サン・バルテルミの虐殺
だが、パリは強硬な反ユグノー派都市であり、熱烈なカトリックであるパリ市民はユグノー貴族たちの存在を許容できないと感じており、カトリック説教師たちに扇動されたパリ市民はフランス王族がプロテスタントと結婚することに恐怖していた。
この悪感情には凶作と重税への不満も混じり合っていた。食糧価格の値上がりと、王室結婚のための贅沢な装飾はパリ市民の反感を受けた。緊張が高まる中、カトリックの守護者と見なされていたギーズ公へのパリの民衆の期待が高まった。
プロテスタントとカトリックとの混合結婚式(mariage du mixtes)は8月18日にパリ市内のノートルダム聖堂で挙行された。取り決め通りにナバラ王は祝福のミサには出席せず、新婦のみが聖堂に入り、その間、新郎は外で待機する奇妙な形式で執り行われた。ブルボン枢機卿が結婚の同意をマルグリットに求めた際に彼女は沈黙して同意の言葉を発さず、立腹したシャルル9世が彼女のうなじを抑えて強引に同意の印とさせている。
挙式後の数日間、盛大な祝祭行事が行われたが、カトリックとプロテスタントとの関係は一層険悪化する。ギーズ家とライバル関係にあるパリ総督モンモランシー公フランソワ(英語版)は危険な情勢を察知してパリから退去してしまった。
1562年、カトリーヌは内戦を回避すべくサン=ジェルマン勅令(一月勅令)を発し、プロテスタントに一定の制限の下での礼拝の自由を容認するが、ギーズ公の兵士がプロテスタントを虐殺する事件(ヴァシーの虐殺)が起き、内戦は不可避となった。
ユグノーの指導者コンデ公とコリニー提督は兵を集めて諸都市を攻撃するとともに、イングランド女王エリザベス1世とハンプトン・コート条約を結び援助を取りつけた。国王軍は反撃に出て、ルーアンを陥落させるが、この戦いでナバラ王アントワーヌ(カトリックに改宗して国王軍の司令官になっていた)が戦死している。ドルーの戦いで国王軍はコンデ公を捕虜にし、カトリック陣営が優勢になるが、オルレアン包囲戦の最中にギーズ公フランソワが暗殺されてしまう。ギーズ家はコリニー提督が暗殺の黒幕と信じた。強硬派だったギーズ公フランソワの死により、カトリーヌが和平を調停し、1563年に和議が成立した。
1567年まで約4年間一応の平和は保たれたが、プロテスタントとカトリックの対立は続き、国王・母后のスペインへの接近を警戒したユグノー陣営が国王奪取を企てたため(モーの奇襲)、内戦が再開した(第二次戦争)。