プロトプラスト-PEG法
この段階では、プロトプラストにポリエチレングリコール (polyethyleneglycol, PEG) を作用させて、DNAを細胞内部に取り込ませる。このDNAの飲み込みの仕組みはまだ良く分かっていない。
この形質転換法において最も重要な手順がこのプロトプラスト化である。プロトプラストは、浸透圧調整剤(マンニトールなど)の存在下で、糸状菌の菌糸から細胞壁溶解酵素によって調整する。形質転換に適したプロトプラストは糸状菌の株に依存するので、それぞれの菌においてプロトプラスト化の最適化が必要になる。