膜電位感受性色素
DiO/DPAペアは、FRETに基づく膜電位感受性色素の一種である (Jonathan Bradley, et al. 2009)。
まず、蛍光分子DiO(カルボシアニン色素の一種)と、クエンチャーであるDPAを細胞へ同時に導入する。DPAはアニオン(負電荷をもつ分子)であるため、膜電位に応答して細胞膜の内膜・外膜間を移動する。DiOと内外膜を移動するDPAの距離によってFRET効率が変化し、膜電位がDiOの蛍光強度へ反映される。
(DPA: dipicrylamine ジピクリルアミン. 2つのピクリン酸から水酸基を取り去ってアミンにしたもの. (ヘキサニトロジフェニルアミンと同一物質?英語版に詳細). ナトリウム塩: CAS 13474-21-0))
Salzbergら (1983) はツメガエル(英語版)の神経性下垂体 (neurohypophsis) をmerocyanine-rhodanine色素 (NK2761) で染色して、活動電位を吸光シグナルとして記録した。この実験で、後葉から得られるシグナルはスパイクのシグナルとそれに続く方向が逆向きでやや持続時間の長いシグナルの2つの成分から成ることが見いだされた。この遅いほうの成分は外液の低Ca 濃度で抑制され、TTXの添加では速い成分、遅い成分とも消失あるいは抑制される。続く実験で、スパイク状の速い成分は神経終末の活動電位を反映した色素の吸光変化であり、遅い成分は色素の吸光変化によるものではなく、神経終末からの神経ホルモン分泌過程を反映した光散乱の変化であることが示された (Salzberg, et al, 1985 ; Obaid, et al, 1989 ; Salzberg and Obaid, 1988)。なお、Salzbergら (1985) は同じタイプのシグナルをマウスの神経性下垂体からも記録している。興奮-分泌連関を光学的シグナルとして捉えたことは神経分泌現象の研究に新しい測定方法を打ち出したものであり、その点でも注目すべきものである。
以上のような背景と実験的基盤のもとにニューロン活動の光学的測定へ向かってのルートがひらかれてきたが、この方法のメリットとしては、
(1) 微小電極も刺入できないほど微小な細胞とか細胞内器官からの電位活動の測定と、
(2) 多数個の細胞とか多数個所の部位から電位活動を同時記録することができる、
ことの2点をあげることができる。L. B. Cohenは1973年にPhysiological Reviews誌に発表した総説のなかで “------, it seems reasonable to imagine an array of 100 photodetectors that would allow simultaneous potential recordings from 100 individual cells.” と述べ、光学的多チャネル測定の可能性を示唆している。 ところで、イカ巨大神経線維での実験で、膜電位の光学的測定のための基礎が確立されたあと、いよいよ神経線維以外での神経組織のニューロン活動を光学的に測定する段取りになった。そのための装置は光学顕微鏡を用いて組み立てられた。膜電位感受性色素で染色した神経組織を載物台に置き、対物鏡を通して実像面 (image plane) に作られた組織の拡大像からphotodiodeを用いて光学的シグナルをdetectするやり方である。これは、現在の顕微測光法のはしりとなったものである。この方法で、まず、ヒルの神経節のN細胞および巨大フジツボの上食道神経節 (supraesophageal ganglion) の単一ニューロンの活動電位がmerocyanine-rhodanine (Dye XVII) およびmerocyanine-oxazolone (NK2367) の吸光シグナルとして記録された (Salzberg, et al, 1973 ; Grinvald, et al, 1977)。