攘夷実行の勅命
5月10日、「国土が焦土になっても開港交易は認めない(譬皇国一端黒土成候共開港交易ハ決而不好候)」とする天皇の書簡(宸翰)が発せられた。
長州藩は同日、関門海峡を通過したアメリカ船に砲撃を加え、その後も外国船への砲撃を実施する。だが、朝廷の求める攘夷を武力で実行に移したのは一般に長州藩だけとされ、6月にはアメリカ、フランスの軍艦が下関の砲台に報復攻撃した。実際には長州藩のほか、鳥取藩から大坂湾警備(藩主の池田慶徳は朝廷から「摂海守備総督」に任じられていた)についていた兵士が6月14日に天保山沖のイギリス船に5発の砲撃(弾着せず)を実施した。
生麦事件の当事者だった薩摩藩に対しては、7月にイギリスの軍艦が犯人引き渡しと賠償金を求めて鹿児島に来港し、交渉決裂に伴って鹿児島市街を砲撃した(薩英戦争)。しかし、島津久光は前記のように急進的攘夷論とは距離を置く立場で、生麦事件も偶発性の高いものだった。イギリスとの交戦は先方の主張を受け入れる形で停戦し、「破約攘夷」が目的ではなかったものの、結果として「攘夷戦争」に敗北した。
文久2年11月27日、江戸城に入った勅使の三条実美(ほかに副使姉小路公知)が家茂に「醜夷を拒絶すべし」と破約攘夷の実行を求める勅書を手渡した。実美は急進的攘夷論者で、勅使派遣も朝廷の急進的攘夷派が主導して実施された。勅書は諸大名との合議により攘夷戦略を決めるよう求めるものだった。外国奉行などが勅書に反対したが、12月5日に家茂は、勅書を受け入れて来春に京都に上り攘夷の詳細を説明するという回答書を提出、実美はこれを携えて12月23日に京都に帰着した。将軍の「上洛」は寛永11年(1634年)の徳川家光以来229年ぶりのことだった。
12月9日に朝廷は国事御用掛を設置し、29人の公家を任命する。その人選は「公武合体派」とされた青蓮院宮(中川宮)から三条実美ら急進的攘夷派まで含んでいた。しかし急進的攘夷派は文久3年(1863年)2月11日に長州藩士(久坂玄瑞ら)や公家が関白の鷹司輔煕に攘夷期限決定を迫るなどの圧力を加える。2月13日に国事御用掛に国事参政・国事寄人という職が設けられて、急進的攘夷派の中級以下の公家が任じられた。これは急進的攘夷派による事実上の「乗っ取り」であった。また、これに前後して朝廷では関白が近衛忠熙から鷹司輔煕に交代したり、正親町三条実愛と中山忠能が議奏を辞任するといった人事の変動があり、攘夷に穏健的な公家が中枢部から遠ざかることになった。