膜タンパク質
可溶性のタンパク質については比較的容易に立体構造を決めることができるが膜タンパク質に関しては非常に困難である。X線結晶構造解析法における最大の問題点は膜タンパク質の結晶化にある。膜タンパク質を結晶にするためには適切な界面活性剤を用いて膜から可溶化する必要があるがこの条件設定および界面活性剤存在下での結晶化は非常にデリケートで根気が必要である。膜タンパク質は通常の蒸気拡散法を用いた結晶化では良質な結晶が得られにくい。脂質キュービック相法(LCP法)やHiLiDe法やBicelle法などが膜タンパク質の結晶化に有効な方法として注目されている。特に脂質キュービック相法は蒸気拡散法の次に報告例が多い結晶化法である。脂質キュービック相法は1996年にLandauとRosenbuschによって提唱された。Kobilkaらのグルーブによってβ2アドレナリン受容体とG蛋白質の複合体が脂質キュービック相法により結晶化され構造解析された例は、脂質キュービック相法の大きな成果のひとつである。脂質キュービック相法はタンパク質の結晶化に通常用いられる蒸気拡散法と異なりキュービック相とよばれる三次元的に連続した脂質層中に膜タンパク質を再構成させて結晶化を行う手法である。界面活性剤に覆われた膜タンパク質領域が脂質に置き換わるため密に集まりやすく高分解能の結晶が得られる傾向がある。また理化学研究所の横山茂之らは大腸菌由来のCECF法の無細胞タンパク質合成系を用いて膜タンパク質を合成する方法を2009年に開発した。その後、界面活性剤による可溶化を行わずに試料を高濃度に生成できる可溶性膜断片法(S-MF法)が開発された。なお結晶化だけではなく膜タンパク質は発現量が低いことも解析を難しくしている。
電子密度を計算したら分子構造モデルを構築する。分子置換法で位相計算を行った場合はすでに分子構造モデルがあるためその必要はないが、重原子同型置換法や異常分散法によって得られた情報は、結晶に含まれる分子に由来する原子の電子密度なので、はじめにその電子密度にあうような分子構造モデルを構築する必要がある。得られた構造モデルのRという値が十分低下するまで精密化する必要がある。
タンパク質の結晶を得るためにはタンパク質を大量に調製し、もっとも良質の結晶が得られる条件をスクリーニングする必要がある。タンパク質の結晶化の実験には5~30mg/ml程度の濃度のタンパク質溶液を用いる。タンパク質の結晶化の方法は大きく分けてバッチ法、液-液拡散法、蒸気拡散法の3つに分類される。どの方法もタンパク質の溶解度を低下させるような物質の溶液とタンパク質溶液を混合することによってタンパク質の溶解度の低下をさせ結晶の析出を促す。タンパク質の溶解度を低下させるような物質を沈殿剤といい、硫酸アンモニウムやポリエチレングリコール(PEG)などが用いられる。バッチ法最も単純な結晶化方法でタンパク質溶液と沈殿剤溶液を混合し、静置して結晶ができるのを待つだけの方法である。液-液拡散法はタンパク質と沈殿溶液を接触させ、液-液拡散によって徐々にタンパク質溶液中の沈殿剤濃度をあげていき、タンパク質の飽和、結晶の析出を促す方法である。
周辺膜蛋白質)
疎水性相互作用、静電相互作用など共有結合以外の力によって脂質二重層または内在性膜タンパク質と一時的に結合しているタンパク質である。これを引き離すには高塩濃度の極性溶媒を必要とする。
内在性のものも表在性のものも、翻訳後修飾で脂肪酸、フェニル基鎖、グリコシルホスファチジルイノシトールなどが付加され、これらがアンカーとなって脂質二重層に繋ぎとめられる。
内在性、表在性という分類はコリシンAやαヘモリシンなどのポリペプチド毒やアポトーシスに関わるある種のタンパク質には当てはまらない。これらのタンパク質は水溶性だが脂質二重層と不可逆的に結合し、αヘリックスまたはβバレル構造を持った膜貫通チャネルを形成する。別の分類法では、全ての膜タンパク質を内在性と両親媒性に分ける。両親媒性のタンパク質は水に溶け、脂質と結合するという2つの性質を持つが、内在性タンパク質は膜と結合した状態のみを取る。両親媒性タンパク質には、水溶性でチャネルを作るポリペプチド毒なども含まれる。