤めていた結城無二三が近村を回って募兵活動を行っていたため適切な指示が行なえず、散弾と榴弾の弾を間違えるなどの初歩的なミスを犯した。また旧幕府軍は徳川家から提供された大砲6門のうち2門しか運ばなかったため、絶対的火力に差がある状態だった。こうしたことなどから戦闘は新政府軍の優勢で推移した。ただし、白兵戦では旧幕府軍が攻勢に転じた場面もあったとされる。これは合戦当時、勝沼村柏尾に住んでいた野田市右衛門が明治末年頃に著したとされる「柏尾坂戦争記」に記しているもので、近藤らが抜刀して敵陣に斬り込んでから新政府軍の反転攻勢に遭い敗走するまでの経緯は次のようなものである。
その後、谷隊は近藤らの背後より発砲。前後ならびに岩崎山の三方から攻撃され、さしもの近藤もここに進退に窮することに。そんな中、彦根藩士・佐々木一が敵中に斬り込み血路を開き、辛うじて新政府軍の包囲を突破したとされる。