絶対に笑ってはいけないホテルマン24時
蝶野正洋 - サラリーマン
劇団ひとり - 林家ピー
大地真央 - 林家マー子
マツコ・デラックス - SWAT隊長
森昌子 - デビュー時の衣装・髪型で「せんせい」を歌った
前田美波里 - 受付嬢・スガ組トップスター
浜田幸一 - クレーマー
大鶴義丹 - 浜田の子分
竹内力 - ホテル総支配人
目黒祐樹・おばちゃん1号(浅見千代子) - 宿泊客の漫画「コブラ」のコブラ(目黒)と相棒のレディ(おばちゃん)
叶姉妹・村上知子(森三中) - 宿泊客のボインジャー(女性戦隊)
石倉三郎 - 客が紛失したゴルフバックに入っていた3番ウッド
江頭2:50 - VIP客「M.C.エガー」
おぎやはぎ(小木博明・矢作兼) - 夕食の給仕係
大島美幸(森三中) - サウナに居座る迷惑客
小杉竜一(ブラックマヨネーズ) - 「毛多くないプラザホテル」のホテルマン
原西孝幸(FUJIWARA) - 「ギャグプリンスホテル」のホテルマン
木下隆行(TKO) - 「ワシせんとホテル」のホテルマン
今野浩喜(キングオブコメディ(当時)) - 「ホテル胸毛オータニ」のホテルマン
黒沢かずこ(森三中) - 「ホテルネークラ」のホテルウーマン
新おにい(前島コーイチ) - 「アホヴィラホテル」のホテルマン
ガースー黒光りプリンセスホテルからは「大川みつお」が出場する予定だったが、急遽来られなくなったため、代理で山崎が出場。
数字は罰を受けた回数、このうち一番多い人物を赤字、少ない人物を青字で示す。
「笑ってはいけないシリーズ」の通算7作目で、オンエアが歴代シリーズ最長となる6時間(未公開を含むと7時間)、『絶対に笑ってはいけない病院24時』からガキの使いメンバー5人で罰ゲームを実施。
2010年12月8日にDVD16弾として発売された。初回限定版は本編ディスク4枚・特典ディスク1枚が入っている。通常版は上巻と下巻(それぞれ初回限定版のディスク2枚入り)に分けて発売。