即時聚合酶鏈式反應

即時聚合酶鏈式反應（Real-time polymerase chain reaction）是一種在DNA擴增反應中，以螢光染劑偵測每次聚合酶鏈鎖反應（PCR）循環後產物總量的方法。

此實驗法已被眾多科學家採用，因為其偵測範圍廣、靈敏度高、準確、專一及快速。PCR的發展因為偵測感染病患的病毒（不過RNA病毒須先反轉錄成DNA才進行PCR）或細菌量、癌症監測、診斷個別基因差異的用藥反應等應用而大幅提高。

PCR的方法是基於偵測目標物在反應前及PCR後產物的量化關係，越早探測到指定螢光值表示目標基因組越多。相對於終端PCR方式（end-point PCR，傳統的PCR配合凝膠電泳，在反應後偵測），qPCR（定量即時聚合酶鏈式反應）有許多優點。其結果可以較快取得且穩定，因為是採用非常敏感的化學螢光，而且不需要再繼續處理PCR反應後的偵測，花費時間與精神的工作步驟便可以省下。此外，因為反應後不需打開管子而減少了操作污染。qPCR分析亦適於更具挑戰性的應用，如多重偵測與高通量分析。

## 背景

所有生命體內的細胞都通過基因轉錄本（單鏈RNA）的表達量來調節基因表達：一個基因在細胞中的表達量可以通過樣品中RNA轉錄本的量來衡量。為了通過少量的RNA穩定地檢測和量化基因表達，大量擴增基因轉錄本是必需的。聚合酶鏈式反應（PCR）就是一種常用的擴增DNA的方式；而對於基於RNA的PCR，第一步是通過逆轉錄酶將RNA樣本逆轉錄為互補DNA（cDNA）。

為了擴增少量的DNA，我們也會在常規的PCR中使用相同的方法，即使用一個DNA模板，至少一對特定的引物，dNTPs，合適的緩衝液以及熱穩定的DNA聚合酶。在熱循環儀中向上述混合物中添加被熒光基團標記的物質，熱循環儀中的傳感器會測量熒光基團發出的熒光。通過這一手段我們可以在每一輪PCR中測量擴增出來的產物的量。我們可以在電腦上分析得到的這些數據以便計算不同樣本中相關的基因表達量（或者說是mRNA的拷貝量）。定量化的PCR也可以用來檢測和量化樣品中的DNA的量來檢測這些樣品中某一特定DNA序列是否存在以及數量是多少。我們可以在每一輪擴增週期後進行這些測量，這也是為什麼這種方法叫做即時聚合酶鏈式反應。

定量PCR和DNA微陣列都是現代用於研究基因表達的技術。過去有一些技術是用於測量mRNA的豐度的，比如mRNA差別顯示技術（differential display）、核酸酶保護分析（nuclease protection assay）以及RNA印跡法（Northern blot）。RNA印跡法經常被用於通過可視化樣品中基因對應的mRNA的豐度來估計基因表達水平，在這一技術中，我們使用瓊脂糖凝膠電泳來分離純的RNA，再轉移到固體基質中（比如尼龍膜），而後使用與其互補的DNA或者RNA探針來檢測。雖然這種技術至仍在用於估計基因表達量，但是它需要相對較多的RNA而且只能提供有關mRNA水平的定性的或者半定量的資訊。由定量方法引起的估計誤差可能與DNA的完整性、酶的效率等等因素相關。鑒於這一原因，眾多規範化系統（或者通常被稱為規範化方法）逐漸發展了起來。有一些是用於定量化總的基因表達量的，但是最常見的是將我們想要研究的特定的基因與另外一種被稱為標準化基因的基因相比較來定量化我們想要研究的基因。這種標準化基因在細胞中的表達量通常是一個定值，通常是從作用與細胞的生存等基礎生命活動相關的管家基因中挑選出來的。這樣做的好處是可以將我們的目標基因表達量和挑選出來的標準化基因表達量做比得到一個比值，從而使我們無需知道目標基因的絕對表達量就可以進行比較。

標準化基因通常編碼以下分子：微管蛋白（tubulin）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、白蛋白（albumin）、親環素（cyclophilin）以及rRNA。

## 染劑

使用於PCR偵測的化學物基本可分為兩類：非專一性化學物，通常是與DNA結合的螢光染劑；目標專一性化學物，是使用螢光探針或引子。

- 目標專一性偵測：、LightUp、 (Fluorescence Resonance Energy Transfer)
- TaqMan probe 是選取PCR上下游引物之間的一段序列作為探針，並在探針的5`-端标记上荧光基团，3`-端標記上相應的淬滅基團(由於兩個基團靠得很近，構成螢光能量傳遞的關係，沒有螢光信號產生，在每一個循環的退火過程中，該探針可以與模板相結合，隨後的延伸反應中，當引物合成至探針與模板結合處時，Taq酶的5`-外切酶活性可以降解探针的5`-端，並因此使螢光基團與淬滅基團分離，釋放螢光，理論上每合成一次新鏈就有一次螢光信號釋放)。
- Molecular Beacon 是探針片段在游離狀態下呈莖環(stem-loop)結構，其中莖的部分一般是5至7個高GC含量的核苷酸，環的部分是15至30個可以與PCR模板互補的核苷酸序列，而且探針的5`-端和3`-端分別標記有螢光報告基團和淬滅基團(由於這兩個基團處於莖的結構中，靠得很近，沒有螢光信號產生，在PCR每一個循環的變性過程中，處於莖環結構的探針被打開，並在黏合過程中與模板結合，使螢光基團遠離淬滅基團並釋放螢光信號，因而螢光強度與被擴增的模板量成正比)。

## 儀器

- 光源：氙氣燈、雷射、發光二極體（LED）
- 濾鏡
- 偵測方式：光電倍增管（photomultiplier tube, PMT）、光電耦合元件（charge-coupled device, CCD）、光電二極體（photodiodes）
- 控溫方式：熱電效應元件（peltier elements）、旋轉式氣流升降溫、微流體式
- 容器：聚丙烯（PP）容器、玻璃毛細管

## 數據分析

- 門檻循環（MIQE中定義為Cq值(quantification cycle)；過去通稱為Ct, Threshold cycle，Ct值，又稱閾值循環數）
- 解離曲線分析（melting curve）
- 高解析度解離分析（High Resolution Melt, HRM）
- FRET分析

## 應用

PCR的一些應用包括：

1.基因表現分析：例如結核分岔桿菌（Mycobacterium tuberculosis）是一種生長相當緩慢的細菌，傳統培養及鑑定一般需要花數週時間，但2015年時Watanabe Pinhata和Cergole-Novella以自己發展的real time PCR檢測mpt64，直接檢測病人痰液中的結核分岔桿菌，分析715個檢體657個病人，其檢測靈敏度（sensitivity）及特異性（specificity）分別為90.3%及98.6%，而傳統培養方法的靈敏度及特異性分別為90.3%及99.7%。整個實驗流程可以在5個小時內完成，此方法可以用於沒有套裝試劑（kit）可以使用的實驗室。

2.檢驗生物晶片的結果。

3.siRNA與miRNA診斷。

4.基因型鑑定

5.飲食分析

6.獸醫微生物檢測

## 實驗比較

### qPCR的特點

- 螢光實時定量PCR的基本原理有兩個要點：首先是對PCR反應中的每一個循環的反應產物進行實時檢測並記錄下來；其次，用於檢測PCR產物實時檢測的螢光染料標記在一段可以與單鏈PCR產物(模板)特異性雜交的探針上，並且處於淬滅狀態，只有當探針與模板特異性結合以後才有可能釋放出螢光信號。
- 每一輪循環中PCR的產出量都以螢光信號的形式被PCR儀的光學檢測系統記錄下來，在某一循環中螢光信號的強度達到預先設定的閾值時，此時的循環數稱為CT(Threshold Cycle)，Ct值與起始的模板量成反比，起始的核酸量越多，達到閾值的循環數就越少，換句話說CT值會越小。如果要確定量的話，需要做出標準曲線，以Ct值為縱坐標，起始模板數為橫坐標作圖。在新的 MIQE規範中Ct這個慣用的名詞被重新定義為Cq值(quantification cycle)。

### 和PCR比較

- 常規PCR的產物在理論上呈指數級增長，而在實際反應中，由於反應物濃度、酶活性等條件的變化，在循環數不斷增加時，反應進入平台期，PCR產物不再呈指數級增長。螢光實時定量PCR的優點在於它避免了常規PCR的平台效應對起始模板量和最終產物量之間相關性的干擾。
- 專一性探針的優點是只有正確的擴增產物才能和用於定量的探針結合併產生螢光信號，這樣就避免了假陽性污染，對於臨床診斷等工作特別有效。但相對來說，合成螢光探針的價格較於昂貴，不利於小規模的實驗檢測；因此在研究型實驗室還是以SYBR Green的非專一型qPCR為主要選擇。

### 普及性

- 因為價格、耗材較貴的因素，qPCR多了光學配件及螢光物質的費用，在普及度上qPCR的機器較PCR機台少。

## 外部連結

- The Reference in qPCR - Academic & Industrial Information Platform
- MIQE: The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments
- RDML: Real-time PCR Data Markup Language
- 實時定量PCR中參照基因的選擇