タンパク質工学
多価結合は、アビディティ効果によって結合特異性と親和性を高めるために使用することができる。1つの生体分子や複合体に複数の結合ドメインがあると、個々の結合事象を介して他の相互作用が起こる可能性が高くなる。アビディティや有効親和力は、個々の親和力の合計よりもはるかに高くすることができ、標的結合のためのコストと時間効率のよいツールとなる。
部位飽和変異導入は、タンパク質の機能において重要な役割を持つアミノ酸を標的とするために用いられるPCRベースの方法である。これを実行するための2つの最も一般的な技術は、全プラスミドシングルPCRとオーバーラップエクステンションPCRである。
全プラスミドシングルPCRは部位特異的変異導入site directed mutagenesis (SDM)とも呼ばれる。SDM産物はDpnエンドヌクレアーゼ切断に供される。親鎖はアデニンのN6でメチル化されたGmATCを含んでいるため、この切断により親鎖のみが切断される。SDMは10キロベースを超えるような大きなプラスミドにはうまく機能しない。また、この方法は一度に2つのヌクレオチドを置換することしかできない.
オーバーラップエクステンション PCRでは、2組のプライマーを使用する必要がある。各セットの1つのプライマーは変異を含んでいる。これらのプライマーセットを用いた1回目のPCRが行われ、2本の二本鎖DNAが形成される。次に2回目のPCRを行い、これらの二重鎖を変性させ、再びプライマーセットとアニールさせ、各鎖に変異を持つヘテロ二重鎖を生成する。新たに形成されたヘテロ二重鎖の隙間はDNAポリメラーゼで埋められ、さらに増幅される。
これらの機能的貢献の理解を深めることで、将来の設計を改善するためのフィードバックが得られるだろう。
計算機によるタンパク質設計は、タンパク質工学が生体高分子を操作する方法を根本的に変えたが、指向性進化がタンパク質工学の選択法として取って代わることはないだろう。仮説駆動型タンパク質工学のための予測的フレームワークを組み込んだ方法を用いることで、より小さく、より焦点を絞った、機能的に豊かなライブラリーが生成されるかもしれないない。新しい設計戦略と技術の進歩により、従来のプロトコールからの脱却が始まっている。例えば、指向性性進化は、フォーカスされたライブラリーの中でトップレベルの性能を持つ候補を特定するための最も効果的な戦略である。全遺伝子ライブラリー合成は、ライブラリー調製のためのシャッフリングや変異導入プロトコルに取って代わりつつある。また、何百万もの候補をスクリーニングし、選別するという途方もない努力の代わりに、特異性の高い低スループットスクリーニングアッセイがますます適用されるようになっている。これらの開発により、タンパク質工学は指向性進化を超え、生物触媒を調整するための実用的でより効率的な戦略へと移行しつつある。