色層分析法（英語：chromatography）簡稱層析法，又稱色譜法，是一種分離和分析方法，在分析化學、有機化學、生物化學等領域有著非常廣泛的應用。層析利用不同物質在不同相態的選擇性分配，以流動相對固定相中的混合物進行洗脫，混合物中不同的物質會以不同的速度沿固定相移動，最終達到分離的效果。層析起源於 20 世紀初，1950 年代之後飛速發展，並發展出一個獨立的三級學科 —— 層析學。歷史上曾經先後有兩位化學家因為在層析領域的突出貢獻而獲得諾貝爾化學獎，此外層析分析方法還在 12 項獲得諾貝爾化學獎的研究工作中起到關鍵作用。



歷史

層析的起源

層析起源於 20 世紀初，1906 年俄國植物學家米哈伊爾・茨維特用碳酸鈣填充豎立的玻璃管，以石油醚洗脫植物色素的提取液，經過一段時間洗脫之後，植物色素在碳酸鈣柱中實現分離，由一條色帶分散為數條平行的色帶。由於這一實驗將混合的植物色素分離為不同的色帶，因此茨維特將這種方法命名為Хроматография，這個單詞最終被英語等拼音語言接受，成為層析的名稱。漢語中的層析也是對這個單詞的意譯。

茨維特並非著名科學家，他對層析的研究以俄語發表在俄國的學術雜誌之後不久，第一次世界大戰爆發，歐洲正常的學術交流被迫終止。這些因素使得層析問世後十餘年間不為學術界所知，直到 1931 年德國柏林威廉皇帝研究所的庫恩將茨維特的方法應用於葉紅素和葉黃素的研究，庫恩的研究獲得了廣泛的承認，也讓科學界接受了層析，此後的一段時間內，以氧化鋁為固定相的層析在有色物質的分離中取得了廣泛的應用，這就是今天的吸附層析。

分配層析的出現和層析方法的普及

1938 年阿徹・約翰・波特・馬丁和理察・勞倫斯・米林頓・辛格準備利用胺基酸在水和有機溶劑中的溶解度差異分離不同種類的胺基酸，馬丁早期曾經設計了逆流萃取系統以分離維生素，馬丁和辛格準備用兩種逆向流動的溶劑分離胺基酸，但是沒有獲得成功。後來他們將水吸附在固相的矽膠上，以氯仿沖洗，成功地分離了胺基酸，這就是現在常用的分配層析。在獲得成功之後，馬丁和辛格的方法被廣泛應用於各種有機物的分離。1943 年馬丁以及辛格又發明了在蒸汽飽和環境下進行的紙層析。

氣相層析和層析理論的出現

1952 年馬丁和詹姆斯提出用氣體作為流動相進行層析分離的想法，他們用矽藻土吸附的矽酮油作為固定相，用氮氣作為流動相分離了若干種小分子量揮發性有機酸。

氣相層析的出現使層析技術從最初的定性分離手段進一步演化為具有分離功能的定量測定手段，並且極大的刺激了層析技術和理論的發展。相比於早期的液相層析，以氣體為流動相的層析對設備的要求更高，這促進了層析技術的機械化、標準化和自動化；氣相層析需要特殊和更靈敏的檢測裝置，這促進了檢測器的開發；而氣相層析的標準化又使得層析學理論得以形成層析學理論中有著重要地位的塔板理論和 Van Deemter 方程，以及保留時間、保留指數、峰寬等概念都是在研究氣相層析行為的過程中形成的。

高效液相層析

1960 年代，為了分離蛋白質、核酸等不易汽化的大分子物質，氣相層析的理論和方法被重新引入經典液相層析。1960 年代末科克蘭、哈伯、荷瓦斯、莆黑斯、里普斯克等人開發了世界上第一台高效液相層析儀，開啟了高效液相層析的時代。高效液相層析使用粒徑更細的固定相填充層析柱，提高層析柱的塔板數，以高壓驅動流動相，使得經典液相層析需要數日乃至數月完成的分離工作得以在幾個小時甚至幾十分鐘內完成。

1971 年科克蘭等人出版了《液相層析的現代實踐》一書，標誌著高效液相層析法（HPLC）正式建立。在此後的時間裡，高效液相層析成為最為常用的分離和檢測手段，在有機化學、生物化學、醫學、藥物開發與檢測、化工、食品科學、環境監測、商檢和法檢等方面都有廣泛的應用。高效液相層析同時還極大的刺激了固定相材料、檢測技術、數據處理技術以及層析理論的發展。



原理

層析過程的本質是待分離物質分子在固定相和流動相之間分配平衡的過程，不同的物質在兩相之間的分配會不同，這使其隨流動相運動速度各不相同，隨著流動相的運動，混合物中的不同組分在固定相上相互分離。根據物質的分離機制，又可以分為吸附層析、分配層析、離子交換層析、凝膠層析、親和層析等類別。

吸附層析

吸附層析亦稱液固層析法 (liquid-solid chromatography，LSC)，利用固定相吸附中對物質分子吸附能力的差異實現對混合物的分離，吸附層析的層析過程是流動相分子與物質分子競爭固定相吸附中心的過程

吸附層析的分配係數表達式如下：

　
: : $K_{a}={\frac {[X_{s}]}{[X_{m}]}}$

其中 $[X_{s}]$ 表示被吸附於固定相活性中心的組分分子含量， $[X_{m}]$ 表示游離於流動相中的組分分子含量。分配係數對於計算待分離物質組分的保留時間有很重要的意義。

分配層析

分配層析亦稱液液層析法 (liquid-liquid chromatography，LLC)，利用固定相與流動相之間對待分離組分溶解度的差異來實現分離。分配層析的固定相一般為液相的溶劑，依靠塗布、鍵合、吸附等手段分布於層析柱或者擔體表面。分配層析過程本質上是組分分子在固定相和流動相之間不斷達到溶解平衡的過程。

分配層析的狹義分配係數表達式如下：

　
: : $K={\frac {C_{s}}{C_{m}}}={\frac {X_{s}/V_{s}}{X_{m}/V_{m}}}$

式中 $C_{s}$ 代表組分分子在固定相液體中的溶解度， $C_{m}$ 代表組分分子在流動相中的溶解度。

離子交換層析

離子交換層析利用待分離組分與固定相之間發生離子交換的能力差異來實現分離。離子交換層析的固定相一般為離子交換樹脂，樹脂分子結構中存在許多可以電離的活性中心，待分離組分中的離子會與這些活性中心發生離子交換，形成離子交換平衡，從而在流動相與固定相之間形成分配。固定相的固有離子與待分離組分中的離子之間相互爭奪固定相中的離子交換中心，並隨著流動相的運動而運動，最終實現分離。

離子交換層析的分配係數又叫做選擇係數，其表達式為：

　
: : $K_{s}={\frac {[RX^{+}]}{[X^{+}]}}$

凝膠層析

凝膠層析的原理比較特殊，類似於分子篩。待分離組分在進入凝膠層析後，會依據分子量的不同，進入或者不進入固定相凝膠的孔隙中，不能進入凝膠孔隙的分子會很快隨流動相洗脫，而能夠進入凝膠孔隙的分子則需要更長時間的沖洗才能夠流出固定相，從而實現了根據分子量差異對各組分的分離。調整固定相使用的凝膠的交聯度可以調整凝膠孔隙的大小；改變流動相的溶劑組成會改變固定相凝膠的溶漲狀態，進而改變孔隙的大小，獲得不同的分離效果。

親和層析

是一種利用固定相的結合特性來分離分子的層析方法。親和層析在凝膠過濾層析柱上連接與待分離的物質有一定結合能力的分子，並且它們的結合是可逆的，在改變流動相條件時二者還能相互分離。親和層析可以用來從混合物中純化或濃縮某一分子，也可以用來去除或減少混合物中某一分子的含量。



層析理論

關於保留時間的理論

保留時間是樣品從進入層析柱到流出層析柱所需要的時間，不同的物質在不同的層析柱上以不同的流動相洗脫會有不同的保留時間，因此保留時間是層析分析法比較重要的參數之一。

保留時間由物質在層析中的分配係數決定：

　
: : $t_{R}=t_{0}(1+KV_{s}/V_{m})$

式中 $t_{R}$ 表示某物質的保留時間， $t_{0}$ 是層析系統的死時間，即流動相進入層析柱到流出層析柱的時間，這個時間由層析柱的孔隙、流動相的流速等因素決定。K 為分配係數， $V_{s}$ $V_{m}$ 表示固定相和流動相的體積。這個公式又叫做層析過程方程，是層析學最基本的公式之一。

在薄層層析中沒有樣品進入和流出固定相的過程，因此人們用比移值標示物質的層析行為。比移值是一個與保留時間相對應的概念，它是樣品點在層析過程中移動的距離與流動相前沿移動距離的比值。與保留時間一樣，比移值也由物質在層析中的分配係數決定：

　
: : $R_{f}={\frac {V_{m}}{V_{m}+KV_{s}}}$

其中， $R_{f}$ 是比移值，K 表示層析分配係數， $V_{s}$ $V_{m}$ 表示固定相和流動相的體積。

基於熱力學的塔板理論

塔板理論是層析學的基礎理論，塔板理論將層析柱看作一個分餾塔，待分離組分在分餾塔的塔板間移動，在每一個塔板內組分分子在固定相和流動相之間形成平衡，隨著流動相的流動，組分分子不斷從一個塔板移動到下一個塔板，並不斷形成新的平衡。一個層析柱的塔板數越多，則其分離效果就越好。

根據塔板理論，待分離組分流出層析柱時的濃度沿時間呈現二項式分布，當層析柱的塔板數很高的時候，二項式分布趨於常態分布。則流出曲線上組分濃度與時間的關係可以表示為：

　
: : $C_{t}={\frac {C_{0}}{\sigma {\sqrt {2\pi }}}}e^{-{\frac {(t-t_{R})^{2}}{2\sigma ^{2}}}}$

這一方程稱作流出曲線方程，式中 $C_{t}$ 為 t 時刻的組分濃度； $C_{0}$ 為組分總濃度，即峰面積； $\sigma $ 為半峰寬，即常態分布的標準差； $t_{R}$ 為組分的保留時間。

根據流出曲線方程人們定義層析柱的理論塔板高度為單位柱長度的層析峰方差：

　
: : $H={\frac {\sigma ^{2}}{L}}$

理論塔板高度越低，在單位長度層析柱中就有越高的塔板數，則分離效果就越好。決定理論塔板高度的因素有：固定相的材質、層析柱的均勻程度、流動相的理化性質以及流動相的流速等。

塔板理論是基於熱力學近似的理論，在真實的層析柱中並不存在一片片相互隔離的塔板，也不能完全滿足塔板理論的前提假設。如塔板理論認為物質組分能夠迅速在流動相和固定相之間建立平衡，還認為物質組分在沿層析柱前進時沒有徑向擴散，這些都是不符合層析柱實際情況的，因此塔板理論雖然能很好地解釋層析峰的峰型、峰高，客觀地評價層析柱地柱效，卻不能很好地解釋與動力學過程相關的一些現象，如層析峰峰型的變形、理論塔板數與流動相流速的關係等。

基於動力學的范第姆特方程

范第姆特方程（Van Deemter equation）是對塔板理論的修正，用於解釋層析峰擴張和柱效降低的原因。塔板理論從熱力學出發，引入了一些並不符合實際情況的假設，Van Deemter 方程則建立了一套經驗方程來修正塔板理論的誤差。

范第姆特方程將峰形的改變歸結為理論塔板高度的變化，理論塔板高度的變化則源於若干原因，包括渦流擴散、縱向擴散和傳質阻抗等。

由於層析柱內固定相填充的不均勻性，同一個組分會沿著不同的路徑通過層析柱，從而造成峰的擴張和柱效的降低。這稱作渦流擴散

縱向擴散是由濃度梯度引起的，組分集中在層析柱的某個區域會在濃度梯度的驅動下沿著徑向發生擴散，使得峰形變寬柱效下降。

傳質阻抗本質上是由達到分配平衡的速率帶來的影響。實際體系中，組分分子在固定相和流動相之間達到平衡需要進行分子的吸附、脫附、溶解、擴散等過程，這種過程稱為傳質過程，阻礙這種過程的因素叫做傳質阻抗。在理想狀態中，層析柱的傳質阻抗為零，則組分分子流動相和固定相之間會迅速達到平衡。在實際體系中傳質阻抗不為零，這導致層析峰擴散，柱效下降。

在氣相層析中范第姆特方程形式為：

　
: : $H=A+{\frac {B}{\mu }}+C\mu $

其中 H 為理論塔板高度，A 為渦流擴散係數，B 為縱向擴散係數，C 為傳質阻抗係數， $\mu $ 為流動相流速。

在高效液相層析中，由於流動相黏度遠遠高於氣相層析，縱向擴散對峰型的影響很小，可以忽略不計算，因而范第姆特方程的形式為：

　
: : $H=A+C\mu $



基本技術和方法

根據流動相的不同，層析技術可以分為液相層析和氣相層析。層析常見的方法有：柱層析、薄層層析、氣相層析、高效液相層析等。

柱層析是最原始的層析方法，這種方法將固定相注入下端塞有棉花或濾紙的玻璃管中，將被樣品飽和的固定相粉末攤鋪在玻璃管頂端，以流動相洗脫。常見的洗脫方式有兩種，一種是自上而下依靠溶劑本身的重力洗脫，一種是自下而上依靠毛細作用洗脫。收集分離後的純淨組分也有兩種不同的方法，一種方法是在柱尾直接接受流出的溶液，另一種方法是烘乾固定相後用機械方法分開各個色帶，以合適的溶劑浸泡固定相提取組分分子。柱層析被廣泛應用於混合物的分離，包括對有機合成產物、天然提取物以及生物大分子的分離。

薄層層析是應用非常廣泛的層析方法，這種層析方法將固定相圖布在金屬或玻璃薄板上形成薄層，用毛細管、鋼筆或者其他工具將樣品點染於薄板一端，之後將點樣端浸入流動相中，依靠毛細作用令流動相溶劑沿薄板上行展開樣品。薄層層析成本低廉操作簡單，被用於對樣品的粗測、對有機合成反應進程的檢測等用途。

氣相層析是機械化程度很高的層析方法，氣相層析系統由氣源、層析柱和柱箱、檢測器和記錄器等部分組成。氣源負責提供層析分析所需要的載氣，即流動相，載氣需要經過純化和恆壓的處理。氣相層析的層析柱一般直徑很細長度很長，根據結構可以分為填充柱和毛細管柱兩種，填充柱比較短粗，直徑在 5 毫米左右，長度在 2－4 米之間，外殼材質一般為不鏽鋼，內部填充固定相填料；毛細管柱由玻璃或石英製成，內徑不超過 0.5 毫米，長度在數十米到一百米之間，柱內或者填充填料或者圖布液相的固定相。柱箱是保護層析柱和控制柱溫度的裝置，在氣相層析中，柱溫常常會對分離效果產生很大影響，程序性溫度控制常常是達到分離效果所必須的，因此柱箱扮演了非常重要的角色。檢測器是氣相層析帶給層析分析法的新裝置，在經典的柱層析和薄層層析中，對樣品的分離和檢測是分別進行的，而氣相層析則實現了分離與檢測的結合，隨著技術的進步，氣相層析的檢測器已經有超過 30 種不同的類型。記錄器是記錄層析信號的裝置，早期的氣相層析使用記錄紙和記錄器進行記錄，現在記錄工作都已經依靠計算機完成，並能對數據進行實時的化學計量學處理。氣相層析被廣泛應用於小分子量複雜組分物質的定量分析。

高效液相層析（HPLC）是目前應用最多的層析分析方法，高效液相層析系統由流動相儲液體瓶、輸液泵、進樣器、層析柱、檢測器和記錄器組成，其整體組成類似於氣相層析，但是針對其流動相為液體的特點作出很多調整。HPLC 的輸液泵要求輸液量恆定平穩；進樣系統要求進樣便利切換嚴密；由於液體流動相黏度遠遠高於氣體，為了減低柱壓，高效液相層析的層析柱一般比較粗，長度也遠小於氣相層析柱。HPLC 應用非常廣泛，幾乎遍及定量定性分析的各個領域。



應用

層析的應用可以根據目的分為製備性層析和分析性層析兩大類。

製備性層析的目的是分離混合物，獲得一定數量的純淨組分，這包括對有機合成產物的純化、天然產物的分離純化以及去離子水的製備等。相對於層析出現之前的純化分離技術如重結晶，層析能夠在一步操作之內完成對混合物的分離，但是層析分離純化的產量有限，只適合於實驗室應用。

分析性層析的目的是定量或者定性測定混合物中各組分的性質和含量。定性的分析性層析有薄層層析、紙層析等，定量的分析性層析有氣相層析、高效液相層析等。層析應用於分析領域使得分離和測定的過程合二為一，降低了混合物分析的難度縮短了分析的周期，是目前比較主流的分析方法。在中華人民共和國藥典中，共有超過 600 種化學合成藥和超過 400 種中藥的質量控制應用了高效液相層析的方法。



發展方向

層析是分析化學中應用最廣泛發展最迅速的研究領域，新技術新方法日新月異。

新固定相的研究

固定相和流動相是層析的主角，新固定相的研究不斷擴展著層析的應用領域，如手性固定相使層析能夠分離和測定手性化合物；反相固定相沒有死吸附，可以簡單地分離和測定血漿等生物藥品。

檢測方法的研究

檢測方法也是層析學研究的熱點之一，人們不斷更新檢測器的靈敏度，使層析分析能夠更靈敏地進行分析。人們還將其他光譜的技術引入層析，如進行層析－質譜連用、層析－紅外光譜連用、層析－紫外連用等，在分離化合物的同時即行測定化合物的結構。層析檢測器的發展還伴隨著數據處理技術的發展，檢測獲得的數據隨即進行計算處理，使試驗者獲得更多信息。

專家系統

專家系統是層析學與信息技術結合的產物，由於應用層析進行分析要根據研究內容選擇不同的流動相、固定相、預處理方法以及其他條件，因此需要大量的實踐經驗，層析專家系統是模擬層析專家的思維方式為層析使用者提供幫助的程序，專家系統的知識庫中存儲了大量層析專家的實踐經驗，可以為使用者提供關於層析柱系統選擇、樣品處理方式、層析分離條件選擇、定性和定量結果解析等幫助。

層析新方法

層析新方法也是層析研究熱點之一。高效毛細管電泳法是目前研究最多的層析新方法，這種方法沒有流動相和固定相的區分，而是依靠外加電場的驅動令帶電離子在毛細管中沿電場方向移動，由於離子的帶電狀況、質量、形態等的差異使不同離子相互分離。高效毛細管電泳法沒有 HPLC 方法中存在的傳質阻抗、渦流擴散等降低柱效的因素，縱向擴散也因為毛細管壁的雙電層的存在而受到抑制，因而能夠達到很高的理論塔板數，有極好的分離效果。



參考文獻



參見


* 分析化學

* 高效液相層析

* 薄層層析



外部連結


* 層析及其分類