デマルカシオン
イングランド王ヘンリー7世は、1496年に続いて(#世界分割に対する反論の節参照)、新たな航海の特許を1498年2月3日にジョン・カボットに与えた。これに対してスペインのカトリック両王はペドロ・デ・アヤラを派遣し、1498年7月5日付書簡でカボットが踏査した土地も踏査する予定の地も、教皇勅書とトルデシリャス条約でスペインに留保された圏内にあることを告げたが、ヘンリー7世は取り合わなかった。1498年5月にブリストルを発したジョン・カボットの第2次遠征隊は、5隻の船のうち4隻が失われ、カボット自身も死去し、失敗に終わった。
1502年12月9日にヘンリー7世がヒュー・エリオットに発布した航海特許状では、踏査の対象から除外すべき土地は「ポルトガル国王その他によって発見されかつ占有されている」ことを条件とした。これによりヘンリー7世は、カボットに特許を出した時のように「発見したという事実」を容認するのではなく、発見しただけでなくその地を実効的に占有していることを重視する立場を示した。
ヘンリー8世の治世ではウィリアム・ホーキンス(ジョン・ホーキンスの父)が南米のガイアナやブラジルへの航路を探索したがスペイン勢力がまだ強い当時は貿易路開拓は果たせなかった。イングランドはスペインの勢力がおよばない海域を探り、1553年にヒュー・ウィロビーとリチャード・チャンセラーが東回りの貿易路(北東航路)を開拓してモスクワに到達、モスクワ会社を設立する。
宗教改革が始まり、教皇の権威が衰退することで、分界線の意味は変化していった。
世界を二分割しそれぞれを領有する権利をスペイン・ポルトガルが有する根拠が教皇の権威にある以上、その権威が揺らぐことで分界線の効力も弱まった。分界線を無視してイングランドやフランスが海外進出してゆくにつれ、教皇子午線は旧世界と新世界、ヨーロッパとアメリカを分割する線を意味するようになっていった。「旧世界=ヨーロッパ」は「無主」の土地はすでに無く、戦争を抑止するヴェストファーレン体制が形成されて、秩序やルールが生まれた。一方「新世界」は、ヨーロッパ諸国家同士の約束事が通じない、自由に奪い合うことができる領域で、「先占と拡張のための自由なフィールド」であり「巨大な陸地取得における粗野なつかみ取り」となっていた。
ドイツの法学者カール・シュミットによれば、分界線の変化の兆候は1559年に締結されたカトー・カンブレジ条約に付帯する密約で、フランスとスペインがヨーロッパにおける宗教戦争では旧教(カトリック)国同士互いに協調するが、「新世界」ではその限りではないと確認したことにあった。