ローマの松
フルート3(第3フルートはピッコロ持替え)
オーボエ2
コーラングレ1
変ロ調とイ調のクラリネット2
変ロ調とイ調のバスクラリネット1
ファゴット2
コントラファゴット1
ホルン4
トランペット3
トロンボーン4(ただし4番トロンボーンは音域が極端に低いためもっぱらチューバかチンバッソで代用される)
ティンパニ
トライアングル
シンバルと小シンバル2
タンブリン
ラチェット
大太鼓
タムタム
グロッケンシュピール
ハープ
チェレスタ
ピアノ
オルガン
弦五部
舞台裏のトランペット(第2部で使用)
ブッキーナ - 変ロ調のソプラノ・テナー・バスのフリコルノ(サクソルン)各2(第4部で使用) ブッキーナは古代ローマの兵士が用いた金管楽器の一種。トランペット、トロンボーンの祖先とされる。レスピーギがブッキーナに指定したフリコルノはイタリアにおける円錐管系金管楽器で、ソプラノ・テナー・バスはそれぞれ現在のフリューゲルホルン・バリトン・ユーフォニアムに相当する。
夜鳴きウグイス(ナイチンゲール)の鳴き声の録音(第3部で使用) 楽譜出版社であるリコルディ社からテープが発売されている。また、普通はこの出版社のパート譜の貸し譜に付いてくる。水笛などで代用する場合もある。