アルティメット・スパイダーマン
声 - 山本兼平 / 英:トム・ケニー
スパイダーマンの宿敵。第4話「寄生生物 ヴェノム」で、ノーマン・オズボーンの命令でスパイダーマンの血のサンプルからシンビオートを作り出した。
第13話(第12話)「スパイダーマンの休日」で対決するが、水中ラボで敗北。オズボーンによって水中に沈められたが、ピーターに助けられた。
その後はアイアンマンのアーマーを操ったり、リザードから逃げる為にピーターを手を組んだりと様々な悪党としての活躍をした。そして、シニスター・シックスを結成するも敗北し、S.H.I.E.L.D.に捕らえられた。
第3シーズン(シーズン3)ではフューリーの脳にナノロボットを埋め込んで操り、S.H.I.E.L.D.から脱走しようとした。
第4シリーズではヒドラと手を組んでおり第79話「ヒドラの攻撃パート1」でわざとスパイダーマンたちに捕まり、自身を強化改造し、ナノボットを使ってトライキャリオンをヒドラアイランドに作り替えた。
第4シーズン(シーズン4)最終話である第104話「卒業の日」では、シールドアカデミーの卒業式の来場者たちを特殊なバリアで覆って監禁した。
声 - / 英:フレッド・タタショア
ハルクにとりついてその強さを盗もうとした地球外生命体。
第79話「ヒドラの攻撃パート1」では、ドック・オックの助力により解放され、暴走したスウォームを用いてトライキャリアをヒドラ・アイランドに作り替えた。 シンセゾイド アーニム・ゾラが操る、どろどろの液体から生成された人造生命体。3Dプリンターを使えば本人そっくりに生成できる上再生力も高いが、最大で2~3か月しか生きられない。 ケイン 声 - 田尻浩章 / 英 - ドレイク・ベル ヒドラのプロジェクト・ケインにより、大量生産されたクモのDNAを持つシンセゾイドたち。そのうち一体は人語を話すことができるが、行動原理は「食べたい」という欲求のみ。手で触れたものの生命エネルギーを吸う。 スパイダー・スレイヤーズ スパイダーマンを殺すためアーニムゾラとドクター・オクトパスが共同で産み出した3人組のシンセゾイドたち。特定人物の命令に従う。ケインに取り込まれて消滅する。 ゴースト・スパイダー 声 - 倉富亮 / 英 - ロジャー・クレイグ・スミス 透明になれる能力、物や人をすり抜ける能力、ワープ能力を持つ。
声 - / 英:カム・クラーク
他の3人とは違い魔法の力が両腕に宿っている。
第65話(第64話)「異次元のスパイダーマン パート4」では、記憶を失った父に寄り添った。
第4シーズン(シーズン4)から、アイアン・パトリオットのアーマーを元に開発されたアーマーを着て「パトリオティア」としてヒーロー活動を開始。第86話「アンチ・ヴェノム」では、パトリオティアとしてエージェント・ヴェノムとともにスパイダーマンの任務に参加したが、ドクター・オクトパスにより変異したヴェノムを寄生され、アンチ・ヴェノムとなり、触れるだけでエージェント・ヴェノムにダメージを与え、超人的な力を発揮して二人を苦戦させた。その後、過剰な陽イオンとの接触でアンチ・ヴェノムは活動を停止し、ハリーは昏睡状態となった。
第93話、第94話、第95話(第91話、第92話、第93話)「カーネイジの脅威」ではカーネイジの大発生を止めるべく、復活したアンチ・ヴェノムが自らカーネイジの巣に向かい、放出されたハリーはスパイダーマンに助けられた。以降は再びパトリオティアとして活動し、第4シーズン(シーズン4)最終話である第104話「卒業の日」ではシールド・アカデミーに入学している。
声 - 平井祥恵 / 英:オリヴィア・ホルト
女性と男性が入れ替わった異次元の世界でスパイダーマンとして戦う「女スパイダーマン」。彼女の世界にはグリーンゴブリンやニック・フューリー、ジェイ・ジョナ・ジェイムソンといったキャラクターの女性版も存在する。
声 - 岩端卓也 / 英:エリック・バウザ
第5話「アイアン・スパイダー誕生」にて初登場。ピーターの同級生にして、本作の世界における「7番目の天才」。アイアン・スパイダースーツを完璧に使いこなす天才的な頭脳を買われ、チームに加入する。「アイアン・スパイダーマン」アーマーを使って戦う。
アーマーは時々改良しており、第4シーズン(シーズン4)からはデジタル・スパイダーセンスも付けている。
声 - / 英:キース・ザラバッカ
元スターク・インダストリーズ社員で、自らをレーザー状のエネルギー体にして悪事を働いた。
声 - / 英:ロビン・アトキン・ダウンズ
声 - / 英:ケビン・マイケル・リチャードソン
二足歩行のアヒルで、シリーズを通じてゲスト出演を果たした。第4シーズン(シーズン4)にも別世界のハワードである海賊「パイレーツダック」が登場する。