比較基因組雜交

比較基因組雜交（Comparative genomic hybridization，CGH）是一種分子細胞遺傳學方法，在不培養細胞的情況下，分析相對於參照樣品，測試樣品的DNA中拷貝數變異（CNV）的多倍性程度。其目的是快速有效地比較兩個來源的兩組DNA樣本，這兩組DNA通常是密切相關的，因為兩者在整個染色體或亞染色體區域（整個染色體的一部分）上都可能有獲得或丟失。該技術最初是為了評估實體瘤和正常組織的染色體互補差異而開發的，相比更傳統的Giemsa顯帶技術和螢光原位雜交技術（FISH）（受限於所使用的顯微鏡解析度），它的解析度提高到了5-10Mb。

這項技術是通過競爭性螢光原位雜交實現的。簡言之，從待比較的兩個樣品（通常是測試和參照樣品）中分離DNA，用不同顏色（通常是紅色和綠色）的螢光團（螢光分子）分別標記兩組DNA樣品，變性DNA使其成為單鏈，再將兩組的1：1混合物與正常中期染色體進行雜交，並且結合在原位。然後使用螢光顯微鏡和電腦軟體，縱向比較雜交染色體螢光信號的著色差異，以鑑別兩組的染色體差異。雜交染色體特定區域中的測試樣品顏色較強，表示測試樣品中該區域有獲得，而參照樣品顏色較強表示測試樣品中有丟失。中性色（黃色，當同時標記紅色和綠色）則表示兩個樣品在該區域沒有差異。

CGH只能檢測不平衡的染色體異常，這是因為平衡的染色體異常（例如易位、倒位或環狀染色體）不影響拷貝數。不過CGH確實能夠在單次測試中探測全部46條人類染色體，並且可以發現缺失和重複，甚至在微觀尺度上，可以再用其他細胞學技術進一步鑑定候選基因。

通過結合CGH技術和DNA微陣列，已經開發出更特效的陣列CGH（aCGH），它可以逐點檢測CNV，解析度精確到100kb（千鹼基）。這種改進的技術可以發現已知和未知的致病位點。

## 歷史

發展CGH的動機：顯微鏡限制了當時可用的細胞遺傳學分析技術（G顯帶和FISH）的解析度。此外G顯帶解釋模糊，準確性偏低，而且這兩種技術都需要投入大量人力，這就對可檢查位點造成了限制。

CGH分析的第一份報告出自Kallioniemi及其同事（1992年，加利福尼亞大學舊金山分校），內容關於實體腫瘤。他們將該技術直接應用於乳腺癌細胞系和原發性膀胱腫瘤，建立完整的細胞拷貝數核型，識別出了16個不同的擴增區域，其中許多是新發現的。

不久之後，在1993年，du Manoir等人用幾乎相同的方法，在DNA文庫用不同比例的兩種螢光團繪製了一系列單獨的人類染色體，以此來測試該技術，並將CGH應用於唐氏綜合症、T細胞幼淋巴細胞性白血病或腎乳頭狀癌患者的基因組DNA。結果所得的螢光比率是準確的，並且可檢測到來自不同細胞類型的基因組DNA之間的差異，因此CGH是非常有效的細胞遺傳學分析工具。

最初難以推廣CGH技術，因為實驗設計不統一而彼此不一致，特別是數據的解釋不確定。然而1994年發表的一篇綜述詳細描述了一個易於理解的實驗設計，並且圖像分析軟體可以商業化，這使得CGH在世界各地得到應用。隨著顯微切割和簡併寡核苷酸引物聚合酶鏈式反應（DOP-PCR）等新技術用於生成DNA產物，而有可能將CGH應用於更小的染色體異常，從而提高CGH的解析度。

1997年，Solinas-Tolodo等人開創了陣列CGH，使用DNA微陣列代替傳統的中期染色體製劑，來分析腫瘤細胞。1998年，Pinkel等人則用其來分析乳腺癌細胞。以上都是藉助人類基因組計劃實現的，該計劃創造了一個DNA克隆片段文庫，包括整個人類基因組的已知位點，而這些片段被用作DNA微陣列上的探針。現在各種來源的探針，如cDNA、基因組PCR產物和細菌人工染色體（BACs）可用於DNA微陣列，總計可達200萬個探針。陣列CGH是自動化的，因為探針遠小於中期染色體，所以比傳統CGH有更高的解析度（精確至100kb），需要的DNA數量較小，還可以根據需要定位到特定的染色體區域，甚至可以定製，因此分析速度更快，更適用於診斷。

## 基本方法

### 中期載玻片製備

從核型正常的男性或女性獲得參照樣品DNA，置於載玻片上，優先使用女性DNA，因為它們具有兩條X染色體，其含有比男性Y染色體更多的遺傳資訊。使用植物血凝素刺激外周血中的淋巴細胞。將1ml肝素化血液加入10ml培養基中，並在37℃、5%CO2環境下培養72小時。加入秋水仙鹼中止細胞的有絲分裂，然後分離出細胞並用低滲氯化鉀處理，固定在3：1的甲醇/乙酸中。

然後將一滴細胞懸浮液從約30cm的高度滴到用乙醇清潔過的載玻片上，最佳條件為室溫、濕度60～70%。使用相差顯微鏡可視化地評估載玻片，應觀察到最小的細胞質，染色體不能重疊，應該為400-550個條帶，並且沒有分離的染色單體，最後應顯示為深色而不具有光澤。之後將載玻片在室溫空氣下過夜乾燥，再以四個為一組儲存在-20℃下，並用二氧化矽珠或氮以保持乾燥。應測試不同的供體，因為雜交是可變的。可以使用市售的載玻片，但始終應先進行測試。

### 從測試組織和參照組織中分離DNA

用標準苯酚萃取物從測試或參照（核型正常個體）組織提取DNA，其需要三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸（TE）和苯酚與等量的DNA水溶液的混合。然後通過攪拌和離心來分離混合液，之後除去水層並用乙醚進一步處理，最後用乙醇沉澱濃縮DNA。

也可以使用基於親和層析柱的商品DNA分離試劑盒來完成。

最優的是從新鮮或冷凍組織中提取DNA，因為這樣的質量最高，不過只要遵照適當的程序，現在也可以使用福馬林固定或石蠟包埋的庫存樣品。對於CGH實驗，0.5-1μg的DNA就足夠了，如果量不夠，可以使用DOP-PCR來擴增DNA，但是在這種情況下，需要同時擴增測試和參照樣品以提高準確性。

### DNA標記

用缺口轉譯標記DNA，切割DNA，並用螢光團（直接標記）、生物素或氧化苦苷標記的核苷酸替代後加入的綴合螢光團的抗體（間接標記）。隨後重要的一步是通過凝膠電泳檢查測試和參照DNA片段的長度，500kb-1500kb是最佳雜交範圍。

### 阻斷

添加未標記的Life Technologies Corporation的Cot-1DNA®（富含長度為50bp-100bp的重複序列的胎盤DNA）以阻斷正常的DNA序列重複，特別是在著絲粒和端粒，因為如果檢測到這些序列，可能會降低螢光比率和漏測獲得或丟失。

### 雜交

將8-12μl標記測試DNA和等量的標記參照DNA混合，加入40μg Cot-1DNA®，然後沉澱，隨後溶於6μl雜交混合液中，其含有50%甲醯胺（降低DNA解鏈溫度）和10%硫酸葡聚糖（增加pH7.0的標準枸櫞酸鹽水（SSC）溶液中的有效探針濃度）。

分別進行載玻片和探針的變性。將載玻片在72℃的70%甲醯胺/2×SSC中浸沒5-10分鐘，同時80℃水浴探針10分鐘，並立即加入中期載玻片製備中。然後用蓋玻片覆蓋該反應，放置在40℃的潮濕房中2至4天。

然後除去蓋玻片並給予多次5分鐘的洗滌，3次使用室溫的2xSSC，1次使用45℃的0.1xSSC，1次使用室溫的TNT。隨後預反應10分鐘，再進行60分鐘、37℃溫育，用TNT洗滌3次，每次5分鐘，之後用室溫的2×SSC洗滌1次。最後依次使用70%、96%、100%的乙醇乾燥載玻片，再用DAPI（0.35μg/ml）復染，用於染色體鑑定，並用蓋玻片密封。

### 螢光可視化和成像

可視化需要：裝備針對DAPI染色的合適濾光鏡的螢光顯微鏡，以及使用兩種螢光團，並且這些濾光鏡（例如窄帶濾光鏡）還應最小化螢光團之間的串擾。顯微鏡必須提供均勻照度而且沒有色度變化，可以適當校準並具有復消色差的平面物鏡，放大倍數為x63或x100。

使用至少0.1μm空間解析度的相機記錄圖像，像素至少600x600。相機還必須能夠融合至少5到10秒的圖像，其最小光度解析度為8bit。

可用市售的專門CGH軟體處理圖像，需要減去背景噪聲，去除和分割非染色體來源的內容，使螢光比率標準化，進行交互式核型分析和縮放染色體至標準長度。通過平均多個高質量中期染色體的比率生成了—呈現缺失或擴增的染色體區域的「相對拷貝數核型」，並沿著染色體模式圖（基於顯帶模式識別染色體）繪製它們。使用固定或統計閾值（置信區間）對比率概況進行解釋，當95%的螢光比率不包含1.0時，認為有獲得或丟失。

### 額外說明

必須特別注意避免DNA的污染，特別是測試DNA，因為污染了正常DNA會使結果偏向而接近1.0，由此可能會檢測不到異常。可以使用FISH、PCR和流式細胞計量術來驗證結果。

## 陣列比較基因組雜交

陣列比較基因組雜交（基於微陣列的比較基因組雜交，矩陣CGH，陣列CGH，aCGH）是一種分子細胞遺傳學技術，能在基因組範圍內高解析度地檢測染色體的拷貝數變化。陣列CGH將患者的基因組與參照基因組進行比較，鑑定兩個基因組之間的差異，並利用與傳統CGH相同的競爭性螢光原位雜交原理來定位患者基因組失衡的區域。

陣列CGH克服了傳統CGH的主要缺點—低解析度。在陣列CGH中，中期染色體被DNA克隆片段（+100-200kb）取代，其中確切的染色體位點是已知的。這樣可以更詳細地檢測畸變，而且可以將變化直接映射到基因組序列上。

陣列CGH已被證明是一種特異、靈敏、快速和高通量的技術，與其他分析DNA拷貝數變化的方法相比具有相當大的優勢，更適合應用於診斷。使用這種方法，可以檢測到5-10kb水平的拷貝數變化。截至2006年，高解析度CGH（HR-CGH）陣列能以200 bp的解析度準確檢測結構變異（SV）。該方法能夠識別新的復發性染色體變化，例如由於染色體畸變導致的癌症和先天性缺陷的微缺失和重複。

### 方法

陣列CGH基於與傳統CGH相同的原理。在這兩種技術中，用兩種不同的螢光團對來自參照（或對照）樣品的DNA和來自測試（或患者）樣品的DNA進行差異標記，並用作與靶標核酸競爭性共雜交的探針。在傳統CGH中，靶標是參照的中期染色體。在陣列CGH中，這些靶標可以是克隆在多種載體（如BACs或質粒）、cDNA或寡核苷酸中的基因組片段。

圖1是陣列CGH技術的概略示意圖。用紅色螢光團（Cyanine 5）標記來自待測樣品的DNA，用綠色螢光團（Cyanine 3）標記參照樣品DNA。將等量的兩種DNA樣品混合併共雜交至含有數千個均勻間隔的DNA克隆片段或寡核苷酸的DNA微陣列（一式三份點樣到陣列上）。雜交後，用數字成像系統捕獲和量化每種雜交螢光團的相對螢光強度。得到的螢光強度比與測試和參照基因組中DNA序列的拷貝數比成比例。如果螢光染色體的強度在一個探針上相等，則認為患者基因組的該區域在測試和參照樣品中具有等量的DNA；如果Cy3：Cy5比例發生改變，則表明該區域有丟失或獲得。

### 陣列CGH的技術方法

陣列CGH是通過各種技術實現的，因此它的優缺點取決於所選擇的技術。最初的方法是插入大片段的克隆DNA（例如BACs）產生陣列。BACs的使用提供了足夠強烈的信號來檢測單拷貝變化並準確定位畸變邊界。然而分離的BACs克隆的初期DNA產量低，必需DNA擴增技術。這些技術包括連接介導的聚合酶鏈反應（PCR），使用一組或幾組引物的簡併引物PCR，以及滾環擴增。也可以使用cDNA構建陣列，這些陣列具有高空間解析度，但cDNA的數量受到染色體上編碼基因的限制，並且由於交叉雜交它們的靈敏度很低。這導致無法在全基因組範圍檢測單拷貝變化。最新的方法是用短寡核苷酸點樣陣列。寡核苷酸的數量幾乎是無限的，並且處理快速、經濟有效和簡單。儘管寡核苷酸不具有檢測單拷貝變化的靈敏度，但是在染色體上彼此相鄰的寡核苷酸的比率的平均值可以補償降低的靈敏度。也可以使用具有重疊探針的陣列，以便揭示特定的斷點。

### 設計方法

CGH應用的微陣列設計有兩種：全基因組和靶向。

全基因組陣列設計覆蓋整個人類基因組，通常包括在整個基因組中廣泛覆蓋的克隆，以及在基因組範圍內具有連續覆蓋的陣列。全基因組陣列主要用於研究，在發現基因方面有突出價值。它們以空前的解析度篩選基因組的DNA獲得和丟失，這也非常有價值。

針對基因組的特定區域設計靶向陣列，以評估該靶向區段。它可以研究特定染色體或染色體片段，或鑑定和評估具有疑似微缺失症候群或亞端粒重排的個體的特定DNA劑量異常。靶向微陣列在醫療實踐中的關鍵目標是為不平衡的細胞遺傳學異常的診斷、遺傳諮詢、預後和臨床管理提供臨床上有用的結果。

## 應用

### 傳統

傳統CGH主要用於鑑定腫瘤中反覆丟失或獲得的染色體區域，以及癌症的診斷和預後。該方法還可用於研究胎兒和新生兒基因組中的染色體畸變。此外，傳統CGH可用於檢測染色體異常，並已被證明可有效診斷與人類遺傳疾病相關的複雜異常。

### 在癌症研究中

來自同一類型腫瘤的幾項研究的CGH數據顯示出一致的非隨機遺傳畸變模式。這些變化中的一些似乎對於各種惡性腫瘤是常見的，而其他變化則更具腫瘤特異性。例如，染色體區域lq、3q和8q的獲得，以及8p、13q、16q和17p的丟失，對於許多類型的腫瘤是常見的，比如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、腎癌和膀胱癌（圖2）；其他改變，如睪丸癌的12p和Xp獲得，膀胱癌的13q獲得和9q丟失，腎癌的14q丟失以及卵巢癌的Xp丟失，它們更具特異性，這可能反映了不同器官癌症發展過程中獨特的選擇。陣列CGH也經常用於B細胞惡性腫瘤的研究和診斷，如慢性淋巴細胞白血病。

### 染色體畸變

貓叫症候群（CdC）是由5號染色體短臂的部分缺失引起的症候群。一些研究表明，傳統CGH適用於檢測缺失以及更複雜的染色體改變。例如，Levy等人在2002年報導了一個像貓一樣哭泣（這是CdC的特點）的嬰兒，但其核型模糊。CGH分析揭示染色體的5p15.3區段丟失，證實了臨床診斷。這些結果表明，傳統CGH是檢測結構畸變的可靠技術，在特定情況下可以更有效地診斷複雜的異常。

### 陣列CGH

陣列CGH主要用於檢測癌症中的基因組異常，不過它也適用於分析導致人類遺傳疾病的DNA拷貝數異常。亦即陣列CGH用於揭示缺失、擴增、斷點和倍性異常。早期診斷對患者有益，因為他們可能會接受合適的治療和諮詢以改善他們的預後。

#### 癌症的基因組異常

遺傳改變和重排在癌症中經常發生並且促進其發生。通過陣列CGH檢測這些畸變，提供了關於重要癌症基因位點的資訊，在診斷、癌症分類和預後中具有臨床價值，然而並非所有遺傳物質的丟失都是致病的，因為一些DNA在免疫球蛋白亞基的重排過程中會有生理性的丟失。在最近的一項研究中，使用陣列CGH識別數個乳腺癌小鼠模型中的染色體畸變（拷貝數變異）區域，從而在myc誘導的腫瘤發生過程中鑑定出合作基因。

陣列CGH不僅可以發現癌症的染色體異常，還可以監測腫瘤的發展。一旦通過陣列CGH識別出異常，可以採用FISH區分轉移性和輕度病變。

#### 亞微觀畸變

Prader-Willi症候群（PWS）是一種涉及15q11-13的父繫結構異常，而同一區域的母系畸變導致Angelman症候群（AS）。在這兩種症候群中，大多數病例（75%）是PWS/AS關鍵區域3-5Mb缺失的結果。細胞遺傳學或傳統CGH無法檢測到這些小的畸變，但陣列CGH可以輕鬆檢測到。為了證明其原理，Vissers等人在2003年製造了具有1Mb解析度的全基因組範圍陣列，以篩查三名具有已知微缺失症候群（經FISH驗證）的患者，其中一名患有PWS。在三名患者中容易發現1.5-2.9Mb的異常。由此證明陣列CGH是檢測亞微觀畸變的特效且敏感的方法。

當使用重疊微陣列時，還可以揭示染色體畸變中的斷點。

#### 產前基因診斷

雖然陣列CGH尚未被廣泛用作胚胎植入前的遺傳篩查，但是它的概念正越來越普及。它可以檢測卵子、精子或胚胎中的CNV和非整倍性，這些可能導致胚胎植入失敗、流產或唐氏綜合症（21三體症候群）等疾病。這使得陣列CGH成為一種有前途的工具，可以降低終身惡性疾病的發病率和提高體外受精的成功率。該技術涉及單細胞的全基因組擴增（用於陣列CGH）。它也可以用於攜帶染色體易位的夫婦，例如平衡的互易易位或羅伯遜易位，它們有可能在其後代中引起染色體失衡。

## CGH和陣列CGH的局限性

傳統CGH的主要缺點是不能檢測沒有拷貝數變化的結構染色體畸變，例如鑲嵌體、平衡染色體易位和倒位。CGH也只能檢測倍性水平的獲得和丟失。另外，具有短重複序列的染色體區域在個體之間變化很大，並且可能干擾CGH分析。因此，像著絲粒和端粒這樣的重複DNA區域需要用未標記的重複DNA（例如Cot1-DNA）阻斷或從篩選中省略。此外，傳統CGH的解析度是限制其臨床應用的主要問題。儘管CGH已被證明是癌症和人類遺傳疾病研究和診斷中有用且可靠的技術，但這些應用僅涉及嚴重異常。由於中期染色體的解析度有限，使用傳統CGH無法檢測到小於5-10 Mb的畸變。檢測這種異常需要高解析度技術。陣列CGH突破了許多限制，它的特點在於高解析度，這是相比傳統CGH的主要優點。它的標準解析度在1-5Mb之間，通過補充額外的克隆可以將其提高到40kb左右。然而與傳統的CGH一樣，陣列CGH的主要缺點是無法檢測到不引起拷貝數變化的畸變，並且其檢測鑲嵌現象的能力有限。能檢測到的鑲嵌現象程度取決於克隆的靈敏度和空間解析度。目前的檢測極限是大約50%的細胞中的重排。為了檢測這種異常，還必須採用其他技術，如SKY（光譜核型分析）或FISH。

## 外部連結

- Virtual Grand Rounds: "Differentiating Microarray Technologies and Related Clinical Implications" by Arthur Beaudet, MD
- Progenetix database: A large, continuously updated collection of CGH and aCGH and associated clinical data (ca. 32'000 cases, September 2014).
- CGH article tracker: An attempt to list all (a)CGH publications containing original case data (2538 as of September 2014). This is part of the Progenetix project.
- arrayMap repository: Continuously expanded collection cancer genome array datasets, with per-array and aggregated data visualisation (ca. 64'000 arrays, September 2014).
- NCBI's Cancer Chromosomes : Cancer Chromosome is an integral part of NCBI's Entrez system, which combines several databases with (molecular-) cytogenetic data.
- CGH Microarray