STS-35
漏れの修理は発射台上ではできず、6月12日にスペースシャトル組立棟に戻され、その後、さらにオービタ整備施設に移された。オービタ側面の43cmアンビリカルケーブルは、当時建設中のスペースシャトル・エンデバーから借用したものと交換され、外部燃料タンクとも接続された。ASTRO-1は、再整備のうえ、オービタの修理と再処理中、コロンビアのカーゴベイの中で保管された。
コロンビアの打上げは、1990年9月1日に再設定され、8月9日に第39A発射台に移された。打上げの2日前、ASTRO-1のBBXRT-01のアビオニクスが故障し、変更と再試験が必要となった。打上げは、9月6日に再延期された。燃料注入中、オービタ後部区画で高濃度水素が検出され、打上げはさらに延期になった。NASAでは、当初から、水素の漏れは2か所で発生していたと結論付けた。1か所が既に交換されたアンビリカルケーブル、もう1か所以上が再塗装されたオービタの後部区画であり、後部区画に置かれた3つの水素再循環ポンプが疑われた。これらは交換され、再試験された。また、メインエンジンの第3水素プリバルブの損傷したテフロンカバーシールも好感された。打上げは、9月18日に再延期された。
チャレンジャー号爆発事故の前まで、このミッションは、STS-61-Eとして、1986年3月に打ち上げられる予定だった。2度目の宇宙飛行となるジョン・マクブライドが船長を務める予定であったが、彼は1989年5月にNASAを引退することを決断し、ヴァンス・ブランドに交代となった。さらに、操縦手のリチャード・リチャーズ、ミッションスペシャリストのデヴィッド・ルーズマは、それぞれガイ・ガードナー、ジョン・M・ラウンジに交代となった。当時59歳のブランドは、1996年に61歳のストーリー・マスグレーヴがSTS-80で宇宙に行くまで、宇宙飛行の最年長記録であった。
地上のアマチュア無線従事者とスペースシャトル内のアマチュア無線従事者の間での短波の伝送は、後のShuttle Amateur Radio Experiment (SAREX-II)の基礎となった。SAREXでは、音声、低速度走査テレビジョン、データ、またはアップリンクのみであるがアマチュアテレビジョンの4つのうちの1つのモードで、オービタの視線上のアマチュア局と交信する。音声モードは有人モードであるが、その他の3つは有人モードでも無人モードでも運用できる。ミッション中、SAREXは、オービタやその他のペイロードの運用が予定されていない時に、免許(WA4SIR)を持つパリーゼにより運用された。また、ハワイにある空軍マウイ光学及びスーパーコンピューティング天文台の電子光学センサの校正の実験も行われた。学生の科学、数学、技術に対する興味を喚起するためのSpace Classroom Program, Assignment: The Starsプロジェクトが行われ、1990年12月7日にホフマンが史上初めての宇宙からの授業を行い、電磁スペクトルとASTRO-1に関する資料を説明した。またこれを補足する授業がハンツビルのASTRO-1コントロールセンターから行われた。
ミッションスペシャリストは、望遠鏡を対象の天体に向けるために、IPSを操作した。また、オービタのスラスターが噴射した場合にも指向システムを安定させられるため、ガイド星をロックした。ペイロードスペシャリストは、来る観測に備えてそれぞれの機器を設定し、ガイドテレビ上の対象天体を同定し、望遠鏡の視野の中に天体を正確に捉えるため、必要な補正を行った。その後、機器による一連の観測を始め、記録されたデータをモニターした。多くの観測の作業量が多いため、ミッションスペシャリストとペイロードスペシャリストは協力して、これらの複雑な操作を行い、観測の質を評価した。各観測には、10分から1時間強程度の時間がかかった。
指向システムの指向の精度とミッション中のデータ表示ユニットの連続過熱による障害は、乗組員による指向の手順に影響を与えたため、マーシャル宇宙飛行センターの地上チームが望遠鏡の微調整を行うことになった。BBXRT-01は、当初よりゴダード宇宙飛行センターのオペレータが運用しており、影響を受けなかった。X線望遠鏡は、乗組員の操作をほとんど必要としなかった。乗組員は、運用開始時にBBXRT-01とTAPSの電源を入れ、運用終了後に電源を切った。