ヌクレアーゼ
DNAの複製中に、DNAポリメラーゼは、相補的な鋳型鎖に対して新しいDNA鎖を伸長させる。ほとんどのDNAポリメラーゼは、ポリメラーゼと校正エキソヌクレアーゼという2つの異なる酵素的なドメインから構成されている。ポリメラーゼは、新しい鎖を 5'→3' 方向に伸長させる。エキソヌクレアーゼは、同じ鎖から誤ったヌクレオチドを 3'→5' 方向に除去する。このエキソヌクレアーゼ活性は、DNAポリメラーゼが校正を行うために不可欠である。これらのヌクレアーゼを不活性化したり失ったりする欠失は、影響を受けた微生物の突然変異率や死亡率を増加させ、マウスでは発癌率を増加させる。
すべての制限エンドヌクレアーゼが、上記のHindIIのように対称的に切断し、平滑末端を残すわけではない。多くのエンドヌクレアーゼは、互いに正対しない位置でDNA主鎖を切断し、オーバーハングを形成する。たとえば、ヌクレアーゼEcoRIの認識配列は5'—GAATTC—3'である。
酵素はこの配列に遭遇すると、Gと最も近いA塩基残基の間の各骨格を切断する。切断されて生成した断片は、互いに相補的な塩基を接続する比較的弱い水素結合によってのみ保持される。この結合の弱さは、DNA断片が互いに分離することを可能にする。得られた各断片には、不対塩基からなる突出した5'末端がある。別の酵素は、DNA骨格に切れ目を作り、3' 末端が突出する。突出した末端(3' と 5' ともに)は、塩基の相補的な配列と結合する傾向があり、そのために「粘着末端(英語版)」と呼ばれることもある。言い換えると、不対配列5'—AATT—3'が別の不対配列3'—TTAA—5'に遭遇すると、互いに結合する。これらは互いに粘着性を持つ。次にリガーゼと呼ばれる酵素が用いられて、2つの分子のリン酸骨格を結合する。粘着末端の細胞由来、あるいは種由来でさえ、その粘着性に影響を与えない。たとえ配列の一方がヒトDNAに由来し、もう一方が細菌DNAに由来する場合でも、相補的配列の任意の組は結合する傾向がある。実際、この粘着性の性質によって、異なる起源のDNAから構成される組換えDNA分子の作成が可能となり、遺伝子工学技術が誕生した。