高解析度熔解（英語：High Resolution Melt，縮寫：HRM） 分析是分子生物學中的一項強大的技術。這項技術是用於檢測雙鏈 DNA 樣本中的突變、多態性和表觀遺傳差異。它是由愛達荷科技公司和猶他大學發現並開發的。與其他基因型分型技術相比，它具有以下優勢：


* 與其他基因分型技術（如 DNA 測序和 TaqMan SNP 基因分型）相比，它更具有成本效益。這使它成為大規模基因分型項目的理想選擇。

* 它不僅快而且強大，因此它能夠快速並準確地對許多樣本進行基因分型。

* 使用起來非常簡單。 通過高質量的 HRM 檢測，非遺傳學家可以在任何實驗室使用具有 HRM 功能的實時 PCR 機器進行強大的基因分型。



方法

HRM 分析是在雙鏈 DNA 樣本上進行的。通常，使用者會在 HRM 分析之前使用聚合酶鏈式反應（PCR）來擴增他們感興趣的突變所在的 DNA 區域。這個被擴增的區域被稱為擴增子。在 PCR 過程之後，HRM 分析開始。HRM 過程只是將擴增子的 DNA 從 50˚C 左右精確升溫到 95˚C 左右。在這個過程中的某個時刻，溫度會達到擴增子的熔點溫度，擴增子的兩條 DNA 鏈會分離。

HRM 的關鍵是實時監測 DNA 鏈的分離。這可以通過使用螢光染料實現的。用於 HRM 的染料被稱為插層染料，並且具有獨特的特性。插層染料專門與雙鏈 DNA 結合，當它們結合時會發出明亮的螢光。在沒有雙鏈 DNA 的情況下，染料沒有任何東西可供結合，因此只能發出低水平的螢光。在 HRM 分析開始時，由於擴增子有數十億個拷貝，樣品中會發出高水平的螢光。但隨著樣品被加熱，DNA 鏈分離，雙鏈 DNA 的存在不斷減少，導致螢光減弱。HRM 機器有一個攝像頭，通過測量螢光來觀察這個過程。然後機器將這一數據簡單地繪製成一個被稱為熔解曲線的圖形，顯示螢光水平與溫度的關係。

熔解曲線的比較

兩條 DNA 鏈分開時擴增子的溫度是完全可以預測的。它取決於 DNA 鹼基的序列。如果比較來自兩個不同人的兩個樣本，他們應該會給出完全相同形狀的熔解曲線。然而，如果其中一人擴增的 DNA 區域有突變，那麼這將改變 DNA 鏈溶解的溫度。這會導致兩條熔解曲線結果不同。雖然這種差異可能非常微小，也許是零點幾度，但是由於 HRM 機器有能力以「高解析度」監測這一過程，因此可以準確記錄這些變化，從而確定是否存在突變。

野生型、雜合子和純合子

生物體擁有每個基因的兩個（或更多）拷貝，被稱為兩個等位基因。因此，如果從患者身上採集樣本並使用 PCR 進行擴增，則關注的 DNA（等位基因）區域的兩個拷貝都會被擴增。如果想尋找突變，有三種可能性：

1. 兩個等位基因都不包含突變。（野生型）
2. 其中一個等位基因包含突變。（雜合子）
3. 兩個等位基因都包含突變。（純合子）

這三種情況分別被稱為「野生型」、「雜合子」和「同合子」。每一種都會給出了一個略有不同的熔解曲線。有了高質量的 HRM 檢測，就可以區分這三種情況。

純合子等位基因變體的特徵可以是 HRM 分析所生成的熔解曲線上的溫度偏移。相比之下，雜合子的特徵在於熔解曲線形狀的變化。這是由於野生型和變異鏈之間不穩定的異源雙鏈退火產生的鹼基對不匹配。 在生成的熔解曲線上可以很清楚地看到這些差異，並且可以通過生成差異曲線直觀地放大不同基因型之間的熔解曲線差異。



應用

SNP 基因分型 / 點突變檢測

傳統的 SNP 基因分型方法通常既費時又昂貴，需要將多個基於探針的檢測方法多重組合在一起或使用 DNA 微陣列。HRM 更具成本效益，減少了設計多對引物和購買昂貴探針的需要。HRM 方法已經成功地用於檢測電壓敏感鈉通道（Vssc）基因中的一個 G 到 A 的替換，該基因賦予疥蟎對殺蟎劑百滅寧的抗性。這種突變導致蛋白質的編碼（G1535D）發生變化。通過 HRM 對從疑似百滅寧易感和耐受人群中收集的疥蟎進行的分析顯示出不同的熔解曲線。據觀察，對蟎蟲敏感的擴增子相對於對蟎蟲耐受具有更高的熔解溫度，這是由於 GC 鹼基對的熱穩定性更高。

在與臨床診斷相關的領域中，HRM 已被證明原則上適用於檢測乳腺癌易感基因 BRCA1 和 BRCA2 的突變。在這些基因中已鑑定出了 400 多個突變。基因測序是識別突變的黃金標準。然而，測序既費時又費力，而且測序之前通常有用於識別異源雙鏈 DNA 的技術，然後進一步放大這些問題。HRM 提供了一種更快、更方便的閉管方法來分析突變的存在，並提供了一個結果，如果有興趣，還可以進行進一步研究。在 2006 年由 Scott 等人進行的一項研究中，使用了 3 個帶有不同 BRCA 突變的細胞系來評估 HRM 方法。研究發現，所產生的 PCR 產物的熔解曲線可以用來區分擴增子中是否存在突變。同樣，在 2007 年，Krypuy 等人表明，精心設計的 HRM 檢測（關於引物放置）可以成功地用於檢測 TP53 基因的突變，該基因編碼乳腺癌和卵巢癌臨床樣本中的腫瘤抑制蛋白 p53。這兩項研究都強調了一個事實，即熔解曲線的變化可能是熔解溫度的變化或熔解曲線形狀的明顯差異。這兩個參數都是擴增子序列的函數。科學家一致認為，HRM 是一種具有成本效益的方法，可用作懷疑含有多態性或突變的樣本的初始篩選。這將減少需要使用更傳統方法進一步研究的樣本數量。

接合性測試

目前有許多方法可用於確定基因在特定位點的接合性狀態。這些方法包括使用專門設計的探針進行 PCR，以檢測基因的變異（SNP 基因分型是最簡單的情況）。如果涉及較長的變異範圍，可能需要對擴增子進行 PCR 後分析。可以測量限制酶、電泳和色譜圖譜的變化。由於需要在 PCR 後的實驗室中處理高濃度的擴增子，這些方法通常更耗時，並且會增加實驗室中擴增子污染的風險。HRM 的使用減少了分析所需的時間和污染的風險。HRM 是一個更具成本效益的解決方案，高解析度元件不僅可以確定同源性和雜合性，還可以解析有關同源性和雜合性類型的信息，不同的基因比變異會產生不同的熔體曲線形狀。Gundry 等人於 2003 年的一項研究表明，對引物（一對）進行螢光標籤比使用插層染料（如 SYBR 綠色 I）更有利。然而，在開發和使用改進的插層染料方面已經取得了進展，它減少了 PCR 抑制的問題和對染料非飽和插層的擔憂。

表觀遺傳學

HRM 方法也被用於提供 DNA 甲基化狀態的可靠分析。這非常重要，因為腫瘤抑制基因、調節細胞的凋亡和 DNA 修復的甲基化狀態的變化是癌症的特徵，而且這對化療的反應也有影響。例如，如果患者的 DNA 修復基因 MGMT 的啟動子被甲基化，癌症患者可能對 DNA 烷化劑治療更敏感。在一項測試 MGMT 啟動子在 19 個結直腸樣本上的甲基化狀態的研究中，發現有 8 個樣本被甲基化。另一項研究則比較了通過亞硫酸鹽定序、焦磷酸測序和 HRM 獲得的 83 名高級別神經膠質瘤患者中 MGMT 啟動子甲基化的預測能力。發現 HRM 方法在量化甲基化水平方面至少等同於焦磷酸測序。

甲基化的 DNA 可以通過亞硫酸氫鹽修飾進行處理，將非甲基化的胞嘧啶轉化為尿嘧啶。因此，最初未甲基化的模板產生的 PCR 產物的熔點會低於甲基化模板產生的 PCR 產物。HRM 還提供了確定特定樣品中甲基化比例的可能性，方法是將其與標準曲線進行比較，標準曲線是由不同比例的甲基化和非甲基化的 DNA 混合而成的。這可以提供關於腫瘤可能具有的甲基化程度的信息，從而表明腫瘤的特徵以及它偏離「正常」的程度。

HRM 實際上也有利於診斷，因為它能夠適應高通量篩選（HTS）測試，並且由於其閉管形式，它可以將擴增子在實驗室內擴散和污染的可能性降到最低。

插層染料

為了跟蹤雙鏈 DNA 到單鏈 DNA 的轉變，採用了插層染料。這些染料顯示出不同的螢光發射，這取決於它們與雙鏈或單鏈 DNA 的結合。SYBR 綠色 I 是第一代用於 HRM 的染料。當它嵌入到雙鏈 DNA 而不是單鏈 DNA 中時，它會發出螢光。它只能在亞飽和濃度下使用，因為它在高濃度時可能會抑制 PCR。最近，一些研究人員不鼓勵將 SYBR 綠色 I 用於 HRM，並聲稱需要對協議進行大量修改。這是因為有人認為，缺乏準確性可能是由於「染料跳躍」造成的，即融化的雙鏈體的染料可能被重新摻入到尚未融化的雙鏈 DNA 區域中。LC Green 和 LC Green Plus、ResoLight、EvaGreen、Chromofy 及 SYTO 9 等新型飽和染料已上市並已成功用於 HRM。然而，一些人已經成功地將 SYBR 綠 I 與 Corbett Rotorgene 儀器一起用於 HRM，並提倡將 SYBR 綠 I 用於 HRM 的應用。



高解析度熔解實驗的設計

高解析度熔解分析通常涉及 qPCR 擴增，然後用螢光染料收集熔解曲線。由於高解析度熔解分析的敏感性，需要仔細考慮 PCR 循環條件、模板 DNA 的質量和熔解曲線的參數。為了獲得準確且可重複的結果，必須優化 PCR 熱循環條件，以確保所需的 DNA 區域以高特異性和序列變體之間的最小偏差被擴增。熔解曲線通常在很寬的溫度範圍內進行，以小的（~0.3℃）增量進行，並需要足夠長的時間（~10 秒）以使 DNA 在每個溫度步驟達到平衡。

除了典型的引物設計考慮因素外，用於高解析度熔解分析的引物設計還涉及最大化屬於不同基因型的 PCR 產物之間的熱力學差異。較小的擴增子通常比較長的擴增子產生更大的解鏈溫度變化，但這種變化無法用眼睛來預測。因此，在設計可區分序列變異的引物時，準確預測 PCR 產物的熔解曲線至關重要。專業軟體，如 uMelt 和 DECIPHER，可以幫助設計引物，使熔解曲線的變異性最大化，專門用於高解析度的熔解測定。



參見


* Beacon Designer

* 熔解曲線分析



參考文獻



外部連結


* HRM Technology （頁面存檔備份，存於網際網路檔案館）