ゲル内消化
次がゲル内消化という名の由来となるステップである。タンパク質は酵素によって少数のペプチド断片へと分解される。タンパク質ごとにどんな質量の断片が生じるかに特徴があるため、これを利用してタンパク質を同定するのである。タンパク質分解酵素としてはセリンプロテアーゼの一種トリプシンが頻用されている。トリプシンは塩基性アミノ酸(アルギニンとリジン)のC末端側のペプチド結合を特異的に切断する。ただしペプチド結合の相手が酸性アミノ酸(アスパラギン酸とグルタミン酸)である場合には効率が落ち、プロリンの場合には切断されない。
タンパク質分解酵素を使うことによる望ましくない副作用として、酵素の自己消化がある。かつては反応液中にカルシウムイオンを加えることでこれを抑えていた。現在はリジン残基の選択的メチル化によりアルギニン消化部位の自己消化活性を抑えたトリプシンが供給されている トリプシンの至適温度は元来35°Cから45°Cだが、この修飾により50°Cから55°Cに変わる。。
ゲル内消化に使われる酵素としては他にも、エンドペプチダーゼのLys-C、Glu-C、Asp-N、Lys-Nがある。こうした酵素はそれぞれ1種のアミノ酸で特異的に切断するため、より長く少数のペプチド断片が得られる。タンパク質の一次構造(アミノ酸配列)を完全に決定する場合は、通常1種類の酵素だけでは不可能であり、異なる酵素を使った解析を組み合わせることが必要になる。
最後にタンパク質分解で生じたペプチド断片をゲル中から抽出する必要がある。ゲル片に抽出溶液を加えて上清を回収すれば良く、これを複数回繰り返すことがよく行われている。 ただし1回目の抽出でほとんどのペプチドが回収され、2回以上繰り返しても収量はせいぜい5-10%ほどしか増えない。物理化学的性質の異なるペプチドを抽出するためにさらに条件を変えて抽出を行う。酸性のペプチドには分解反応の時と似た組成の溶液を用い、塩基性のペプチドには低張な酸性溶液(ESIにはギ酸、MALDIにはTFA)を用いる。モデルタンパク質を使った研究によれば、ゲルからの抽出効率はおよそ7-8割である。多くのプロトコルでは抽出溶液に30%以上のアセトニトリルを加えており、これによってペプチドが反応チューブやピペットチップに吸着するのを抑えている。回収した抽出液をまとめ、遠心濃縮機で濃縮ないし乾燥させる。乾燥させたペプチドは-20°Cで6ヶ月以上保存可能である。