核酸医薬
カチオン性リポソームとカチオン性ポリマーの両キャリアを併用して調整した核酸分子との複合体がリポポリプレックスである。リポポリプレックスにPEG修飾や膜透過性ペプチドの導入をはじめ様々な機能を組み込んだものが北海道大学の原島秀吉らが開発したMEND(multifunctional envelope nano device)である。
ASOの薬物動態学はその他の高分子医薬品の薬物動態学と共通する点が多い。消化管から吸収されないため非経口投与が必要なこと、毛細血管の透過性に制限があるため不均一な分布を示すことなどが特徴として挙げられる。ASOの体内動態を規定する因子は血中における相互作用、糸球体濾過、細胞との相互作用などが知られている。血中における相互作用で特に重要なのが血漿蛋白質との相互作用である。ASOはその化学修飾、特に核酸間リン酸結合のホスホロチオエート化によりアルブミンをはじめとした生体内分子に結合して様々な臓器にデリバリーされる。ミポメルセンの体内動態はよく研究されているがミポメルセンは90%以上がアルブミンなど血漿蛋白質に結合する。その結果、皮下投与したミポメルセンは腎臓と肝臓に分布する。アルブミンなどの血漿蛋白質に結合したASOは糸球体濾過されない。天然型の核酸は血漿蛋白にあまり結合しないため速やかに糸球体濾過され体外に排出される。エテプリルセンなどモルフォリノ核酸は血漿蛋白質との結合性が低いため速やかに体内から消失する。細胞の取り込みには種々のレセプターが関与し細胞と相互作用する。プラスミドDNAは静脈投与すると主に肝臓に分布するがクッパー細胞や類洞内皮細胞に多くは分布し肝細胞への分布は僅かである。この結果はポリアニオンの認識に関与するスカベンジャーレセプターが取り込みに関与するためと考えられている。なおGalNAc修飾したASOはクッパー細胞や類洞内皮細胞よりも肝細胞に分布するように薬物動態が変化する。
2'-O-メトキシエチル化RNAはミポメルセンのwing portionやヌシネルセンの全配列で用いられる核酸アナログである。結合力が強い核酸アナログとして知られる。ヌクレアーゼ耐性は高いがRNase H活性はないため、RNase H依存性のmRNAの分解をする場合はgap portionを非修飾DNAとしたgapmer type ASOとしてデザインすることが多い。IONIS社が開発した製品で利用される。
核酸医薬のようなオリゴヌクレオチドは細胞にとって不要であるため細胞内への移行は大きく制限されると考えられている。一般的にオリゴヌクレオチドを含める高分子は主にエンドサイトーシスによって取り込まれる。よく知られた核酸医薬のエンドサイトーシスに関わる受容体を下記のようにまとめる。
細胞内移行後も細胞膜を通過していないため、オリゴヌクレオチドが細胞質や核に移行する可能性は非常に低い。一般的にエンドサイトーシスによって取り込まれた分子はエンドソームへ輸送され、その後、加水分解酵素を含むリソソームへ輸送され、分解される。膜透過性の乏しい活性分子の透過性改善を目的としてDDSの分野では様々な方法が提唱されている。その多くは核酸医薬に対しても適応されている。その一例としてはコレステロールなどの脂溶性化合物を利用した修飾があげられる。
神経疾患のみならず、核酸医薬全般の最大の問題点は標的臓器または標的細胞へのデリバリーである。具体的にはsiRNAはなんらかのドラッグデリバリーシステムを付加する必要がある。一方ASOは核酸間リン酸結合のホスホロチオエート化によってアルブミンをはじめとした血中の生体内分子と結合して様々な臓器にデリバリーされることが示されているがアルブミンの性質上、標的臓器または標的細胞特異的なデリバリーにはならない。核酸医薬のベクターとしてカチオニックリポソームやそれに様々な修飾を加えたものがある。これらのベクターの中には効率よくsiRNAをデリバリーさせるものも報告されているが、肝機能障害を代表とする副作用が指摘されている。またリポソームはその性質上肝臓に集結するため、中枢神経系を含めた肝臓以外へのデリバリーが困難となる問題が存在する。
核酸医薬だけでなく、広く中枢神経疾患に対する治療薬を検討する際に最大の問題点となるのが血液脳関門の存在である。血液脳関門を通過する分子は分子量500Da以下の疎水性低分子とされており、核酸医薬のような親水性高分子(ASOの場合は分子量5,000Da程度、siRNAの場合は分子量14,000Da程度)を血液脳関門を通過して脳内に薬物を届ける方法は未だ確立していない。各投与法の利点と欠点を表にまとめる。
ASOの分子設計はASOの分子構造、ASOの配列、ASOの機能化の観点から行われる。
分子構造
ASOを医薬品として用いるための最低限の要件は厳密な塩基配列認識能、ヌクレアーゼ耐性、細胞内移行性、代謝性である。Ts’oらは研究当初から細胞内移行性に着目し、リン酸ジエステル結合の負電荷をリン酸トリエステル型にすることで消し去り、細胞内移行性を高めようとした。それ以後、実に多くの修飾核酸がASO分子として開発された。それらは核酸塩基部位の修飾(新規人工核酸塩基)、リボースの修飾、リボース環自体の改変、リン原子関連修飾(メチルホスホネート型やホスホロチオエート型)、リンケージの修飾(非リン酸型)に分類される。 第一世代のASOは主にリン原子関連修飾によって設計されたものであり、とりわけPS-オリゴは最も優れたアンチセンス効果を示してきている。1990年代には第二世代ASOが開発された。Ionis社が開発した2’-O-アルキル型は第一世代よりも高い効果を示している。さらにBNA(英語版)やLNA など改変されたリボース環をもつ第2.5世代の核酸医薬も開発されている。その他、ASOの新規構造体設計時に求められるポイントしてはRNAとの結合安定性(Tm値など)、ミスマッチ配列認識能、ヌクレアーゼ耐性、RNaseH活性、科学的な安定性、脂溶性または水溶性、蛋白質との結合性があげられる。
配列
ASOが機能を発揮するためには対象RNAと二重鎖を形成することが必須である。しかし細胞内でどのように二重鎖を形成するのかは不明な点が多い、RNAの高次構造中に一本鎖領域が存在し、その部位にASOが結合する場合と、ASOがRNA鎖の二重鎖領域の一方の鎖と競合的に作用して結合する場合が考えられる。
静脈内投与のような全身投与でsiRNAを作用させるには多くの障壁がある。siRNAのみでは生体内で標的臓器および細胞にデリバリーされないため、何らかの形でDDSを付加する必要がある。リポソームやナノ粒子がよく知られたDDSであるがコレステロール-siRNAコンジュゲートも優れたデリバリー効果を示す。コレステロール-siRNAコンジュゲートは2004年にsiRNAのベンチャー企業であるアルナイラム社によって報告された。siRNAのセンス鎖の3’末端にピロリジンリンカーを介してコレステロールが結合したものである。血漿蛋白質であるアルブミンとの親和性を示し、siRNA単体と比較して血中半減期が長くなっている。また、ヌクレアーゼ耐性化を目的としてホスホロチオエート結合と2'-O-メチル化がなされている。アポリポタンパク質Bに対するコレステロール-siRNAコンジェゲートを50mg/kgで静脈内投与することで肝臓および空腸においてmRNA抑制効果が認められた。RACE (rapid amplification of cDNA ends)-PCR法によるRNAi特異的なmRNA切断断片を検出することでRNAiが誘導されたことを証明している。2007年にはコレステロール-siRNAコンジュゲートがLDLおよびHDLと相互作用し、その取込にはそれぞれLDL受容体およびスカベンジャー受容体クラスBタイプ1(SR-B1)が必要であることも示された。