スペイン領フロリダ
これに反応したスペインは、1565年にその開拓地を破壊し、現在のセントオーガスティンにサン・アグスチン開拓地を建設した。ペドロ・メネンデス・デ・アビレスが建設したこの開拓地は、現在のアメリカ合衆国本土でヨーロッパ人による最初の恒久的開拓地となった。ここを活動の基地としたスペインは今日の合衆国南東部へローマ・カトリック教会伝道師による布教を始めた。
1565年にメネンデス・デ・アビレスがカロリーヌ砦を襲った時、カトリック教徒以外のフランス守備兵を皆殺しにし、砦をサン・マテオと改名した。2年後、ドミニク・ド・グールゲスが砦を再奪取し、スペイン守備兵を全員殺した。1586年イギリスの船長で時には海賊もやっていたフランシス・ドレークがサン・アグスチンを略奪し燃やしてしまった。
17世紀を通じて、バージニアやカロライナのイギリス人開拓者が徐々にスペイン領の境界まで南下するようになり、一方でミシシッピ川のフランス人開拓者はスペイン領の西の境界に迫って来ていた。1702年、イギリス人のジェイムズ・ムーア大佐が同盟クリーク族インディアンと共にサン・アグスチンを襲って壊滅させたが、砦の支配まではできなかった。1704年、ムーアとその部隊はフロリダ北部の伝道所を焼き払い、スペインに友好的なインディアンを処刑した。1719年、フランス軍はスペインの開拓地ペンサコーラを占領した。
後にセミノールと呼ばれるインディアン達がフロリダに移住してきたのもこの頃である。