ペプチド合成
すでに述べた通り、ペプチド結合を形成するにはカルボキシ基を活性化して反応性を高める必要がある。現在のペプチド合成では、縮合剤を用いて活性化するのが一般的である。
カルボキシ基を脱離能の高いアルコキシ基といったん縮合させたエステルを作り、これにアミノ酸を反応させる方法が活性エステル法である。ニトロフェノールやN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)、ペンタフルオロフェノール等とのエステルが用いられる。
活性エステル化法は後述する環状ペプチドの形成や繰り返し単位を持つポリペプチドの合成に用いられる。繰り返し単位となるジペプチドやトリペプチドのα-カルボキシ基を活性エステルとした後、α-アミノ基を脱保護すると重合が起こりポリペプチドが形成される。
DNA断片を組み込んだベクターをターゲットとなる細胞に導入する方法はいくつかある。大腸菌では塩化カルシウムや塩化ルビジウムで処理してコンピテントセルとしてプラスミドを取り込ませる方法、マイクロインジェクションにより直接導入する方法、電気により細胞膜に穴を開けてそこからプラスミドを導入する電気穿孔法などがある。酵母では細胞壁のペプチドグリカンを除去したスフェロプラストにDNAを取り込ませるスフェロプラスト法、酢酸リチウム溶液で処理してDNAを取り込ませる酢酸リチウム法などがある。
α-アミノ基の保護基はカルボキシ基との縮合の時に他の保護基を残したまま、選択的に脱保護できなくてはならない。前述のようにアミノ酸のラセミ化を防ぐ機能を持つカルバメート型のアミノ基の保護基が種々開発されてきた。現在、主に用いられる保護基はベンジルオキシカルボニル基(CbzあるいはZ)、tert-ブトキシカルボニル基(Boc)、フルオレニルメトキシカルボニル基(Fmoc)の3種である。
Z基はクロロギ酸ベンジル(ZCl)とのショッテン・バウマン反応で導入できる。脱保護はフッ化水素酸などの処理の他、水素化によっても行うことができる。Boc基は二炭酸ジ-tert-ブチル(Boc2O)とのショッテン・バウマン反応で導入できる。脱保護はトリフルオロ酢酸による処理で行うことができる。Fmoc基はN-(フルオレニルメトキシカルボニルオキシ)コハク酸イミド(FmocOSu)とアミンを反応させることで導入できる。脱保護はピペリジンによる処理で行うことができる。Fmoc基は固相合成に専ら用いられる。
また特別に区別して脱保護することが必要な場合には、アリルオキシカルボニル基(Alloc)、(1-(4,4-Dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-ylidene)-3-eth-yl) 基 (Dde) や 1-(4,4-Dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-ylidene)-3-methylbutyl基 (ivDde) が用いられる。Alloc基はテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)で処理するとπ-アリル錯体を形成して脱保護される。Dde基、ivDde基はヒドラジンで処理することで脱保護される。
液相法とは別に1963年にロバート・メリフィールドらがペプチド固相合成法を開発し全く新しいペプチド合成法も確立している。メリフィールドはこの業績によりノーベル化学賞を授与された(1984年)。固相合成法は機械化が容易な手法な為、今日では配列情報から自動的にペプチドを合成するペプチド合成装置も開発されている。
今日ではサンプル量が必要であったり、簡単な設備で単純なペプチドを合成する場面では液相法が用いられるが、分子生物学研究の為にある程度の配列長を持つ任意のペプチドを合成する場合にはもっぱら固相合成法とペプチド合成装置が利用される。さらに、多様なオリゴペプチドが試薬として市販されたり、ペプチドの各種委合成サービスが提供されたりしているので、必ずしも現場でペプチド合成を行う必要もなくなってきている。
また、後述のように、固相合成法では合成が困難な長さのペプチドを合成したい場合やペプチド鎖に糖鎖修飾などが必要な場合は細菌、線虫あるいは昆虫細胞に遺伝子導入するバイオテクノロジーを応用してペプチド合成がなされるようにもなった。
↑ 1980年代には液相法によるペプチド合成装置も開発されたが今日では固相合成法に基づく装置にとって代わられた
↑ 泉屋信夫ら、1.2.2.ペプチド合成の歴史、『ペプチド合成の基礎と実験』、pp4-5.丸善、1985. ISBN 4-621-02962-2.