ゲル内消化
ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離されたタンパク質は、通常CBBのような色素や銀染色などによって可視化される。その状態で目的タンパク質を切り抜き、脱染色してから解析を進めることになる。
CBBの脱染色にはアセトニトリルなどの有機溶媒を加えた重炭酸アンモニウム(NH4HCO3)緩衝液が用いられる。有機溶媒によりタンパク質との疎水的相互作用が緩和され、一方緩衝作用により正に帯電したアミノ酸とのイオン結合が弱められることで、CBBが取り除かれやすくなる。 また脱染過程は温度を上げることで促進される。なお脱染によりある程度(1割以下)のタンパク質が失われる。CBBの除去は最終的なペプチド収量には影響しない。
銀染色されたタンパク質の場合、フェリシアン化カリウムや過酸化水素によって銀を酸化し、生じた銀イオンをチオ硫酸ナトリウムに配位させて取り除く。
一般的に時間がかかり、また多くの操作を必要とするためケラチンなどの混入が起こりやすいという点が挙げられる。方法自体を最適化し、専用の反応チューブを使用することで改善できる 。
さらに大きな問題は、取り扱い中に試料が失われてしまうことである。タンパク質の質量分析ではしばしば検出限界近辺での解析が行われるため、わずかなロスが解析の成否を決めかねない。原因としては反応途中でのゲルからの流出、反応チューブやピペットチップの表面への吸着、ゲルからのペプチド抽出が不完全、質量分析計でのイオン化不良などが挙げられる。損失率はペプチドの物理化学的性質によって15-50%と幅があるが、このばらつきが原因でサンプルロスに対する万能な解決策は今のところ見付かっていない。
ゲルマトリックス中に閉じ込められているタンパク質を分解するためには、酵素がタンパク質と接する必要がある。そこでゲル断片をアセトニトリルで脱水してから酵素を含むバッファーで膨潤させることでゲル中に酵素が浸透されると考えられている。しかしゲルへの酵素の浸透を解析したいくつかの研究によれば、この過程は膨潤とは関係なく単なる拡散によって起きていることが示されている。したがって、ゲル内消化の効率改善にはタンパク質までの距離を短くすること、たとえばゲル片を小さく刻むことが必要になる。
通常ゲル内消化には一晩かける。トリプシンを用いて37°Cで反応させる場合はたいてい12-15時間をかけている。しかし時間を追って検討した実験によれば、3時間でも質量分析には充分であることが示されている。さらに温度やpH、添加物などの反応条件を最適化すれば30分で反応を終えることもできる。
界面活性剤があるとゲル中でのタンパク質の変性を促進することができ、その結果反応時間の短縮、分解の促進、またとくに膜タンパク質のような疎水的タンパク質の場合は抽出されるペプチドの収量増大などにつながる。この場合、質量分析の邪魔にならないように、オクチルグルコシドや、PPSのような酸性条件下で開裂するような界面活性剤を用いる。