組換えDNA
分子クローニングは、組換えDNAの作製のために用いられる実験室的手法である。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)ともに、特定のDNA配列を複製するために最も広く用いられている実験手法の1つである。分子クローニングとPCRには、2つの基本的な差異が存在する。1つは、分子クローニングは生細胞内でDNAの複製を行うのに対し、PCRは試験管内で行うという点である。もう1つは、分子クローニングはDNA配列の切り貼りを伴うのに対し、PCRは既存配列をコピーのみで増幅を行うという点である。
組換えDNAの形成には、生細胞内で複製を行うDNA分子であるクローニングベクターを必要とする。ベクターは一般的にプラスミドやウイルスに由来し、複製に必要な遺伝的シグナルを含む比較小さなDNA断片が存在する。その他に、外来DNAの挿入や、細胞が組換えDNAを含んでいるかどうかの同定、外来DNAの発現を行う際に便利なエレメントなどが含まれている場合がある。分子クローニングの際のベクターの選択は、宿主生物の選択、クローニングするDNAのサイズ、外来DNAの発現を行うかどうか、どのように行うかに依存する。DNA断片の結合は、制限酵素とリガーゼによるクローニングやギブソン・アセンブリなど、さまざまな手法で行われる。
標準的なクローニングのプロトコルでは、DNA断片のクローニングは次の7つの段階で行われる。
宿主生物とクローニングベクターの選択
ベクターDNAの調製
クローニングするDNAの調製
組換えDNAの作製
組換えDNAの宿主生物への導入
組換えDNAを含む個体の選択
目的のDNA挿入と生物学的性質を有するクローンのスクリーニング
多くの場合、組換えDNAを含む生物は見かけ上正常な表現型を示す。すなわち、その外見、行動、代謝には通常変化がみられない。組換え配列の存在を示す唯一の方法はDNA自身の調査であり、一般的にはPCR検査が行われる。重要な例外も存在し、後述する。
組換えDNA配列から遺伝子の発現が行われている場合、組換え遺伝子のRNAまたはタンパク質産物から組換え配列の存在を検出することもできる。一般的にはRT-PCRやウェスタンブロッティングが行われる。宿主生物で生物学的活性が生じるような組換え遺伝子の選択と修正が行われていない場合には、表現型変化の観察は標準的手法ではない。組換え遺伝子産物によって宿主生物に毒性がもたらされることで付加的な表現型が生じることがあり、特に過剰発現が行われている場合や、不適当な細胞や組織で発現が行われている場合に生じやすい。
組換えDNAは発現していない場合でも宿主生物に有害な影響を与えることがある。1つの機構としては挿入(英語版)による不活性化があり、組換えDNAが宿主細胞の遺伝子へ挿入された場合に生じる。この現象は、遺伝子を「ノックアウト」してその生物学的機能や重要性を明らかにするためにも利用される。他の機構としては、染色体への組換えDNAの挿入によって、宿主細胞でこれまで発現していなかった遺伝子が不適切な形で活性化される場合がある。例えば、組換えDNA断片に活性の高いプロモーターが存在し、それによって隣接する抑制されていた遺伝子が活性化されてしまう場合や、遺伝子発現の抑制機能を持つ宿主細胞の遺伝子が組換えDNAによる挿入不活性化を受ける場合がある。
組換えDNAはバイオテクノロジー、医療、研究で広く利用されている。今日、DNA技術を利用した組換えタンパク質や他の製品は、ほぼすべての薬局、病院、動物病院、臨床検査室や生物学の研究室に置かれている。加えて、組換えDNA技術によって改変された生物やそうした生物に由来する製品は、多くの農場、スーパーマーケット、家庭の常備薬庫にも進出しており、ペットショップでもGloFish(英語版)などの遺伝子組換え生物が売られている。
組換えDNAが最も一般的に利用されているのは基礎研究においてであり、現在の生物学や生物医学研究の大部分で重要な役割を果たしている。組換えDNAは遺伝子の同定、マッピング、シーケンシングや、その遺伝子の機能を決定するために利用される。組換えDNAによるプローブは、個々の細胞や生物の組織全体での遺伝子発現の解析に利用される。組換えタンパク質は研究室での実験試薬として広く利用されており、細胞内や生体内でのタンパク質合成を調べる抗体プローブを作り出すためにも利用されている。
組換えDNAは、工業、食品生産、医学や獣医学、農業、生物工学といった分野で多くの実用化がなされている。一部の例を下に挙げる。