螢光共振能量轉移

螢光共振能量轉移（Förster resonance energy transfer, fluorescence resonance energy transfer(FRET), resonance energy transfer (RET), electronic energy transfer (EET)），是描述兩個生色團之間能量轉移的一種機制。

激發態上的供體生色團，有可能通過偶極耦合將能量傳遞給受體生色團（兩者距離通常在1nm附近）。

福斯特能量共振轉移（FRET）類似於近場傳輸，即反應的作用距離遠小於激發光的波長。在近場區域，激發態的供體生色團發射虛擬光子，光子旋即被受體發色團吸收。該些光子是無法探測的，因為他們的存在違反了能量和動量守恆。因此福斯特能量共振轉移被認為是無輻射過程。從量子電動力學計算，我們可以確定無輻射和輻射能量轉移分別是統一場下的短程和長程近似。

## 術語

這一機理被稱為'福斯特共振能量轉移'，以德國科學家特奧多·福斯特命名。當兩發色團都為螢光體，則該機理也稱螢光共振能量轉移，儘管實際上能量並非通過螢光來完成轉移。由於這一現象基於非輻射的能量傳遞，為了避免名稱誤導，我們更傾向於採用福斯特能量共振轉移的命名方式，而非螢光共振能量轉移，雖然大量科學文獻偏愛後者。還應當注意，FRET不限於螢光。它也可以與磷光有關。

## 測量螢光共振能量轉移效率的方法

在螢光顯微技術、螢光共聚焦雷射掃描顯微技術以及分子生物學中，螢光共振能量轉移是用於量化在生物物理和生物化學中的分子動態的有效工具，如蛋白質互作、蛋白質-DNA互作、DNA-DNA互作以及蛋白質構象變化。為了監測兩個分子的複合物形成，其中一個分子會被標記上螢光供體，而另一個會被標記上螢光受體。螢光共振能量轉移效率被用於識別被標記複合物中的相互作用。下面展示幾種由檢測受體或供體螢光發射強度的變化來測量螢光共振能量轉移效率的方法。

敏化發射

測量螢光共振能量轉移效率的方法之一是測量受體螢光發射強度的變化。當供體與受體因分子間相互作用而處於鄰近位置（1–10 nm）時，由於供體向受體的螢光共振能量轉移，受體的發射會增強。當監測蛋白構象變化時，目標蛋白的兩個位置會分別被標記上供體與受體。當蛋白的扭轉或彎曲使供體與受體之間的距離或相對取向發生變化時，螢光共振能量轉移的變化就能被觀察到。如果某種分子相互作用或蛋白構象變化依賴於配體結合，那麼該螢光共振能量轉移技術也可用於配體檢測的螢光指示劑。

壽命測量

螢光共振能量轉移效率也可以由供體螢光壽命的變化測量。在受體存在的條件下，供體螢光的壽命會下降。螢光共振能量轉移供體的壽命測量在螢光壽命成像顯微鏡（FLIM）中被使用。

### 在細胞生物學中的定量應用與發展

螢光共振能量轉移（FRET）技術已從一種物理化學現象，發展成為生命科學，尤其是細胞信號轉導研究中不可或缺的核心定量工具。其獨特的距離依賴性和對分子相互作用的敏感性，使其能夠揭示傳統生化方法難以捕捉的、活細胞內動態、微弱且瞬時的生物過程。

#### 定量原理與關鍵參數

FRET的效率公式 $E = 1 / [1 + (R/R_0)^6]$ 是其作為「分子尺」的定量基礎。其中，$R_0$（福斯特半徑）是一個關鍵常數，通常為2-6納米。當供體與受體間距 $R = R_0$ 時，FRET效率為50%。該公式的「六次方反比」關係意味著效率對距離變化極端敏感。例如，當間距從$0.5R_0$增加到$1.5R_0$時，效率會從約98%急劇下降到約8%。這種敏感性使得FRET不僅能判斷「有無結合」，更能定量監測構象變化的幅度或相互作用強度的細微變化。

除了光譜重疊和距離，偶極子相對取向（用取向因子κ²表示）是影響FRET效率的第三大要素。理論上，κ²的取值範圍為0（垂直）到4（平行共線）。在生物體系中，螢光蛋白通常通過柔性連接子連接，其快速隨機旋轉使得κ²常被近似為2/3，這簡化了活細胞中的定量分析。然而，在研究結構剛性或取向固定的系統時，必須考慮取向因子的影響。

#### FRET生物傳感器與在信號轉導中的定量應用

FRET生物傳感器是將其應用於活細胞研究的橋梁。通過將信號分子敏感的感應域與FRET螢光蛋白對（如CFP/YFP、mCerulean/mVenus、或現代更優的mTurquoise2/sYFP2）進行基因編碼融合，可將不可見的生化活動轉化為可量化的螢光信號變化。

- 第二信使動態定量：例如，基於鈣調蛋白和M13肽的「Cameleon」系列傳感器，其FRET效率變化與細胞內鈣離子濃度（Ca²⁺）成比例，經過體外校準曲線換算，可直接報告胞內特定微域（如線粒體基質、核內）的鈣濃度（單位：nM）及其瞬態動力學（毫秒級）。類似地，針對cAMP、IP3、DAG、H₂O₂等的FRET傳感器，使得實時觀測這些第二信使的時空波動成為可能。
- 酶活性實時監測：以激酶活性傳感器為例，其設計通常包含：供體螢光蛋白、可被特定激酶磷酸化的底物肽序列、以及結合磷酸化底物的受體結構域（如FHA、WW域）與受體螢光蛋白。當激酶被激活並磷酸化底物肽後，會引起受體結構域的結合，從而拉近供受體，導致FRET效率升高。通過連續記錄FRET比率，可以以秒為單位定量描繪MAPK、PKA、PKC、Akt等關鍵信號通路在細胞遷移、分裂、凋亡等過程中的激活時空模式，甚至揭示細胞群體中的異質性響應。
- 蛋白質相互作用與構象變化的直接成像：通過將供體和受體螢光蛋白分別標記在兩個疑似互作的蛋白上，其FRET信號的產生直接證明了二者在活細胞內的物理接近與結合。同樣，將FRET對標記在同一蛋白的不同結構域，可以監測該蛋白在信號刺激下發生的構象變化，如G蛋白偶聯受體的激活、離子通道的開閉等。

#### 技術演進與新型檢測模態

為了克服傳統強度型FRET易受雷射功率、探針濃度、光漂白等因素干擾的缺點，一系列更穩健的檢測與成像模態得到發展：

- 螢光壽命成像FRET：FLIM-FRET通過測量供體螢光平均壽命的縮短來量化FRET效率。由於螢光壽命是分子的本徵物理屬性，不受探針濃度和激發光強影響，因此提供了更定量、更可靠的數據。
- 受體光漂白FRET：通過選擇性漂白受體，觀察供體螢光強度的恢復程度來計算FRET效率，方法直接但屬於終點法。
- 光譜掃描與解卷積：使用光譜成像檢測整個發射光譜，通過解卷積演算法精確分離供體和受體的貢獻，提高了定量精度。
- 新型螢光蛋白與生物發光共振能量轉移：開發具有更大斯托克斯位移、更高亮度和光穩定性的螢光蛋白對（如CyPet-YPet的優化變體）提高了信噪比。BRET利用生物發光蛋白（如Rluc）作為供體，無需外部激發光，徹底消除了自發螢光和光毒性的干擾，尤其適用於高通量藥物篩選和體內成像。

#### 前沿應用拓展

FRET的應用已遠超基礎研究，正向轉化醫學和精準醫療延伸。例如，基於FRET的HIV蛋白酶活性傳感器可用於高通量篩選抗愛滋病藥物；設計對特定腫瘤相關激酶異常激活敏感的FRET傳感器，可用於癌症的早期診斷或預後評估；在神經科學中，多色FRET技術正在嘗試同時解耦多個信號通路在同一神經元中的交叉對話。

總之，FRET已從一個描述能量轉移的物理概念，演變為一套強大、多維、定量的活細胞「生理學檢測工具箱」。它使我們能夠以分子的視角、動態的維度、定量的語言，直觀地「看見」並「解讀」細胞信號轉導這部複雜而精密的生命交響樂，持續推動著生命科學向更深處探索。

## 外部連結

- Browser-based calculator to find the critical distance and FRET efficiency with known spectral overlap
- FRET description
- Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Microscopy