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南北朝時代になると、行阿が『仮名文字遣』(1363年以降成立)を著し、仮名遣いの対象語数は1000語以上と大幅に増やした。しかしこのころの京都方言のアクセント体系には非常に大きな変化が生じており、アクセントの高低が変化した語も少なくなかった上に、複合語になるとアクセントが変化する現象なども生じていた。それまでの京都のアクセントでは、二つ以上の言葉が複合語になるなどしてもそれぞれ同じアクセントに保たれたので、同じ語をアクセントにより常に一貫した仮名で書くことも可能だったのである。これらの変化により、/wo/の音を含む言葉もアクセントが変化する例が多く現れ、『仮名文字遣』の「を」と「お」のアクセントによる書き分けは、それまでの仮名遣いとは食い違うことになった。このアクセントの変化について当時の人々は気づくことができず、長慶天皇は『仙源抄』でこの「を・お」の書き分けに当時のアクセントと合わないものがあったことから、定家の定めた仮名遣いを批判した。しかしこののち一般には『仮名文字遣』に記される仮名遣いが「定家仮名遣」として世に広く受け入れられ、「を・お」の書き分けもこれが典拠とされた。定家仮名遣は和歌や連歌など歌道の世界などで広く使われたが、それ以外の分野では「を」「お」および語中・語尾の「ほ」の書き分けは混用した状態が続いた。
16世紀(室町時代後期)のキリシタン資料におけるローマ字表記では、オとヲは語頭・語中・語尾いずれにおいても uo や vo で表記されている(当時は W という文字は確立しておらず、/w/ にも V が用いられた)ことから、この時代においてもオ、ヲの発音は /wo/ であったことが分かる。