刺激惹起性多能性獲得細胞
次に、小保方らは、生きた細胞を長時間培養しながら顕微鏡で観察するライブイメージング法(英語版)で7日間にわたって解析を行った。その結果、得られる未分化の細胞は、分化したリンパ球が初期化されたものであり、試料に含まれていた未分化の細胞が酸処理を経て選択されたものではないことを示唆した。遺伝子解析(英語版)を実施してOct4陽性細胞を検証した結果、Oct4陽性細胞のT細胞受容体遺伝子に、リンパ球T細胞が分化した時に生じる特徴的な遺伝子再構成であるTCR再構成が検出された。このことから、Oct4陽性細胞は、T細胞に一度分化したリンパ球由来の細胞を酸性溶液処理で初期化して得られたものであり、Muse細胞のような既存の多能性幹細胞が酸性溶液処理によって選択されたものではないことを検証した。また、このOct4陽性細胞は、Oct4以外にも多能性細胞に特有のSox2、 SSEA1、Nanogといった遺伝子マーカーを発現していた。さらにOct4陽性細胞は3胚葉組織への分化能を持っていた。その後、小保方らは、脳・皮膚・骨格筋・脂肪組織・骨髄・肺・肝臓・心筋などの組織の細胞についても同様に処理し、いずれの組織の細胞からもSTAP細胞が産生されることを確認した。
小保方らは、まず未分化細胞で特異的に発現するOct4遺伝子の挙動を観察した。Oct4プロモーターの下流にGFP遺伝子配列を繋いだコンストラクトをマウスに導入し、Oct4の挙動(正しくはOct4プロモーターが活性化されたかどうか)がGFPの蛍光によって可視化出来るシステムを構築した(いわゆるレポーターアッセイである)。このOct4::GFPマウスのリンパ球を使用し、細胞外環境を変えることによる細胞の初期化の状況を解析した。細いガラス管に通すという物理刺激を与えたり、毒素(細胞毒素ストレプトリジンO)で細胞膜に穴をあけたり、飢餓状態にしたり、熱刺激を与えたりなどさまざまな方法を試した結果、酸性溶液による細胞刺激が最も有効であることを発見した。小保方らの試行では、生後1週のマウス脾臓のリンパ球をpH 5.7、37°Cの酸性溶液に25分浸して刺激を与え、B27と多能性細胞の維持・増殖に必要な増殖因子である白血病阻止因子(LIF)を含むDMEM/F12培地に移して培養する方法が、最も効率的にSTAP細胞を作製できた。
A.; Wakayama, T. (2014-07-02). “Retraction:Bidirectional developmental potential in reprogrammed cells with acquired pluripotency”. Nature 505: 676-680. https://doi.org/10.1038/nature12969.
Obokata, H.; Sasai, Y. ; Niwa, H. (2014-03-05). “Essential technical tips for STAP cell conversion culture from somatic cells”. Protocol Exchange. https://doi.org/10.1038/protex.2014.008.
検証チーム実験では、14回の独立の実験で得られた492のSTAP細胞様細胞塊のLIF/ACTH含有培地での培養を試み、3が増殖したが、継代培養に成功したものは0だった。
FI幹細胞を再現できるかについては、検証チームのみが8回試みたが、得られた細胞株は0だった。
研究の着想は「植物のほか、動物の中でもイモリは傷つくなど外からの刺激をきっかけに、万能細胞化して再生する。ヒトを含めた哺乳類でも同様のことが考えられないか」という素朴な疑問にあるとされた。小保方が大学院時代に留学したハーバード大学医学大学院のブリガムアンドウィメンズ病院麻酔科教授のチャールズ・バカンティらは、成体内に小型の細胞が極少数存在し、これが休眠状態の多機能細胞ではないかとの仮説を唱えていた(胞子様細胞)。小保方はこの研究室で組織細胞をガラスの細管に通して小型細胞を選別する実験を行った。この実験で小型の幹細胞は取り出せるが、元の組織には幹細胞が観察されないこと、繰り返し細管に通すと少しずつ小型の幹細胞が出現することなどを知った。小保方は「小さい細胞を取り出す操作をすると幹細胞が現れるのに、操作しないと見られない。幹細胞を『取り出している』のではなく、操作によって、『できている』という考えに至った」と話している。
理化学研究所が設置した外部有識者による「研究不正再発防止のための改革委員会」は、2014年6月12日、理研CDBの構造的問題を指摘し、早急に解体すべきとしつつ、再現実験と研究不正の追及の双方を提言した。
日本分子生物学会は、2014年7月4日、声明の中で、再現実験を優先して「論文不正に対して適切な対応をしないこと」は「国民に対する背信行為」であると非難し、「今回の研究不正問題が科学者コミュニティーを超えて広く国民の関心を惹くことに至ったのは、論文発表当初に不適切な記者発表や過剰な報道誘致が為されたことに原因があり、それらは生命科学研究の商業化や産業化とも関係していると考えられる。」と言明した。
日本学術会議は、2014年7月25日、声明の中で「研究全体が虚構であったのではないかという疑念を禁じ得ない段階に達している。