アルティメット・スパイダーマン
ブライアン・マイケル・ベンディスとポール・ディニがこの番組の制作を務め、脚本にも参加している。また、『ベン10』や『ジェネレーター・レックス』で有名なアニメーターチーム4人組マン・オブ・アクション(ジョー・ケリー(英語版)、ジョー・ケイシー、ダンカン・ルーロー、スティーブン・T・シーグル)が製作総指揮として参加し、この時点では第1シーズンは全26話分の放送が決定していた。サム・ライミ版スパイダーマン三部作でジョン・ジョナ・ジェイムソンを演じたJ・K・シモンズはこの番組でも同じ役を演じることになっている。また、ロサンゼルス・タイムズとのインタビューでは、マッドハウス版アイアンマンでアイアンマンを演じたエイドリアン・パスダーがアイアンマンを演じることが明かされており、MTVとのインタビューでは声優のケビン・マイケル・リチャードソンがロビー・ロバートソンとブルドーザーを演じることが明かされた。
声 - / 英:スティーブン・ブルーム
第9話(第10話)「スパイダーマンはウルヴァリン?」にて初登場。メスメロの手によりスパイダーマンと精神を入れ替えられた。第4シーズン(シーズン4)には名前のみで登場しない。
声 - 内野孝聡 / 英 - イマリ・ウィリアムス 体表面を鋼鉄のように硬くできる。
声 - / 英:グレッグ・グランバーグ→クランシー・ブラウン
ピーター・パーカーの伯父。第12話(第13話)「ドクター・ストレンジ」では、ナイトメアの生み出した存在として登場し、ナイトメアからはベンおじさんの死がピーターの悪夢であると思われていたが、実際は悪夢ではなかった。
第4シリーズには「ウェブ・スリンガー」の世界のベンおじさん(声 - 秦なおき)が登場。スパイダーマンは自分の世界のベンおじさんとは別人とは知りつつも、彼の世界から去るのを少し惜しんでいた。
声 - / 英:カム・クラーク
「レッキング・クルーとの戦い」にて初登場。
声 - / 英:シャイ・マクブライド
元科学者。魔法の力の宿った鉄球が武器。
声 - / 英:ジェームズ・アーノルド・テイラー
体温が異常なまでの高温になっている悪党で、火の玉を放つこともできる。
第75話、第76話、第77話、第78話「真のチャンピオン決定戦」では1回戦で登場。アイアンマンを倒すが、スパイダーマンに倒される。
声 - 中村浩太郎 / 英:マーク・ハミル
ヒドラの科学者で、遺伝子工学や機械工学の知識に優れており、テクノキネシスを用いることができる。精神を機械に移植したため、頭部がアンテナになっており、表情は腹部にあるテレビ画面に表示される。
キャプテンアメリカとウィザーに破れたのちS.H.I.E.L.Dアカデミーの倉庫に保管されていたが、第66話「シールド・アカデミー」にてアマデウスの不注意で封印が解けて逃走した。かつての宿敵と交戦したのち、スパイダーマンに倒された。
第71話、第72話「アーニム・ゾラの逆襲」では、ニュー・ウォーリアーズをはじめとするS.H.I.E.L.D.アカデミーの面々をシンセゾイドと入れ替え、脱走してきたスパイダーマンたちと対決し、捕えたニュー・ウォーリアーズの面々の能力を盗用してスパイダーマンを苦戦させる。若く健康的なスパイダーマンの肉体を手に入れるという真の目的を果たそうとするも、精神を入れ替えようとした際にライノとエージェント・ヴェノムの妨害に遭い、さらにはスパイダーマンが捕えられた仲間の能力を借りて形勢を逆転した結果、白黒テレビの中に閉じ込められた。
声 - 山本兼平 / 英:バンパー・ロビンソン
ピーター・パーカーがスパイダーマンになってから約1年。高校生とヒーローの二重生活を続けてきた彼だが、デイリー・ビューグル・コミュニケーションズのCEOであるジェイムソンは、激しい「アンチ・スパイダーマン・キャンペーン」を繰り広げていた。
そんなある日、ある悪人を退治したスパイダーマンの前に諜報機関S.H.I.E.L.D.の長官ニック・フューリーが現れる。組織の情報網でピーターの正体を知っているフューリーは、結果的に街に損害を与える形となった彼にスパイダーマンがヒーローとして未熟であると指摘。S.H.I.E.L.D.で訓練を受ければ「アルティメット・スパイダーマン」(最高のスパイダーマン)になれると誘いをかけてくる。こうして、S.H.I.E.L.D.のメンバーとしてのスパイダーマンの新たな戦いが始まった。
声 - / 英:トム・ケニー