タンパク質工学
この方法では、複数の親遺伝子から複数のクロスオーバーを持つ遺伝子のライブラリーが得られる。この方法では、親遺伝子間の配列の同一性は必要ないない。しかし、すべてのクロスオーバー位置に1~2個の保存アミノ酸が必要である。まず、親遺伝子の配列をアライメントし、クロスオーバー部位となるコンセンサス領域を特定する。その後、制限部位を含む特定のタグを組み込み、Bac1による切断でタグを除去することにより、末端が凝集した遺伝子が得られる。これらの遺伝子断片を適切な順序で混合してライゲーションし、キメラライブラリーを形成する。
化学的変異導入は、化学試薬を使用して遺伝子配列に変異を導入することである。化学的変異原の例を以下に示す。
二硫酸ナトリウムは、G/Cに富んだゲノム配列の変異に効果的である。これは、二硫酸ナトリウムがメチル化されていないシトシンのウラシルへの脱アミノ化を触媒するためである。
メタンスルホン酸エチルはグアニジン残基をアルキル化する。この変化により、DNAの複製時にエラーが発生する。
亜硝酸はアデニンとシトシンの脱アミノ化により転化を起こす.
ランダム化学変異導入の二重アプローチは、反復的な2段階のプロセスである。まず、EMS(メタンスルホン酸エチル)によって目的の遺伝子をin vivoで化学的に変異させる。次に、処理した遺伝子を単離し、プラスミドバックボーンの変異を防ぐために、未処理の発現ベクターにクローニングする。この手法で、プラスミドの遺伝的性質が保たれる。
無性進化法では親遺伝子間のクロスリンクは発生しない。単一遺伝子を用いて、様々な変異導入技術を用いて変異体ライブラリーを作成する。これらの無性進化法では、ランダムな変異導入と標的をしぼった変異導入のいずれかに分類ができる。
この方法は、相同性を持たない複数のDNA断片を、1回のPCRでシャッフルするものである。その結果、異なる構造単位をコードするモジュールが組み合わされ、完全なタンパク質が再構築される。
本方法は、DNAシャフリングとITCHYを組み合わせることにより、多重クロスオーバーを抑制するハイブリッド遺伝子のライブラリーを作成するものである。本方法は、まず2つの独立したITCHYライブラリーを構築する。一つは、遺伝子AをN末端に持つもの。そしてもう一つは、N末端に遺伝子Bを持つものである。これらのハイブリッド遺伝子断片は、制限酵素切断または末端プライマーを用いたPCRにより、アガロースゲル電気泳動で分離される。これらの分離された断片を混合し、さらにDNaseIを使って切断する。切断された断片は、テンプレートスイッチングによるプライマーレスPCRで再組み立てされる。
これは、PCRに基づく方法である。カセット変異導入法では、まず、目的の遺伝子を含むDNAカセットを合成し、その両側を制限部位で挟む。この制限部位を切断するエンドヌクレアーゼは、標的プラスミド中の部位も切断する。DNAカセットとターゲットプラスミドの両方をエンドヌクレアーゼで処理し、これらの制限部位を切断して粘着性のある末端を作る。次に、この切断からの生成物が一緒にライゲーションされ、その結果、遺伝子が標的プラスミドに挿入される。コンビナトリアルカセット変異導入と呼ばれるカセット変異導入の別の形態は、目的のタンパク質中の個々のアミノ酸残基の機能を同定するために用いられる。その後、再帰的アンサンブル突然変異導入は、以前のコンビナトリアルカセット突然変異導入からの情報を利用する。コドンカセット突然変異導入法では、二本鎖DNAの特定の部位に単一のコドンを挿入または置換することができる。
この方法は、メタゲノム試料から直接キメラ遺伝子を生成するものである。まず、メタゲノムDNAサンプルから機能スクリーニングにより目的の遺伝子を単離する。次に、特異的なプライマーを設計し、異なる環境サンプルからの相同遺伝子を増幅するために使用する。最後に、増幅された相同遺伝子をシャッフルしてキメラライブラリーを作成し、目的の機能クローンを取得する。