ELISA (分析法)
以下に、タンパク質を定量する際に用いられる方法のうち代表的な物を記載する。いずれの方法においても、検量線を作成し、そこから定量する方法が一般的である。
1966年に中根一穂とPierceによって酵素を利用して抗体の結合部位を酵素反応によって発色することにより抗原物質の所在を検出する手法が開発された。1960年代、オランダで免疫化学を応用した妊娠検査薬を販売していた製薬会社であるオルガノンはリトマス試験紙のように手軽に検査できる手法の開発に取り組んでおり、アントン・スールス(Anton Schuurs)は、発色する酵素と抗原抗体反応を組合せるアイディアを提案してバウケ・ファン・ウェーメン(Bauke van Weemen)と研究に着手してその結果を1971年に発表した。続いて1974年に酵素を利用する手法を発表した。また同時期1969年、ストックホルム大学のピーター・パールマン(Peter Perlmann)の研究室に加わったエヴァ・エングヴァール(Eva Engvall)は、RIAに代わる定量的検出系の構築に着手した。また、同時期フランスのストラティス・アヴラメアス(Stratis Avrameas)も同様の研究を進めていた。
目的タンパク質(抗原)に対する抗体(捕獲抗体)を固相に吸着させる。
スキムミルクなどで固相のブロッキングを行う。
固相に試料溶液および捕獲抗体とは別のエピトープを認識する一次抗体を加える。この時点で、固相 - 捕獲抗体 - 抗原 - 一次抗体という複合体が固相表面に形成される。
反応しなかった抗原および一次抗体を洗い流す。
一次抗体に酵素が標識されていない場合は、酵素標識済みの二次抗体を作用させる。その後、余分な二次抗体を洗い流す。
酵素の基質(通常、発色あるいは発光試薬)を加え、酵素反応の生成物を検出する。
本方法を行うには、同一タンパク質を異なるエピトープで認識する抗体が必要となる。また、抗体の立体障害を考えると、近位ではなく遠位(アミノ酸配列上でなく立体構造上の遠位)を認識することが望ましい。最大の利点は、同一タンパク質を捕獲抗体と一次抗体の2種類の抗体を用いて検出する性質上、特異性が非常に高い方法である。ただし、固相に吸着させる捕獲抗体の量が少ない場合、試料中の抗原は捕獲抗体以上の量が結合できないため、定量性が悪くなることがある。