アレッサンドロ・デ・メディチ
この後フィリッポ・ストロッツィら亡命貴族がフランス王フランソワ1世の支援を得て、復権を賭けてフランス軍と共にフィレンツェに迫ったがモンテムルロの戦い(英語版)でコジモ1世支持の皇帝軍に敗れ、捕らえられた多くの亡命貴族たちは処刑され(ストロッツィも翌1538年に獄中で自殺)、危機を乗り越え自己の立場を確立したコジモ1世は権力強化と駐屯スペイン軍の退去などスペインの影響力排除に取り掛かった。
最初のフィレンツェ統治の頃から傲慢・粗暴な性格で市民の評判が悪く、2度目のフィレンツェ統治でも性格は変わらず、専制君主的な振る舞いと女性たちとの乱脈な関係が一層評判を悪化させた。一方で市民からの苦情聞き取りで寛大な態度を取る一面もあり、ジョルジョ・ヴァザーリと親しくしてパトロンとなり、自分の肖像画制作などを任せたほか、ヴァザーリを遠縁のオッタヴィアーノ・デ・メディチ(英語版)へ預けたり、1536年の自身の結婚式に際して行われた皇帝のフィレンツェ入城の装飾準備を任せるなど厚遇した。ただしミケランジェロとの仲は悪く、治安維持を目的にフィレンツェで要塞建設を企画した際に拒否したミケランジェロを敵視したため、以後彼はフィレンツェを去りローマ滞在を余儀無くされた。ヴァザーリはアレッサンドロ暗殺後は各地を流浪してミケランジェロと親交を結んだりしていたが、1555年にフィレンツェへ復帰してコジモ1世に仕えた。
しかしこの間、1530年3月に父の手で皇帝に戴冠したカール5世により、イタリアはスペインの支配に置かれることが決定、スペイン軍のフィレンツェ市内や要塞駐屯も決められ、クレメンス7世父子を含むメディチ家はカール5世へ従属せざるを得なかった。
1532年4月、カール5世によりフィレンツェ公とされた(先立つ10年前の1522年にもペンネ公に叙爵)。同年発布された布告でフランチェスコ・グイチャルディーニら都市貴族たちによる国制改革が行われ、市民議会として二百人評議会と四十八人評議会が設立、その上にフィレンツェ公を補佐する最高諮問機関が置かれ、フィレンツェはアレッサンドロを頂点に置く君主制と貴族寡頭制の折衷になり、治世初めは父の影響下で穏健な統治を行った。
だが1534年に父が死ぬと専制に走り、イッポーリトを始めフィリッポ・ストロッツィ(英語版)とピエロ・ストロッツィ(英語版)父子、ニッコロ・リドルフィ(英語版)枢機卿、ジョヴァンニ・サルヴィアーティ(英語版)枢機卿ら親族・有力者を追放した。またフィレンツェ政庁(後のヴェッキオ宮殿)の大鐘を破壊して武器に鋳直したり、ミケランジェロ・ブオナローティ作のダビデ像の対比として政庁正門右手にバッチョ・バンディネッリ作のヘラクレスとカクス像を設置、共和制に勝利したメディチ家を表現して市民の反感を買い、市民の武器を没収したり、反逆者を監禁する要塞としてフォルテッツァ・ダ・バッソ(英語版)を建設して市民に恐怖心を抱かせた。