足利氏
その後、足利将軍家では将軍の若死になども相次ぎ、第13代将軍・足利義輝の時代にわずかに将軍権力が復興される兆しもあったものの、永禄8年(1565年)5月に三好三人衆らによって殺害されてしまい、将軍は有名無実化した(永禄の変)。なお、義輝殺害後の3年間、室町幕府では将軍空位の時代が続き、一時的に幕府は消滅している(政所などの官僚機構は存在していた)。
義輝の実弟・足利義昭は、永禄11年(1568年)に織田信長とともに上洛し、第15代将軍となった。この時、14代将軍であった義栄は阿波に逃れた。彼の系統は平島公方家と呼ばれる。やがて将軍の義昭は信長と対立して元亀4年(1573年)に京都を追放(槇島城の戦い)され備後に移り、室町幕府は終焉を迎えた。なお公卿補任は、天正16年(1588年)に豊臣政権が確立し足利義昭が京都で出家するまでは将軍職にあったと記録している。
義昭の子、義尋の男子は全て出家し、足利将軍家の直系は絶家した。なお、義昭の子あるいは孫と伝承される人物に一色義喬や永山義在がいるが、その出自を証明する明確な証拠は現在のところない。
足利義満は明徳の乱、応永の乱などで有力守護大名を挑発しては討伐してその勢力を削減し、中国の明王朝から「日本国王」として冊封を受けて天皇に迫る権威を確立するなどして、幕府の安定化と全盛期を築き上げた。義満は公家としての称号を室町殿(むろまちどの)と定め、以降の将軍家代々(足利氏嫡流)は家名として室町を称した。
しかし義満が死去すると次第に将軍権力の弱体化、守護大名の台頭が顕著になっていく。第6代将軍・足利義教は父・義満の政治路線を受け継いで将軍権力の強化を行ったが、そのあまりに強硬的なやり方は周囲の反発を招き、嘉吉の乱で殺害されるに至って、遂に将軍権力の衰退と権威の失墜が露呈する結果となった。
第8代将軍・足利義政の時代には後継問題などをめぐって応仁の乱が発生し、室町幕府は京都だけを支配する一地方政権に転落した。
第10代将軍・足利義稙は管領の細川政元によって将軍職を追われ(明応の政変)、以後の将軍は実権を奪われて名目的存在となり、有力大名の支持なくしては将軍の地位さえ保てなくなった。
尊氏は当初後醍醐天皇の建武の新政に参加したが、中先代の乱を機に、建武の新政から離反した後、光明天皇から征夷大将軍に任じられ、京都に室町幕府を開いた。
尊氏は庶流である諸氏を諸国の守護などの要職に任じている。庶流の中でも、吉良氏・斯波氏・渋川氏などは、歴代足利宗家当主の庶兄を祖とし、宗家から独立した鎌倉幕府の御家人(別流の足利氏)として認められて、任官もしており、足利氏宗家は彼らに対して未だ嫡流としての地位を十分に確立できていなかった。
南北朝の動乱下にあって、急激に力を持つに至った足利氏一族は必ずしも、宗家当主(尊氏・義詮)の意向に忠実とはいえず、宗家に対する反乱や南朝につく離反などが相次いだ。尊氏は、正室所生で早逝した足利高義の庶弟で、本来、足利宗家の家督を継承する立場になかった、という上述の事情も存在した。足利一族の一人である今川貞世が『難太平記』の中で祖父(今川基氏、今川氏2代目当主)以前の歴史を十分に知らないことを告白するとともに、幕府成立後も一族内に尊氏の系統を宗家・嫡流であることを認めない者がいたことや今川氏が他の庶流と違って宗家に忠実であったことを主張している。 このような状況において、室町幕府は常に存亡の危機に立たされたが、そのたびに乗り越え、尊氏の孫であり第3代将軍・足利義満の時代になって南北朝合一を達成することとなる。