パワーパフガールズ
声 - 不明 / サラ・チャルケ
後述する「ダンスパンツにご用心!」で登場。オペラ歌手で、モジョに誘拐される。
声 - 伊井篤史 / 不明
博士とガールズが一時的に引っ越した大都会「シティズヴィル」の市長。ほとんど遊び暮らしているタウンズヴィルの市長とは違い、毎日真面目かつ忙しそうに働いている。犯人を捕まえるためとはいえ、街のシンボルである「シティズヴィル橋」を破壊したガールズを問い詰め、法律によりシティズヴィル内でスーパーパワーを使う事を禁じた。
声 - 喜田あゆ美 / クリスティーン・カヴァナー
ガールズが街を救う手伝いをしてくれる妹を作り出そうと、自分たちで「お砂糖」と「スパイス」と「素敵なものいっぱい」、そしてケミカルXを使って誕生させた。服と目の色は紫で髪は茶色。しかし材料に不純物が多かったため、可愛くない(というより醜悪な)巨体となってしまった上、頭も悪く善悪の区別がつかず、街を救うどころかかえって滅茶苦茶にしてしまい、ガールズにお払い箱にされ酷く悲しんだ。その後、自身の騒動のどさくさに紛れて脱獄した囚人達に囲まれ苦戦したガールズを何とか助け出すものの、最後には爆発して消えてしまい、元の材料に戻ってしまった。
大胆にデフォルメされたキャラクターを始め、ポップでレトロ・モダンなデザインが目を引き、世界中で高い人気を誇る。日本でも知名度が高く、ラブライブ!では2回に渡ってコラボが行われている他、プロ野球の東北楽天ゴールデンイーグルスとも2019年にコラボ企画が実施されている。
一方でストーリーは単なる勧善懲悪でなく、一見可愛らしい絵柄とは裏腹にグロテスクな描写もある。また、既存のスーパーヒーローや名作映画等のパロディも存在し、話によっては正義の味方であるはずのガールズが図らずも破壊活動や犯罪を犯してしまう展開や「本来は悪人ではない者が逮捕されてしまうオチ」「逆に悪党が事件を解決してしまうオチ」など、不条理やブラックユーモアをも含む内容が作品独自の持ち味となっている。
パラレル世界のバターカップ。
声 - 岩坪理江(第49話まで)→西村ちなみ(ザ・ファイト・ビフォア・クリスマス・第50話以降) / ジェニファー・ヘイル→マリア・バンフォード
シーズン2から登場したレギュラーヴィラン。ガールズの幼稚園の同級生で家は大金持ち。フルネームは「プリンセス・モアバックス」。一人称は「アタシ」。
甘やかされて育った為、かなりのワガママで「アタシの望みは何でも叶う事になっている」と豪語する。ただ、自分に責任がかかりそうになると急に卑屈になる面もある。父親や先生の前ではぶりっ子のように振る舞うが、同級生やガールズ、モジョに対しては横柄に振る舞い、使用人にも「さっさと出てけ!」と罵るなど性格は傍若無人そのもので、使用人達からも裏では「悪い子」と言われている。
ガールズの一員になりたがっているが、それを拒まれたためガールズを逆恨みしており、金にまかせて強力な武器兵器を身につけたり、市長をお菓子で買収してタウンズヴィルを買い取り、自ら市長となり作った「悪い事はいい事」の法律で町を混乱させ、ガールズの戦意を削ごうとしたり、モジョを買収してガールズを倒そうとしたり、同級生のロビンを言葉巧みに友達のふりをして利用し、万引きさせた事もあった。
第二次世界大戦中、タウンズヴィルを恐怖に陥れた悪者3人組。現在ではかなりの老人で、老人ホームで悠々自適に暮らしていたが、ガールズの活躍に感化され活動を再開する。ガールズも敵が年寄りという理由でまともに戦うことができず、かつての宿敵たちを説得して再対決させるも結局共倒れになってしまった。 マスターマインド(Master Mind) 声 - キートン山田 / 不明 ミリストリー・オブ・ペインのリーダー。老人ホームで暮らしていたが、ガールズの活躍を伝えるTVを見ているうちに子供がヒーローとして活躍している現在のタウンズヴィルに憤り、他の2人を誘って活動を再開する。 カウンターパート(Counterpart) 声 - 不明 / 不明 ミリストリー・オブ・ペインのひとり。巨漢の老人。 コーホー(Cohort) 声 - 不明 / 不明 ミリストリー・オブ・ペインのひとり。小柄の老人。
声 - 山崎たくみ(UG版)→小堺一機 / トム・ケニー
「ここはおなじみタウンズヴィル!」(原語:The City of Townsville!)、「今日もみーんな救われた、サンキュー、パワーパフガールズ!」(原語:So once again, the day is saved, thanks to... the Powerpuff Girls!)が決まり文句。劇中の随所に小ネタを入れる。ナレーターでありながらも時々本編の中に干渉し登場人物から叩かれたり、モジョに監禁されてナレーターの座を奪われたこともある。
本作の中で最も強敵であるレギュラーヴィラン。外見から見ると恐らくガールズと同じ幼稚園児。
モジョがガールズに対抗するために刑務所の独房の中で作った男の子たち。囚人の脇毛・食堂で注文したカタツムリ・犬の尻尾に、ケミカルXの代わりにトイレの汚水を流し混ぜて誕生した。敵の中では唯一ガールズと同じスーパーパワーを持っており戦闘能力は全体的にガールズをしのぐ。3人とも外見は基本的にガールズを男子に仕立て上げた感じそのもので、初見のプリンセスや人々からはガールズと間違われるほど酷似している。
一時はガールズのキス攻撃(ミス・ベラムいわく「男の子の弱点」)で元の材料に戻ってしまったが、後にカレの魔力によってパワーアップして復活しており(初登場時と若干髪型が異なり、より一層ガールズを連想させる髪型となった)、復活する際にカレがボーイズの弱点を防御するため、カレの注射でキス攻撃に耐性が付いただけでなく、キスすると巨大化するようになったが、恥ずかしい事をされると逆に縮んでしまうという新たな弱点が判明した。
一度、ガールズと共にティーンエイジャーになった事もある(この時はいつものワルな感じではなく、友好的な性格になっている)。
声 - 水木竜司 / トム・ケニー
ハリウッドの映画監督を騙る詐欺師。パワーパフガールズの映画を制作すると言ってガールズを騙し、銀行強盗を働こうとしたが、その企みをいち早く察知し、女装して撮影現場に潜入していた博士に正体を暴かれる。市長を人質に取って逃げようとするが、途中で消火栓に車をぶつけてしまい足止めを食らった上、追いかけてきた博士に捕まり逮捕された。かなりの小心者。
2013年12月16日、新作『ダンスパンツにご用心!』(原題:Dance Pantsed)が2014年1月20日に放送される事が発表された(マクラッケンは2010年にCNを退職している為、製作に関与していない)。日本CNでは2014年3月3日に放送された。
2012年11月16日に、元ビートルズで本作のファンである事を公言しているリンゴ・スターが「ミスター・フィボナッチ」の役で声優を務める事を発表し、オリジナル曲の製作も行った。この曲のミュージックビデオは日本の3DCG制作会社ポリゴン・ピクチュアズが制作している。
キャラクターデザインはブロッサム、バブルス、バターカップの主役3人とモジョは大きく変わっているが、他のメインキャラクター(ユートニウム、市長、ミス・ベラム)はほとんど変わっていない。
声 - 斎藤志郎 / ジョン・ディマジオ
宝を求めタウンズヴィルにやってきたところを、事故により現代にタイムスリップしてしまった海賊団の首領。宝の代わりに見つけたケミカルXを過剰摂取した事で海賊も海賊船もスーパーパワーを得るに至り、ガールズと激しい戦闘を繰り広げる。最終的にケミカルXの効き目が切れたことで弱体化した隙をつかれ、元いた時代に戻された。
夫の出所後、彼女を中心に一家4人全員が悪役の衣装に身を固め、隣の博士一家の不在を狙って家中をめちゃくちゃにする。それでも彼らが幸福そうであったことから更にレーザー砲を搭載した改造ミニバンで博士とガールズを襲うも失敗し、家族ともども刑務所に入れられた。 バット・スミス(Bud Smith) 声 - Myu / クリスティン・カウゲァナー 一家の長男。歯並び矯正器具をつけている。いわゆる反抗期の最中であり、父のハロルドの事はさえないダメ親父(面と向かって「うざってーんだよ」と言う)、母のメアリアンの事は「(ホットケーキは)もう飽きた!」「いい加減にしろよ!」と怒鳴ったりと態度は悪い。しかし一転して悪者になった両親に関しては面白がって好意的であり、一家全員で悪者になった時は極めて楽しげであった。 ジュリー・スミス(Julie Smith) 声 - 千葉紗子 / キャス・スーシー 一家の長女。まだ幼く、隣のパワーパフガールズとはおはじき等でよく遊ぶ。一家で悪者になることになった際はよく状況が分かっていないのか、パワーパフガールズとバトルすることになるのも遊びの延長と思っている節がある。