DNA 定序（英語：DNA sequencing）又稱 DNA 測序，是指分析特定 DNA 片段的鹼基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）與鳥嘌呤（G）的排列方式。快速的 DNA 定序方法的出現極大地推動了生物學和醫學的研究和發現。

在基礎生物學研究中，和在眾多的應用領域，如診斷，生物技術，法醫生物學，生物系統學中，DNA 序列知識已成為不可缺少的知識。具有現代的 DNA 定序技術的快速定序速度已經有助於達到定序完整的 DNA 序列，或多種類型的基因組定序和生命物種，包括人類基因組和其他許多動物，植物和微生物物種的完整 DNA 序列。

RNA 定序則通常將 RNA 提取後，反轉錄為 DNA 後使用 DNA 定序的方法進行定序。目前應用最廣泛的是由弗雷德里克・桑格發明的桑格定序。新的定序方法，例如 454 生物科學的方法和焦磷酸定序法。



應用

DNA 定序可用於確定任何生物的單個基因的序列，較大的遺傳區域（即基因簇或操縱子的簇），完整的染色體或整個基因組。 DNA 定序也是對 RNA 或蛋白質進行定序的最有效方法（通過對開放閱讀框定序）。目前，DNA 定序已成為生物學和其他科學領域（如醫學，法醫學或人類學等）的關鍵技術。

分子生物學

在分子生物學中，DNA 定序可被用於研究基因組及其編碼的蛋白質。利用定序獲得的資訊，科研人員能夠辨識基因的變化，基因與疾病和表型的關聯，並確定潛在的藥物靶點。

演化生物學

由於 DNA 是攜帶有遺傳資訊的大分子，在演化生物學中，DNA 定序被用於研究不同生物體之間的相關性以及它們是如何演化的。

宏基因組學（或元基因組學）

宏基因組學是一門直接取得環境中所有遺傳物質的研究。環境包括但不限於水體，污水，污垢，從空氣中過濾出的碎片或者從生物體採集的樣本。了解在特定環境中存在哪些生物體對於生態學，流行病學，微生物學和其他領域的研究至關重要。DNA 定序使研究人員能夠確定微生物群中可能存在哪些類型的微生物。

醫學

醫療人員可通過對患者基因（基因組）的定序結果確定該患者是否有攜帶遺傳性疾病的風險。需要注意的是，該方法屬於基因檢測，有些基因檢測不會用到 DNA 定序技術。

法醫學

DNA 定序可以與 DNA 圖譜鑑定（基因指紋分析，英語：DNA profiling）一起用於法醫鑑定和親子鑑定。 DNA 測試在過去的幾十年中發展迅猛，目前已能夠做到將 DNA 鑑定結果與被調查物件聯絡起來。指紋，唾液，毛囊等中的 DNA 特徵可以將不同的生物體進行區分。測試 DNA 是一種可以檢測 DNA 鏈中特定基因組並生成唯一的個性化 DNA 模型的技術。每一種有機體都有其 DNA 特徵，並可以通過 DNA 測試來確定。兩個人具有完全相同的 DNA 特徵是非常罕見的，因此保證了 DNA 測試的成功。



歷史

DNA 結構與功能的發現

去氧核糖核酸（DNA）最早在 1869 年由 Friedrich Miescher 發現並分離出來，但由於當時普遍認為遺傳資訊儲存於蛋白質而不是 DNA 中，因此在過去幾十年中 DNA 一直沒有得到充分研究。1944 年，由於 Oswald Avery，Colin MacLeod 和 Maclyn McCarty 的一些實驗表明，純化的 DNA 可以將一種細菌變成另一種細菌，這種情況才發生了變化。這也是首次 DNA 顯示出改變細胞特性的能力。

1953 年，James Watson 和 Francis Crick 根據 Rosalind Franklin 研究的結晶 X 射線結構提出了他們的雙螺旋 DNA 模型。根據該模型，DNA 由彼此纏繞的兩條核苷酸鏈組成，通過氫鍵連接在一起並以相反方向執行。每條鏈由四個互補的核苷酸組成：腺嘌呤（A），胞嘧啶（C），鳥嘌呤（G）和胸腺嘧啶（T），其中 A 與 T 配對，C 與 G 配對。他們提出的這種結構，使得每條單鏈都可被用於重建另一條鏈，並且讓遺傳資訊代代相傳。

對蛋白質進行定序的基礎首先由弗雷德里克・桑格（Frederick Sanger）的工作奠定，他於 1955 年完成了胰島素（胰腺分泌的一種蛋白質）中所有胺基酸序列的定序工作。這是首個確鑿的證據證明蛋白質是具有特定分子模式的化學實體，而不是懸浮在流體中的隨機混合物。桑格在胰島素定序方面的成功使得 X 射線晶體學家大為振奮，包括華生和克里克，他們現在正試圖理解 DNA 如何指導細胞內蛋白質的形成。在 1954 年 10 月弗雷德里克・桑格出席一系列講座後不久，克里克開始發展一種理論，認為 DNA 中核苷酸的排列決定了蛋白質中胺基酸的序列，從而幫助確定蛋白質的功能。他於 1958 年發表了這一理論。

RNA 定序

RNA 定序是最早的核苷酸定序形式之一。 RNA 定序的主要標誌是 1972 年和 1976 年 Walter Fiers 及其同事在根特大學（根特，比利時）確定並發表的第一個完整基因序列和噬菌體 MS2 的完整基因組。傳統的 RNA 定序方法需要建立一個用於定序的互補 cDNA（Complementary DNA）分子。

早期的 DNA 定序方法

確定 DNA 序列的第一種方法涉及由康奈爾大學的吳瑞於 1970 年建立的位置特異性引子延伸策略。 DNA 聚合酶催化和特定核苷酸標記，這兩者在當前的定序方案中都很重要，用於對 λ 噬菌體 DNA 的粘性末端進行定序。在 1970 年至 1973 年間，吳瑞、R Padmanabhan 及其同事證明，該方法可用於使用合成的位置特異性引子確定任何 DNA 序列。隨後弗雷德里克・桑格 (Frederick Sanger) 採用這種引子延伸策略在英國劍橋的英國醫學研究委員會 (MRC) 中心開發了更快速的 DNA 定序方法，並於 1977 年發表了「使用鏈終止抑制劑進行 DNA 定序」的方法。

全基因組定序

第一個完整的 DNA 基因組定序是在 1977 年 Φ-X174 噬菌體（Phage Φ-X174）的定序工作。醫學研究委員會的科學家在 1984 年破譯了 Epstein-Barr 病毒的完整 DNA 序列，發現它含有 172,282 個核苷酸。 該序列的完成標誌著 DNA 定序的一個重要轉折點，它在沒有病毒基因譜知識的情況下實現了 DNA 定序。

20 世紀 80 年代初，Pohl 及其同事開發了一種在電泳時將定序反應混合物的 DNA 分子轉移到固定基質上的非放射性方法。隨後 GATC Biotech 公司的 DNA 定序儀「Direct-Blotting-Electrophoresis-System GATC 1500」商業化，該定序儀在 EU 基因組定序程式的框架以及酵母釀酒酵母染色體 II 的完整 DNA 序列中廣泛使用。加利福尼亞理工學院的 Leroy E. Hood 實驗室於 1986 年宣布了第一台半自動 DNA 定序機。隨後，Applied Biosystems 在 1987 年推出了第一台全自動定序儀 ABI 370。以及 Dupont 公司的 Genesis 2000，該儀器使用了一種新的螢光標記技術，可在單一泳道中辨識所有四個雙去氧核苷酸。到 1990 年，美國國立衛生研究院（NIH）已開始對支原體，大腸桿菌，秀麗隱杆線蟲和釀酒酵母進行大規模定序實驗，費用為每個鹼基 0.75 美元。同時，人類 cDNA 序列的定序始於 Craig Venter 的實驗室，試圖取得人類基因組的編碼部分。 1995 年，Venter，Hamilton Smith 及其基因組研究所（TIGR）的同事發表了第一個完整的自由生物體細菌流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae）的基因組。該環形染色體中含有 1,830,137 個鹼基，其在《科學》雜誌中的發表標誌著全基因組鳥槍法定序的首次公開使用，擺脫了初始繪製工作的需要。

高通量定序 (HTS) 方法

1990 年代中後期開發了幾種新的 DNA 定序方法，並於 2000 年在商業 DNA 定序儀中實施。這些方法統稱為「下一代」或「第二代」定序 (NGS) 方法，以便將它們與包括桑格定序在內的早期方法區分開來。 與第一代定序相比，NGS 技術的典型特徵是高度可擴展，允許一次對整個基因組進行定序。通常，這是通過將基因組片段化成小塊、隨機採樣片段並使用多種技術之一對其進行定序來實現的，例如下面描述的那些。 整個基因組定序是可能的，因為在一個自動化過程中同時對多個片段進行定序（命名為「大規模並行」定序）。

1990 年 10 月 26 日，錢永健、Pepi Ross、Margaret Fahnestock 和 Allan J Johnston 提交了一項專利，描述了在 DNA 陣列（墨點和單個 DNA 分子）上使用可移除的 3' 阻斷劑進行逐步（「鹼基對鹼基」）定序。 1996 年，斯德哥爾摩皇家理工學院的波爾・尼倫 (Pål Nyrén) 和他的學生穆斯塔法・羅納吉 (Mostafa Ronaghi) 發表了他們的焦磷酸定序方法。

1997 年 4 月 1 日，Pascal Mayer 和 Laurent Farinelli 向世界智慧財產權組織提交了描述 DNA 菌落定序的專利。 本專利中描述的 DNA 樣品製備和隨機表面聚合酶連鎖反應 (PCR) 陣列方法，與錢永健等人的「鹼基對鹼基」定序方法相結合，現已在 Illumina 公司的 Hi-Seq 基因組定序儀中實施。



基本方法

Maxam-Gilbert 定序法

馬克薩姆 - 吉爾伯特定序（英語：Maxam-Gilbert sequencing）是一項由阿倫・馬克薩姆與沃爾特・吉爾伯特於 1976～1977 年間開發的 DNA 定序方法。此項方法基於：對核鹼基特異性地進行局部化學改性，接下來在改性核苷酸毗鄰的位點處 DNA 骨架發生斷裂 。

Sanger 定序法

Sanger（桑格）雙去氧鏈終止法是弗雷德里克・桑格（Frederick Sanger）於 1975 年發明的。定序過程需要先做一個聚合酶連鎖反應（PCR）。PCR 過程中，雙去氧核苷酸可能隨機地被加入到正在合成中的 DNA 片段里。由於雙去氧核糖核苷酸又少了一個氧原子，一旦它被加入到 DNA 鏈上，這個 DNA 鏈就不能繼續增加長度。最終的結果是獲得所有可能獲得的、不同長度的 DNA 片段。目前最普遍最先進的方法，是將雙去氧核糖核苷酸進行不同螢光標記。將 PCR 反應獲得的總 DNA 通過毛細管電泳分離，跑到最末端的 DNA 就可以在雷射的作用下發出螢光。由於 ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP（4 種雙去氧核糖核苷酸）螢光標記不同，電腦可以自動根據顏色判斷該位置上鹼基究竟是 A，T，G，C 中的哪一個。



進階方法和 de novo 定序法

霰彈槍定序法

霰彈槍定序法（Shotgun sequencing，又稱鳥槍法）是一種廣泛使用的為較長 DNA 定序的方法。它比傳統的定序法快速，但精確度較差。霰彈槍定序法曾經使用於塞雷拉基因組（Celera Genomics）公司所主持的人類基因組計劃。

Bridge PCR



新一代定序

隨著人們對低成本定序的需求與日俱增，推動了高通量定序（high-throughput sequencing）的發展，此技術又稱為二代定序、新一代定序、次世代定序；這些技術對定序過程采多路復用，同時產生上千或上百萬條序列。高通量定序技術的目的是降低 DNA 定序的成本，這個成本比同樣可實現定序的染料終止法來得低得多。超高通量定序過程中可同時執行高達 500,000 次的邊合成邊定序。

454 生物科學和焦磷酸定序法

454 定序法由 454 生物科學發明，是一個類似焦磷酸定序法的新方法。2003 年向 GenBank 提交了一個腺病毒全序列，使得他們的技術成為 Sanger 定序法後第一個被用來測生物基因組全序列的新方法。454 使用類似於焦磷酸定序的方法，有著相當高的讀取速度，大約為 5 小時可以測兩千萬鹼基對。



正在開發的定序法

奈米孔 DNA 定序法

高通量定序

高通量定序能一次對幾十到幾百萬 DNA 分子進行序列測定。



參見


* 已定序的生物



參考文獻