鞆幕府
さらに、天正3年以降、信長は毛利氏への包囲網を構築するため、近衛前久を九州に下向させ、大友氏・伊東氏・相良氏・島津氏の和議を図ろうとしていた。
5月7日、輝元ら毛利氏は反信長として立ち上がり、13日に領国の諸将に義昭の命令を受けることを通達し、西国・東国の大名らにも支援を求めた。3ヶ月の間、毛利氏が検討して出した結論であった。これにより、毛利氏と織田氏との同盟は破綻した。
輝元ら毛利氏に庇護されていたこの時期の室町幕府は、「鞆幕府」とも呼称される。義昭はまた、輝元を将軍に次ぐ地位たる副将軍に任じた。
6月11日、義昭は武田勝頼と上杉謙信に対して、互いに講和を命じる御内書を下し、毛利輝元と協力して協力したうえで信長を討つように命じた。
天正15年(1587年)3月、豊臣秀吉が九州に向かう途中、義昭の住む鞆の御所に近い赤坂に立ち寄り、ここで義昭と対面した。義昭は秀吉と贈り物を交換し、親しく酒を酌み交わした。
この頃、義昭は毛利氏に願い、御座所を鞆から山陽道に近い沼隈郡津之郷(福山市津之郷町)へと移させた。時期は不明ながら、鞆に近い山田常国寺を御座所としていた時期もあった。
10月、義昭は毛利氏の兵に護衛されながら、京都に帰還した。義昭にとっては、およそ15年ぶりの京都であった。
天正16年(1588年)1月13日、義昭は秀吉とともに参内し、将軍職を朝廷に返上した。このとき、秀吉の奏請によって、義昭は朝廷から准三宮の称号(待遇)を受けている。これにより、室町幕府は名実ともに滅亡した。