古DNA

古DNA（ancient DNA，縮寫aDNA），是指從古代生物遺骸或環境樣本中分離提取的DNA。由於降解過程（包括交聯、脫氨基和片段化），古DNA與現代遺傳物質相比質量較低，其受損特徵和保存能力限制了可開展的分析類型，並為成功提取樣品的年齡設定了上限。即使在最佳保存條件下，樣品中含有足夠DNA供現有測序技術分析的上限約為40萬至150萬年。從物理標本中測序的最古老DNA來自西伯利亞超過一百萬年的猛獁象臼齒。

2022年，從格陵蘭永久凍土沉積物中回收了約200萬年前的遺傳物質，目前被認為是迄今發現的最古老DNA。同年，斯萬特·帕博因其在已滅絕古人類基因組和人類演化方面的發現，獲得諾貝爾生理學或醫學獎。古DNA的來源十分廣泛，包括古生物學和考古學的骨骼材料、木乃伊化組織、非冷凍醫學標本檔案收藏、保存的植物遺存、冰芯和永久凍土芯、海洋和湖泊沉積物以及挖掘出的土壤等。

## 歷史

### 1980年代：奠基

1984年，加州大學伯克利分校的樋口（Russ Higuchi）及其同事進行了最早的古DNA研究。他們報告稱，從已滅絕斑驢的博物館標本中提取到了DNA，且該標本在個體死亡150多年後仍可被提取和測序。隨後兩年，斯萬特·帕博通過對天然和人工木乃伊化標本的研究，證實這一現象並不局限於相對近代的博物館標本，也可在早至數千年前的人類木乃伊樣本中復現。帕博在1985年成功從古埃及木乃伊中提取並克隆了DNA，開啟了古DNA研究的先河。

當時測序古DNA所需的繁重流程（通過細菌克隆）是該領域發展的障礙。然而，隨著1980年代末聚合酶鏈式反應（PCR）技術的發展，該領域開始迅速進步。

### 1990年代：琥珀熱與反思

後PCR時代引發了一波發表浪潮，多個研究小組聲稱成功分離了古DNA。一系列令人難以置信的發現被發表，聲稱可從數百萬年前的標本中提取真實的DNA——林達爾（Lindahl）將其稱為「大洪水前DNA」（Antediluvian DNA）。大多數此類聲稱基於從琥珀中保存的生物提取DNA，包括無刺蜂、白蟻、植物等。甚至有人聲稱從白堊紀琥珀象鼻蟲和恐龍骨骼中提取了超過8000萬年前的DNA序列。

然而，隨著對DNA保存動力學、樣品污染風險和其他複雜因素理解的加深，該領域開始以更審慎的態度審視這些結果。眾多謹慎的嘗試未能重複許多發現，該十年間所有關於數百萬年古DNA的聲稱最終均被認定為不真實。所謂恐龍DNA後來被揭示為人類Y染色體污染。

### 2000年代：高通量革命

2007年引入了單引物延伸擴增技術以解決死後DNA修飾損傷問題。自2009年起，更便宜的研究技術徹底改變了古DNA研究領域，研究人員自2010年起能夠測序古人類DNA並恢復完整基因組。下一代測序（NGS）技術在古DNA研究中的應用，對重建古代或已滅絕生物的基因組至關重要。此外，該領域開始制定更好的DNA結果評估標準和準則，以區隔真實信號和污染干擾。

### 2020年代：諾貝爾獎與最古老DNA

2022年諾貝爾生理學或醫學獎授予斯萬特·帕博，以表彰其「關於已滅絕古人類基因組和人類演化的發現」。幾天後，2022年12月7日，《自然》雜誌發表的研究報告稱在格陵蘭發現了200萬年前的遺傳物質，這是迄今發現的最古老DNA。該研究利用環境DNA技術從凍土沉積物中重建了一個包含乳齒象、馴鹿、雁類和螞蟻等物種的古代生態系統。

## 降解與保存極限

古DNA的降解主要通過三種過程進行：交聯（DNA鏈之間形成化學鍵）、脫氨基（鹼基的化學修飾，特別是胞嘧啶轉化為尿嘧啶）和片段化（長鏈斷裂為短片段）。這些損傷限制了可開展的分子分析類型，並為樣品的可測序年齡設定了理論上限。

理論上的時限與環境條件密切相關。對紐西蘭恐鳥骨骼中線粒體DNA（mtDNA）和核DNA降解的研究表明，在-5°C條件下，線粒體DNA經過約683萬年後平均降解至1個鹼基對長度。核DNA的降解速度至少是線粒體DNA的兩倍。降解動力學已通過加速老化實驗得到驗證，進一步顯示了儲存溫度和濕度對DNA降解的強烈影響。即使在挖掘之後，環境效應仍可能加劇DNA的衰變速度。早期研究報告從白堊紀恐龍遺骸中回收了DNA，但這些結果很可能源於樣品污染而非真實古DNA的保存。

在最佳保存條件下，樣品的可測序DNA上限約為40萬至150萬年。2016年，研究人員在海洋沉積物芯中測量了葉綠體DNA，發現了可追溯至140萬年前的硅藻DNA。該DNA的半衰期顯著長於此前研究結果，可達約15,000年。研究還發現，DNA在前約10萬年按半衰期速率降解，之後則遵循更慢的冪律衰減速律。

## 污染與鑑定

古DNA研究面臨的一個主要問題是現代DNA的污染，包括來自研究人員的現代人類DNA和微生物DNA。由於標本與研究者在生物學上屬於同一物種（在人類古DNA研究中），污染問題尤為突出，可能導致數據分析結果嚴重偏倚。為應對污染，近年來發展出多種預防方法，包括在極度無菌條件下進行提取操作，使用特殊接頭區分樣品中的內源性分子與分析過程中引入的分子，以及應用生物資訊學方法根據已知讀取近似污染率。

隨著2000年代古DNA領域的發展，對回收的DNA進行鑑定以確認其確為古代DNA而非近期污染產物的重要性日益凸顯。由於DNA隨時間降解，組成DNA的核苷酸可能發生變化，特別是分子末端的胞嘧啶（C）脫氨基轉化為尿嘧啶（U），在測序過程中DNA聚合酶在尿嘧啶對面摻入腺嘌呤（A），導致古DNA數據中出現胞嘧啶（C）到胸腺嘧啶（T）的替換。這些替換的頻率隨樣品年齡增長而增加。C-T水平的頻率測量可通過多種軟體進行，如mapDamage2.0或PMDtools。此外，由於水解脫嘌呤作用，DNA斷裂為較小片段，這種短片段長度特徵也有助於區分現代DNA與古代DNA。

## 應用

### 非人類古DNA

儘管古DNA研究面臨諸多問題，已發表的動物和植物古DNA序列範圍廣泛且不斷增加。被檢測的各類組織包括：人工或天然木乃伊化動物遺骸、骨骼、貝殼、古糞便、酒精保存標本、干植物遺存，以及近年來直接從土壤樣品中提取的動植物DNA。

2013年6月，哥本哈根大學的一批研究人員宣布，他們從加拿大育空地區永久凍土中埋藏的腿骨材料中，成功測序了一匹56萬至78萬年前馬的DNA。同年，一個德國團隊報告了超過30萬年前的德寧格熊（Ursus deningeri）線粒體基因組，證明了真實的古DNA可在永久凍土之外保存數十萬年。2021年，來自西伯利亞永久凍土保存的兩顆猛獁象牙齒的核DNA被報導，兩顆牙齒均超過100萬年。2016年，研究人員在海洋沉積物芯中測量了葉綠體DNA，發現了可追溯至140萬年前的硅藻DNA。

### 人類古DNA

由於古人類遺骸受到廣泛的人類學、考古學和公眾關注，其一直是古DNA研究的重要焦點。但同時，由於標本與研究者屬於同一物種，污染問題更加突出。重要的標本來源包括天然保存的遺骸，如在阿爾卑斯山冰川中凍結的冰人奧茨以及在安第斯山脈高海拔快速乾燥保存的屍身；化學處理保存的組織，如古埃及木乃伊；但大多數人類古DNA研究集中於從骨骼和牙齒中提取DNA，其中顳骨岩部因其緻密結構提供良好的DNA保存條件而最為常用。古病理DNA也已成功從超過5,000年的人類樣本中提取，涵蓋鈣化胸膜、石蠟包埋組織和福馬林固定組織等。

2012年，一項研究分析了西班牙El Sidrón洞穴中一組尼安德特人的骨骼樣本，獲得了關於潛在親屬關係和遺傳多樣性的新見解。2015年11月，科學家報告發現了一顆含有丹尼索瓦人DNA的11萬年前牙齒。2018年的一項研究表明，青銅時代的大規模遷徙曾極大地影響了不列顛群島的遺傳結構，帶來了來自歐洲大陸的貝爾陶器文化。

這些研究還揭示了中亞祖先與美洲原住民之間的聯繫。在非洲，由於熱帶氣候較暖導致DNA降解更快，古DNA研究更為困難，但2017年已報告了早至8,100年前的古DNA樣本。通過測序來自石器時代狩獵採集者（2,000年前）和鐵器時代農民（300至500年前）的非洲基因組，研究者將人類群體間最早分化的時間推至35萬至26萬年前。截至2021年，最古老且已完全重建的人類基因組約為45,000年前，為理解人類遷徙和遺傳歷史（包括早期歐洲現代人與尼安德特人之間的基因交流）提供了關鍵見解。

## 重要研究者

- 斯萬特·帕博（Svante Pääbo）——2022年諾貝爾生理學或醫學獎得主
- 大衛·里奇（David Reich）——哈佛大學，古人類基因組學研究
- 貝絲·夏皮羅（Beth Shapiro）——加州大學聖克魯茲分校