本圀寺の変
12月24日、松永久秀も織田信長への礼のため岐阜に下った。すると三好三人衆がこの隙を突いて動き出した。12月28日、美濃の旧国主斎藤龍興らを先鋒として、将軍方の三好義継家臣が守る堺南方の和泉家原城を攻め落とすと、三人衆は永禄12年(1569年)1月2日に堺を立って京へ向かい、4日に東福寺近辺に陣を置くと、まず京の将軍の詰城である勝軍地蔵山城をはじめとして、洛東や洛中周辺諸所に放火して将軍の退路を断った。
これに対し、義昭は本国寺に籠城する構えを取った。翌日、三人衆は1万余の軍勢(5千とも8千ともいう)で攻め寄せ昼頃に合戦となったが、将軍直臣に信長家臣・若狭武田氏家臣を合わせた幕府軍2千が必死に防戦に当たり、若狭衆の山県盛信・宇野弥七らの奮戦により、三好勢の先陣薬師寺貞春勢が寺内への進入を幾度も阻まれるなどしているうち日没に至ったため、三人衆側は兵を収めた。将軍側は足軽衆など20人余りが討死したが、寄せ手の死者・負傷者も多数に上ったと伝わる。後年本能寺の変を引き起こす明智光秀が将軍側の一員として戦っており、この頃から歴史の表舞台に登場する。
この間に細川藤孝、北河内の三好義継、摂津の池田衆・伊丹衆などが将軍の救援として攻め上り、6日に七条の三好勢を三方から攻撃した。本国寺の籠城軍もこれに呼応して打って出た。不利を悟った三好勢は退却するものの将軍方に追いつかれ、桂川河畔で合戦に及んで敗北し、客将となっていた小笠原信定など多数が討死した。戦死者の数は、『信長公記』は首注文のある分として6名と「歴々の討取り」を記すだけだが、『細川両家記』では双方で8百余、『言継卿記』によれば千余、『足利季世記』によれば2千7百余、『永禄記』によれば数千という。