RNAポリメラーゼI
3 kbの配列を含んでおり、これらの間には internal transcribed spacer(ITS1、ITS2)、上流には 5' external transcribed spacer、下流には 3' external transcribed spacer と呼ばれるスペーサー領域が位置している。これらの要素は一緒に転写されて45S pre-rRNAを形成する。45S pre-rRNAはその後、C/D box、H/ACA box snoRNAによって切断され、一連の複雑な段階を経て2つのスペーサー領域が除去されて3つのrRNAが形成される。5S rRNAはPol IIIによって転写される。Pol Iによる転写は単純であるため最も速く働くポリメラーゼであり、対数増殖期にある細胞では細胞内の転写の60%までを占める。
Saccharomyces cerevisiae では、5S rDNAがrDNAリピートの内部に存在するという例外的な特徴を持つ。5S rDNAは転写されないスペーサー領域(NTS1、NTS2)と隣接しており、rDNAの残りの部分とは別にPol IIIによる逆向きの転写が行われる。