おはスタ
ズームアウトの時はぬいぐるみになる。やまちゃんからは一貫して「ハムちゃん」と呼ばれた。
Qoo(声優:?) - 2001年4月から9月までは『レッツクーダンス』というアニメコーナーに出演。2007・2008年4月 - 9月までは『ちゃんと食べよう体操』で出演した。
ミルモ(声優:小桜エツ子) - 『わがまま☆フェアリー ミルモでポン!』関連のコーナーに出演した。土曜日から火曜日に移動後は毎週火曜日に魔法をかけて今週のお話をやまちゃんたちに紹介させた。
ジャポニカ王子(声優:竹内順子)※
東和馬(声優:小林由美子) - 毎週火曜日に『焼きたて!!ジャぱん』の宣伝にデフォルメ化して出演した。(2004年10月 - 2006年3月) ※
なーさん(声優:池田千草) - きらりん☆レボリューション関連のコーナーに出演した。ズームアウトの時はぬいぐるみになる。
テルキヨ(声優:植竹香菜) - 水曜日に鉄拳王とともに「兄ふんテルキヨのグッドサンデー!」という『週刊少年サンデー』紹介コーナーに出演した。(兄ふんじゃったより、2006年 - 2007年冬)
チワ丸(声優:関山美沙紀) - 水曜日に鉄拳王とともに「お坊サンバ!!チワ丸のあわわサンデー!」という『週刊少年サンデー』紹介コーナーに出演した。(お坊サンバ!!より、2007年冬 - 2008年)
ケシカスくん(声優:岩田光央) - 『ケシカスくん』関連のコーナーに出演した。(2008年 - 2010年、2013年3月4日 - 6日)
フォンブレイバー7(声優:河本邦弘) - 毎週水曜日に『ケータイ捜査官7』の宣伝のために登場し、ダンスを披露したりした。
2016年10月14日(13日深夜)から2018年3月30日(29日深夜)まで金曜2時5分 - 2時35分(木曜日深夜)にテレビ東京で放送された深夜版。初代司会者を務めた山寺がメインMCを務め、過去に人気を集めたアニメ、漫画、ゲーム、ホビーなどを紹介する。アシスタントとしていくつかの女性アイドルが交代で出演している。
ドナルド・マクドナルド
トムさん(トム・バイヤー)(1998年4月 - 2011年5月27日)
2部制になる際、サッカーのコーナーを設けることになりキャスティング作業の中で、レイモンドが親交のあったトムを紹介して出演が決まった。不定期に第2部に出演することもあった。
ヒカルくん(田中光)
デッカチャン - 2000年4月 - 2001年3月
ヒカルくんを肩にのせて登場してきた。コンビ名はヒカルくんとデッカちゃん。
ゴリけん
番長のライバル的存在。語尾に「~ばい」を付ける。
ガレッジセール:カワゲッソー→カワちゃん(川田広樹)・ゴリタコ→ゴリくん(ゴリ)(2000年7月 - 2008年3月31日)
カワゲッソーはイカ、ゴリタコはタコの被り物を着用。
モッツィー(望月由香)(2000年7月 - 2002年9月30日)
「おはスタワー」のエレベーターガール。牛柄の衣装が特徴。
あかねちゃん(大沢あかね)(2003年9月30日 - 2008年3月31日)
おはキッズ(2000年4月3日 - 2007年9月28日) 「おはキッズ」を参照
角田師範(角田信朗)
「押覇への道」のレギュラー。設定上、第2部の番長の師匠ということになっていた。
ふうちゃん(唯月ふうか) - 2017年4月5日 - 2017年9月27日
火曜日から移動。
お笑い戦隊 ボケルメン - 2017年5月10日 - 2017年9月27日 ボケルメン・レッド(どんぐりたけし) ボケルメン・ブルー(もりせいじゅ) ボケルメン・イエロー(光永)
木曜(過去の出演者)
よゐコーン(はまもろこし(濱口優)・ありもろこし(有野晋哉)(よゐこ)) - 2000年4月 - 2003年3月
トウモロコシ型のキャラクターで語尾に「コーン」を付ける。よゐコーンのキャラ誕生前およびキャラリニューアル中の時だけ本来の「よゐこ」として出演。
鉄拳王(鉄拳) - 2003年4月 - 9月
2003年10月より水曜日に移動。
未来少年・ヤマモト→やまっちゃま(山本圭壱→山本圭一(極楽とんぼ)) - 2003年10月 - 2006年7月13日
未来少年ヤマモトは「未来少年コナン」のパロディキャラで、銀色のオーバーオールとランドセルが特徴。豚まんが好物。やまちゃんを「でらちゃん」呼ばわりし、自分こそがやまちゃんだと言い張る。
未来少年ヤマモトは途中でおはスタを卒業し(後術の通り山本自身はやまっちゃまとして復帰するため、事実上は一時離脱)、その際は代役として未来猫ひろし(演:猫ひろし)が登場。
やまっちゃまは「謎のアタッシュケース」を所有している御坊ちゃまキャラであるという設定があり、様々な伏線を残していたが、不祥事によりその設定の全てが帳消しされ、伏線回収も打ち切りとなった。本番組はやまっちゃまが木曜レギュラー出演者であった事や事件には一切触れない対応をし、2006年9月から新キャラクター、せとくん(演:瀬戸康史、後述)を後任に起用した。
番組開始初期にVTRや天気予報の生読みのナレーションを担当。時折スタジオへ顔出し出演することもあった。おはガール特別会員(0番)を肩書きにしていた。
メグー(豊口めぐみ) - 1999年4月 - 2000年3月
専用のDJブースに陣取っている事が多く、視聴者へ生電話を繋ぐオペレーターやコーナーの募集告知・プレゼントの紹介・天気予報の読み上げなどアシスタント的な立場をとっていた。氏名テロップは表示されていなかった。
おはNAVIガールKANA(可名(現・太田衣美)) - 2000年4月3日 - 2002年3月
宇宙人キャラで髪色と衣装はピンク→オレンジ→水色。後に宇宙人キャラクターを辞めて、本来の「可名」として出演。2001年度は月曜 - 木曜までの出演。
みお(竹内実生)- 2002年4月 - 2003年3月
一時期、1部・2部通しで出演したことがある。その際は1部のエンディングで2部のスタジオに向かうため退出するという演出もあった。
RYOMA(声:?) - 2010年5月10日 - 2011年4月1日
名前の由来は、Robot(ロボット)、Yell(エール)、Ohasuta(おはスタ)、Miracle(ミラクル)、Action(アクション)の頭文字から来ている。愛称は『RYOちゃん』。性格は、おしゃべり好きでダンスや走ることも得意であるが、時々こけるのが玉に瑕。目は気分によって変化し、手はなんでもつかめる。頭脳は未知数であるため、何を言い出すわからない恐怖がある。そして充電やメンテナンスを怠ると故障するので、スタッフがこまめに点検している。
※=スタジオ内のモニターの中に登場したキャラクター。
だいちゃん(原作:「今日のだいちゃん」太陽星太郎、週刊ヤングサンデー連載) - 番組初年度に「スーパーライブ」に登場。CM前に中継という設定で呼び出すが、スタジオと会話する事は無かった。
せがれ(アニメーションと声優:秋元きつね)
ウナムー(声優:山寺宏一) - 1998年度から新設された第1部の初代MCで、CGのやまちゃん(声も本物の山寺だがボイスチェンジャーがかけられている)。名前の由来は「宏一」を分解したもの。第1部だけではなく、そのエンディングを兼ねた「スーパーライブ」のオープニングにも登場していた。幻の「ゴールデン笹」を求めて旅立つマークについて行くため、番組を卒業した。
マーク・パンダー(声優:冨永みーな) - ウナムーと第1部を担当。赤いパンダのキャラクター。幻の「ゴールデン笹」を求めて旅立つため、ウナムーと共に番組を卒業した。
ひきだしあけお、あき、あける(声優:岩田光央) - 1999年度の第1部MCで、タンス型のキャラクター。1段目の引き出しに長男の「あけお」、2段目に長女の「あき」、3段目に次男の「あける」が住んでおり、主にあけおが1段目の引き出しから顔を出して話す。この期間の第1部エンディングではやまちゃんと衛星回線を通じてやり取りするシーンがあった。
かんの(声優:中村大樹) - やかん型のキャラクター。あけおの友達。一般公募により登場した。
ナーゾ(声優:柴田秀勝) - ゾナーの上司。「?」マークが描かれた頭だけの存在で語尾に「~ナゾ」を付ける。
ボダコ(声優:岩田光央)
ハム太郎(声優:間宮くるみ) - とっとこハム太郎関連のコーナーに出演した。
それでもが壊れる・充電が間に合わない時があり、その時はやまちゃんが冒頭で今日は壊れている・充電中と伝える。一時期、後述する謎の男によって、黒いチップが埋め込まれ、黒を基調とした容姿に変化し、性格は基本的に普通だが、途中で奇声を上げる、セットを壊す、スタッフを張り倒すなどの行動が繰り返され、挙句の果てには東京スカイツリーを破壊しようとした。
ハッピー - 2011年4月4日 - 2012年3月27日
種類はキバタン、性別はメスで、年齢は1歳半、出身はシンガポール。初期は声をやまちゃんが担当するときがあった。2011年4月5日から4月15日までオウムの名前を募集し、その視聴者からの公募で『ハッピー』に決まった。
モニン - 2013年4月24日 - 2015年3月27日
当番組のマスコットキャラクター(着ぐるみ、初代)。当初の名前は『おはライオン』で2013年3月に行われた『ゆる-1ぐらんぷり』で決定した。また、末期(2015年1月 - 3月)では『おとモニン』という視聴者の公募で全国のご当地キャラクターが毎週月曜日に出演した。
女性MC - 2015年4月6日 - 2016年4月1日 ふうちゃん(唯月ふうか)(月・水曜日) こじるり(小島瑠璃子)(火・木曜日) はるか(春香クリスティーン)(火・金曜日)
ニワさん - 2015年4月6日 - 2016年4月1日
当番組のマスコットキャラクター(着ぐるみ、2代目)。
初代キャスター 河本準一(次長課長)
解説 井上聡(次長課長)
サブキャスター AKINA
野性爆弾(ロッシー、川島邦裕(現・くっきー!))
アリエル
マナミちゃん(愛実)
キクチくん(菊地時音)
ヤスダくん(安田敦)
ムシガール (2010年1月4日より出演) 小川紗季(さき) - 2010年3月31日まで出演 西野実見(まみ) 笠井海夏子(みかこ) 植田紗々(さしゃ) 森野あすか(あすか) 井之上史織(しおり) - 2010年3月31日まで出演 田中絵里花(えりか) - 2010年3月31日まで出演 辻美優(みゆう) アレキシス・ジョンソン(あれきしす) アビゲイル・ミヤシマ(あびげいる)