無脊椎連接蛋白

在多細胞生物中，相鄰細胞膜上的半通道對接形成的縫隙連接，是細胞之間的連接方式之一，屬於膜通道結構，參與介導相鄰細胞間的信號傳遞。

- 在脊椎動物中，構成半通道的是連接子蛋白（或稱「間隙連接蛋白」；$Cx$）和泛連接蛋白（$Px$）。
- 在無脊椎動物中，形成半通道的間隙連接蛋白被命名為無脊椎連接蛋白（系$Px$的同源物；$Inx$）。

$Inx$蛋白普遍存在於真後生動物（除棘皮動物外）。

## 發現

$Ogre$蛋白是最初被研究的$Inx$蛋白家族，包括$Shanking B$、$unc$、$eat$蛋白也是屬於$Inx$蛋白家族，不過，直到20世紀90年代末，才確定無脊椎動物究竟是通過哪些蛋白質以達此效用的，而且沒有對其結構域進行統一分析，所以蛋白名稱存在多樣化。

之後，愈多的類似基因在無脊椎動物中被克隆得到。隨著研究的深入和生物資訊學的發展，發現此類蛋白與脊椎動物的$Cx$蛋白相比，兩者有著相似的跨膜結構和類似的功能，被認為是無脊椎動物特有的縫隙連接蛋白，因此被稱為「無脊椎連接蛋白」，意即無脊椎動物中$Cx$的類似物。從此，$Inx$蛋白成為了構成縫隙連接的另一類通道蛋白。

生物資訊學的分析表明，昆蟲的無脊椎連接蛋白在第二個跨膜區域前端具有特徵序列$YYQWV$，並且是完全保守的。越來越多的研究表明，$Inx$蛋白具有多重功能，除了傳統上的參與構建縫隙連接介導相鄰分子的信號傳導外，其本身的功能研究也越來越受到重視。

## 結構

目前大約有21種$Cx$基因、3種$Px$基因和25種$Inx$基因被克隆出來。這三類蛋白形成的半通道有著高度相似的拓撲異構結構：

- 一個半通道由六個跨膜蛋白組成，一個蛋白由四個跨膜結構域、兩個胞外袢（extracellular loop，$EL$）、一個胞內袢（intracellular loop）以及一個羧基端和一個氨基端構成。
- 而$Cx$蛋白（除$Cx 23$外）的$EL$有6個保守的半胱氨酸殘基，$Inx$蛋白的$EL$有4個保守的半胱氨酸殘基。

這些相似的結構提示它們在形成縫隙連接的過程中有類似的連接方式。研究顯示，$Cx$組成的半通道不僅僅是作為縫隙連接的亞單位，該蛋白還具有酶和轉運體的雙重功能，能獨立於縫隙連接存在於胞膜上形成半通道，作為胞內與胞外小分子的通路，參與細胞的信號轉導和維持細胞正常生理狀態。

## 功能

### 表達分布

對於$Inx$蛋白的功能研究在果蠅的胚胎發育與形態發生上較為集中，其次是在線蟲、家蠶、蝗蟲等物種上。

在果蠅中，Bohrmann和Zimmermann的研究顯示，在果蠅卵子的發育過程中，$Inx 1$主要分布於卵泡細胞的底部兩側，$Inx 2$定位於頂部兩側，$Inx 3$在卵泡細胞和滋養細胞的兩側有觀察到，$Inx 4$在5期的卵膜細胞和12期的滋養細胞膜上有檢測到，而且$Inx 2$和$Inx 4$、$Inx 2$於$Inx 4$之間的表達分布還存在協同作用。Tazuke發現，果蠅早期正在分化的生殖細胞的存活需要$\mathit{Inx}4$基因的表達；Bauer的研究發現$\mathit{Inx}2$對胚胎上皮組織的形態發生是必須的；而$\mathit{ogre\ and\ shakingB}$對果蠅目視系統的正常形成（Phelan，2005）、$\mathit{shakB}$對感覺神經元和突觸之間的電傳導的作用（Trimarchi、Murphey，1997）、$\mathit{Inx}2$控制果蠅胚胎前腸的發育（Bauer，2002）等方面都發揮著重要作用。

在線蟲中，目前已經有25個$\mathit{Inx}$基因被克隆得到（Phelan、Starich，2001；Scemes，2009），當這些基因發生突變時，會影響到線蟲的發育或某些組織器官的功能。如研究（Chuang，2007）發現$\mathit{nsy} - 5$在線蟲胚胎神經系統發育和神經系統左右極的不對稱分化的過程中有大量的表達。Starich認為（Starich，1996；Phelan、Starich，2001）$\mathit{unc} - 7$和$\mathit{unc} - 9$同時突變會導致線蟲運動缺陷，並改變線蟲對麻醉劑的敏感性和對驅蟲劑雙氫除蟲菌素的耐藥性；$\mathit{eat} - 5$和$\mathit{Inx}6$在線蟲咽部表達，對肌肉的同步收縮是必不可少的（Starich，1996；Li，2003）；而線蟲的胚胎發生需要$\mathit{Inx}3$基因的表達（Starich，2003）。

Ganfornina發現$Inx 1$蛋白主要對蝗蟲的胚胎神經系統，特別是神經的前期發育方面起著重要作用。

研究報告（Hong，2008）表明，家蠶中的$\mathit{Inx}2$基因在胚胎發育的整個過程都起作用，特別是在神經系統中有高表達；而$Inx 4$蛋白主要在家蠶幼蟲和蛹期階段的睪丸和卵巢組織中含量豐富，提示$\mathit{Inx}4$基因對家蠶生殖系統的發育有重要作用。

### 其間的相互作用

通道蛋白在形成通道的過程中或形成通道以後，更多的是受到其它信號分子或蛋白酶的調控。

但近來有研究表明，$Inx$蛋白之間還存在相互作用，而且這種相互作用對一些組織的發育或信號的傳遞起著重要的作用。Chen在研究縫隙連接對線蟲發育和神經系統功能的調控作用過程中發現，$unc - 1$可能調節$unc - 9$的功能或分布，$unc - 9$蛋白在膜上可以形成同聚體半通道，相鄰的兩個細胞進而形成縫隙連接，而$unc - 9$通道的開關卻受到$unc - 1$蛋白調控：

- 當$unc - 1$蛋白存在時，可以跟$unc - 9$亞體結合，此時通道打開。
- 當$unc - 1$不存在時，通道關閉。

但當$unc - 9$與$GFP$以融合蛋白的形式表達時，形成的通道將一直保持開放狀態(組成型開放通道)，這可能是由於GFP蛋白的存在對$unc - 9$亞體之間的結合產生了位阻現象，起到了$unc - 1$蛋白的類似作用。Lehmann的研究表明，$Inx 2$蛋白和$Inx 3$蛋白在膜上的分布和定位是相互影響的，這一點也得到了Bohrmann和Zimmermann兩人的證實。當沉默$\mathit{Inx}2$基因的表達時，$Inx 3$蛋白會在細胞中積累並分布紊亂，反之亦然。

$\mathit{Inx}2$和$\mathit{Inx}3$基因協同表達後通過細胞內$C$端功能域相互作用形成異聚化的$Inx 2$——$Inx 3$通道，這對果蠅胚胎的上皮組織發育和胚胎表皮極性的形成起著關鍵作用。如果$\mathit{Inx}2$或$\mathit{Inx}3$發生突變，會導致表皮上有大的皮孔形成，極端情況下甚至導致外皮的缺失。該研究組通過配體系統進化技術（SELEX）篩選出$anti - inx 2$的適配體，該適配體可以抑制$Inx 2$和$Inx 3$在$C$端功能域的相互作用，進一步證實了$Inx 2$和$Inx 3$之間相互作用的機制（Knieps，2007）。

### $Inx$半通道

#### 介導信號分子的釋放

$Inx$半通道具有雙重功能，除了兩個相鄰的半通道對接形成縫隙連接外，其本身也可以形成功能性的$non-junctional$膜通道，這些膜通道可以介導釋放各種小分子物質（Bao，2007）。腺三磷是細胞內最重要的能量分子，也是參與細胞間資訊傳遞的重要信號分子，在外界環境或內環境發生變化的情況下如低氧、離子濃度改變、pH等因素的刺激下細胞釋放腺三磷增加。既往研究提示$Cx$或$Px$蛋白組成的縫隙連接可能參與腺三磷的釋放（Bao，2004；Vessey，2005；Thompson，2006；Iglesias，2009）。Bao的研究顯示在爪蟾卵母細胞中表達$Inx$蛋白形成的半通道傳導功能類似於$Px$-半通道，而與$Cx$-半通道有所不同。$\mathit{Inx}2$、$\mathit{Inx}3$或$\mathit{Inx}6$表達後，可以記錄到約500pS的通道電流（$Px 1$在爪蟾卵母細胞中表達記錄到的通道電流為550pS或475pS）。當細胞發生高鉀去極化時通道開放，腺三磷釋放增加；而pH下降如暴露在二氧化碳時則起到抑制作用。與$Px$-半通道一樣，腺三磷的釋放也都能被縫隙連接通道阻斷劑生胃酮阻斷，提示腺三磷的釋放可能由$Inx$-半通道介導。Luo和Turnbull利用螢光染料吸收的方法首次在昆蟲細胞中證實了存在有功能性的$Inx$-半通道，結果顯示不同的條件下通道的活性會發生改變（Luo、Turnbull，2011），與Bao在螞蟥中的研究結果一致（Bao，2007）。研究發現，來自革蘭氏陰性菌的脂多糖（$LPS$）會抑制昆蟲細胞$Inx$-半通道的活性，而這種物質對哺乳動物白細胞$Cx$-半通道的活性有著複雜的影響（De Maio，2000；Oviedo-Orta，2000；Temme，2000）。這提示$Inx$-半通道介導的信號分子釋放可能參與了免疫反應的信號傳導，這在Samuels的研究中得到了進一步的證實，結果顯示在螞蟥神經系統中通過$Inx$通道釋放的腺三磷控制著小膠質細胞向神經受損處的遷移。

鈣波也是細胞通訊的一個重要方式，參與多種生理活動過程。$Px$通道參與鈣波的傳遞得到了越來越多研究結果的證實（Thompson，2006；Vanden，2006；Peters，2007）。$Px$通道不但存在於細胞膜上，也可能存在於內質網膜上（細胞內通道），在受到缺血等刺激的情況下，不但釋放腺三磷，還可能釋放鈣離子和一氧化氮等信號分子。與$Px$蛋白類似，同源的$Inx$通道也極可能參與了鈣波和其他信號分子的傳遞。Bouhours的研究提示，作為$Inx$蛋白家族成員之一的$unc - 7$蛋白構成的細胞膜通道或細胞內通道在特定的生理條件下可能影響著細胞內腺三磷、鈣離子或其它離子濃度的變化，進而對其他的生理功能產生影響。

#### 細胞凋亡

Elliott發現腺三磷或尿三磷可以作為開始凋亡的細胞釋放的一種信號，以吸引巨噬細胞，但這個信號通過何種途徑釋放到細胞外，當時並不是很清楚。隨後，Chekeni通過生胃酮阻斷和核糖核酸干擾實驗結合膜片鉗技術，發現腺三磷或尿三磷是通過$Px 1$通道釋放的。當通過腺三磷或尿三磷信號途徑激活凋亡蛋白半胱天冬酶3（以下簡稱「$caspase 3$」）時，激活的$caspase 3$反過來作用$Px 1$蛋白的$C$端，使得$Px 1$通道組成型開放，最終導致細胞凋亡。作為$Px$蛋白的同源物，$Inx$蛋白在無脊椎動物細胞是否介導了細胞的凋亡，目前還未見報導。作為一類功能保守的蛋白，根據$Px 1$通道介導了細胞凋亡已獲得證實的報導，可以合理推測$Inx$半通道也參與了細胞凋亡的信號通路。Luo的研究表明，在家蠶細胞$Bm 12$中過量表達$\mathit{Inx}2$和$\mathit{Inx}3$基因，細胞出現聚集和粘附現象，這與昆蟲細胞在受到外源刺激或侵入時出現的集結和包囊作用相符合；在草地灘夜蛾$Sf 9$細胞中過量表達$\mathit{Inx}2$和$\mathit{Inx}3$基因，細胞表現出凋亡特徵（出現凋亡小體），而昆蟲免疫細胞正是通過集結和包囊後的細胞凋亡來清除外源病毒等侵入物（待證實）。所以，從這一點來看，$Inx$半通道也參與介導了細胞免疫反應。

#### 開放的調控

在正常的生理狀態下，細胞膜上的半通道大多處於關閉狀態，以保持細胞內容物和細胞體積的相對穩定。

- $Px 1$半通道。
- 一方面可以通過釋放腺三磷作用於相鄰細胞$P 2Y$受體產生第二信使三磷酸肌醇（以下簡稱「$IP 3$」），$IP 3$誘導內質網釋放鈣離子使細胞內鈣離子濃度增高。
- 另一方面，腺三磷也可以通過激活$P 2X 7$受體使細胞內鈣離子濃度增高，$P 2X 7$受體的激活或細胞內鈣離子濃度增高都可以誘導$Px 1$通道的開放（Locovei，2006；Pelegrin、Surprenant，2006；Locovei，2007）。
- $Cx$半通道在細胞外鈣離子濃度下降時通道開放增加，鈣離子濃度升高時通道開放減少（Li，1996；Zhang，2006；Verselis、Srinivas，2008），pH下降時減少通道開放（Trexler，1999）。
- $Inx$半通道
- 當升高細胞外液鈣離子濃度或鎂離子濃度時，$Inx$半通道的開放增加。
- 當$LPS$免疫刺激時，$Inx$半通道的開放減少（Bao，2007；Luo、Turnbull，2011）。

這些研究結果顯示半通道的開放與陽離子濃度特別是鈣離子濃度的變化相關，而鈣離子濃度的變化與鈣調蛋白的活性密切相關。當細胞內鈣離子濃度升高時可以激活鈣調蛋白，該蛋白再與通道蛋白相互作用調控通道的開關（Zhang，2006；Decrock，2011）。在線蟲細胞中，$Inx$半通道的開放和關閉還與$Inx$蛋白之間的相互作用有關，當$unc - 1$與$unc - 9$結合時，通道開放，分開時通道關閉。根據$Px 1$蛋白的研究結果（Chekeni，2010），我們也可以推測，$Inx$蛋白組成的半通道也可能是$caspase$蛋白酶的作用靶標，當其被激活的$caspase$剪切後，會造成$Inx$半通道的永久性開放。

## 基本資料

- 貨幣符號：Innexin
- 日語原文：Innexin
- Pfam：PF00876
- InterPro：IPR000990
- TCDB：1.A.25
- OPM family：194
- OPM protein：5h1r