長州征討
戦況不利の最中の7月20日に将軍・家茂が死去(後述)、徳川将軍家を継いだ徳川慶喜は大討込と称して、自ら出陣して巻き返すことを宣言したが、小倉陥落の報に衝撃を受けてこれを中止し、家茂の死を公にした上で朝廷に働きかけ、休戦の勅命を発してもらう。また慶喜の意を受けた勝海舟と長州の広沢真臣・井上馨が9月2日に宮島で会談した結果、停戦合意が成立し、大島口、芸州口、石州口では戦闘が終息した。なお、慶喜は停戦の直後から、フランスの支援を受けて旧式化が明らかとなった幕府陸軍の軍制改革に着手している。
しかし、朝廷の停戦の勅命と幕府・長州間の停戦合意成立にも関わらず、小倉方面では長州藩は小倉藩領への侵攻を緩めず、戦闘は終息しなかった。この長州藩の違約に対し、幕府には停戦の履行を迫る力はなく、小倉藩は独自に長州藩への抵抗・反撃を強力に展開した。10月に入り、長州藩は停戦の成立した他戦線の兵力を小倉方面に集中して攻勢を強め、企救郡南部の小倉藩の防衛拠点の多くが陥落するに及んで小倉・長州両藩間の停戦交渉が始められ、慶応3年(1867年)1月にようやく両藩の和約が成立している。この和約の条件により、小倉藩領のうち企救郡は長州藩の預りとされ、明治2年(1869年)7月に企救郡が日田県の管轄に移されるまでこの状態が続くこととなった。
第二次征討の失敗によって、幕府側の武力が張子の虎であることが知れ渡ると同時に、長州藩と薩摩藩への干渉能力がほぼ無くなる結果を招いた。そのため、この敗戦が江戸幕府の滅亡をほぼ決定付けたとする資料も見られる。
26日「明星の尚閃く頃」に大坂に着いた慶喜は、大坂城の評議はすでに解散していたため正外の宿舎を訪れ兵庫の応接を尋ねた。正外は幕府の責任で決定したと返答し朝廷の許しが得られなければ将軍は辞職をすると伝え、慶喜は勅許を得ずに開市開港すれば朝廷の信頼を失い諸藩も収まらないとし、「されば唯今より直に諸有司を城中に招集して再議せらるべし」としてそのまま大坂城に入った。26日、慶喜は公使には回答の延期を申し出てその間に天皇から勅許を貰うべきとし、正外・崇広は幕府の独断で行うと主張。結論は出なかった。
立花種恭が延期の使者となり、イギリス公使ハリー・パークスに10日間の猶予を申し出た。種恭から見たパークスは怒り、暴言を吐き挙動傲慢であったが、にわかに語気を改めて10日間の猶予を認めた。この際に同行した大坂町奉行の井上義斐が誠意をもってイギリスと交渉し猶予を獲得したとされる。慶喜からみた両老中は10日間の猶予を貰ったと知らされると「別室に慶喜を招き」「涙を流して後悔の念をあらわして」どんな罪でも伏罪すると表明し当面は謹慎するとした。大坂の慶喜は回答を猶予した件を京都の容保に知らせると勅許獲得の工作を依頼。また、将軍家茂に謁見して速やかに上洛して条約勅許を申請すべきとして、自分は先乗りで帰京する旨を伝え26日の夕方に「鞭を挙げて京都に馳帰らる」。
27日に帰京した慶喜は朝廷に対して両老中は謹慎し、家茂は上洛して条約勅許を願い出ると報告をした。
12月8日、奇兵隊総督の赤禰武人は萩から長府へ帰り、萩政庁と諸隊の調和により事態を転回させる調和論<正邪混和説>を説いたが諸隊の多くは賛同せず、同日、奇兵隊の実権を握っていた軍監の山縣有朋は萩政庁へ反対の意見書を提出した。11月25日、九州から下関へ帰った晋作は長府で即時挙兵を説いたが、山縣を含めた諸隊は同調しなかった。12月13日夜、晋作は諸隊の長官を説得したが、忠誠公勤皇事蹟には「悲憤慷慨の言を吐き、或は怒り、或いは泣て、長官等を感動せしめんと力めましたけれども、長官等は高杉の気焔に圧倒せられたるのみにて、誰れ一人として」 決起する様子は見えなかったとある。
15日深夜、大雪の中、長府に集まった晋作と力士隊(総督は伊藤博文(俊輔))、遊撃隊(総督は河瀬真孝(石川小五郎))は功山寺に赴いて五卿に面会、その後下関に入った。功山寺挙兵および元治の内乱の始まりである。
翌16日、藩内クーデターの勃発に萩政庁は諸隊を敵として協力を禁じる布告を出した。12月18日、諸隊は伊佐へ出陣、萩藩庁は同日に毛利登人、大和国之助、前田孫右衛門、渡辺内蔵太を含む7名を野山獄へ投獄し、翌19日に斬首(清水親知は、6日後の25日に切腹した)。両者の対立はようやく先鋭化した。晋作は三田尻で奪った軍艦を萩へ向かわせたが下関にいた。山縣有朋は諸隊より遅れて出発、剃髪した。融和論に静観の形で同調の姿勢を見せていた諸隊に裏切られた赤禰武人は下関を出奔した。
28日、下関の遊撃隊討伐を目的として萩を上発した討伐軍の先鋒は秋吉台の北東の盆地の絵堂に入った。台地南西の伊佐にいた諸隊は、年が明けた元治2年(1865年、慶応に改元)1月6日深夜に山道を越えて絵堂に入り討伐軍を襲撃、朝までに同地を占領した。