リアルタイムPCR
Realtime PCRでの定量方法は、コピー数を算出する絶対定量法と相対値で発現を調べる相対定量法に分けられる。 絶対定量法とは、あらかじめ濃度の分かっている目的産物のDNAを段階希釈し、希釈系列を用いてReal time PCRを行い検量線を書き、濃度不明のサンプルのCt値を検量線にあてはめコピー数を計算するものである。主にウイルスや細菌の検出に用いられる。一方で、相対定量法は、主にmRNAの発現の定量に最も一般的に用いられている方法で、目的遺伝子とリファレンス遺伝子を同時に解析しリファレンス遺伝子に比べ、目的遺伝子がどれだけ発現しているかを相対的に比較したものである。前提条件として、リファレンス遺伝子と目的遺伝子の増幅効率が同じであること、解析する全てのサンプルでリファレンス遺伝子が安定して一定に発現していることが重要である。PCRの増幅効率を確認する方法としては、検量線の傾きをSlopeとし、 E = 10 − 1 / S l o p e − 1 {\displaystyle E=10^{-1/Slope}-1} で計算が出来る。
SYBR green法の利点は、プローブの設計や用意を必要としないため、プローブアッセーと比べ安価である。欠点としては、プライマー二量体のような非特異的な二本鎖DNAも検出してしまうこと、マルチプレックス解析が行えないことが挙げられる。 プライマー二量体が非特異的に検出されていないかを確認するためには、融解曲線分析を行う。
リアルタイムPCR(Real-time PCR)は、定量PCR(Q-PCR)のひとつ。ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) による増幅を経時的(リアルタイム)に測定することで、増幅率に基づいて鋳型となるDNAの定量を行なう。
この定量は蛍光色素を用いて行われ、インターカレーション法とハイブリダイゼーション法、LUX法がある。インターカレーション法では、二本鎖DNAに特異的に挿入(インターカレート)して蛍光を発する色素 (SYBR green I) を用いる。一方で、ハイブリダイゼーション法はTaqManプローブ法が最も一般的であり、DNA配列に特異的なオリゴヌクレオチドに蛍光色素を結合させたプローブを用いる方法である。