双单倍体

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双单倍体（doubled haploid，简称DH）是单倍体细胞经过染色体加倍后所形成的基因型。在植物育种中，人工培育双单倍体具有重要意义。

单倍体细胞源于花粉、卵细胞或配子体的其他细胞，再经人工诱导或自然发生的染色体加倍，形成双单倍体细胞，该细胞可进一步发育为双单倍体植株。若原始植物为二倍体，则其单倍体细胞为一倍体，此类加倍后的个体可称为“双一倍体”。由四倍体或六倍体衍生而来的单倍体生物有时称为“二单倍体”（其加倍后的个体则分别成为四倍体或六倍体）。

传统近交繁殖方法需要六代才能达到近乎完全纯合，而双单倍体技术仅需一代即可实现。由四倍体作物衍生出的二单倍体植株，对于涉及作物二倍体野生近缘种的育种项目可能具有重要意义。

## 历史

关于单倍体植物的首次报道由Blakeslee等人于1922年发表，研究对象为曼陀罗。此后，在多种其他植物中也相继报道了单倍体。Guha和Maheshwari于1964年创立了花药培养技术，可在实验室条件下诱导产生单倍体。通过远缘杂交获得单倍体的方法在大麦（Kasha与Kao, 1970）和烟草（Burk等, 1979）中均有报道。烟草、油菜和大麦是双单倍体生产中反应最为敏感的物种。目前，双单倍体技术已应用于超过250个物种。

## 双单倍体的生产

双单倍体可通过体内或体外方法获得。体内产生单倍体胚胎的途径包括孤雌生殖、假受精或远缘杂交后的染色体消除。将单倍体胚胎进行胚拯救、培养，再经染色体加倍，即可得到双单倍体。体外方法包括雌核发育（子房和花培养）以及雄核发育（花药和小孢子培养），其中雄核发育是更常用的方法。另一种产生单倍体的技术是远缘杂交。在大麦中，通过与近缘种球茎大麦杂交可产生单倍体：受精虽能完成，但在种子发育早期，球茎大麦的染色体会被消除，从而留下单倍体胚。在烟草中，与非洲烟草的远缘杂交应用广泛。用非洲烟草授粉于普通烟草时，后代中有0.25%至1.42%的植株能够存活，并可明显区分为F1品种或母本来源的单倍体。尽管这些比例看似较低，但由于烟草种子产量极大且多数幼苗早期死亡，在相对较小的土培容器中仍可获得可观数量的可育杂种和单倍体。这种种间授粉方法为生产烟草的源于种子的单倍体提供了一条实用途径，可作为花药培养的替代或补充方法。

近年来，双单倍体技术已与CRISPR/Cas9基因编辑技术相结合，形成了一种称为“单倍体诱导介导的基因组编辑”（haploid inducer-mediated genome editing，简称HI-Edit）的方法。在该方法中，负责诱导单倍体的亲本携带Cas9蛋白及靶向另一亲本某个基因的引导RNA。受精后不久，在诱导亲本的染色体被消除之前，编辑即可发生，从而产生可能携带目标突变但不继承CRISPR/Cas9转基因的单倍体后代。在小麦中，这一策略已通过将小麦与表达Cas9及引导RNA的转基因玉米进行杂交而得到验证。一项2023年的研究针对小麦感病基因TaHRC和Tsn1进行编辑，成功获得的编辑单倍体小麦植株频率为15%至33%。这些经过编辑的单倍体可再经染色体加倍，从而产生纯合的双单倍体株系，用于功能基因组学或植物育种研究。

## DH群体的遗传学

在双单倍体方法中，对于一对等位基因A和a，仅产生两种基因型：AA和aa，其频率各为1/2；而在二倍体方法中，则产生三种基因型：AA、Aa、aa，频率分别为1/4、1/2、1/4。因此，若AA为目标基因型，单倍体方法获得该基因型的概率高于二倍体方法。若涉及n个分离的基因座，则单倍体方法获得目标基因型的概率为$(1/2)^n$，二倍体方法为$(1/4)^n$。由此可见，当相关基因数量较大时，单倍体方法的效率更高。

研究表明，比较双单倍体法与其它常规育种方法后得出结论：采用双单倍体育种不会导致群体中基因型出现任何偏倚，随机DH系甚至与常规系谱法选育的品系表现相当。

## DH法在植物育种中的应用

### 数量性状基因座定位

大多数经济性状由效应微小但具有累加作用的基因控制。尽管人们早已认识到DH群体在定量遗传学中的潜力，但直到分子标记图谱的出现，才推动其用于控制数量性状的基因座的鉴定。由于数量性状基因座（QTL）效应较小，且受环境因素影响较大，因此需要借助重复试验进行精确的表型鉴定。双单倍体生物因其具有纯合遗传的特性，且能够方便地大量生产，从而满足了这一要求。利用DH群体，已在9种作物中定位了130个数量性状。总共有56个DH群体用于QTL检测。

### 回交育种

在回交转育过程中，目标基因通过反复回交从供体品种或相关物种渐渗到受体优良品系中。该流程的一个难题在于如何从每一代中筛选出携带目标性状的株系。若目标性状为隐性性状，则问题尤为突出，因为每次回交后该性状仅以杂合状态存在。分子标记技术的发展提供了一种基于基因型（标记）而非表型的更简便选择方法。若与双单倍体技术相结合，其效率将进一步提高。在分子标记辅助的回交转育中，将受体亲本与供体系杂交，再将杂种（F1）与受体亲本回交，所得后代（BC1）继续回交，如此重复直至获得目标基因型。双单倍体技术与分子标记的结合则提供了一条捷径：在BC1代即可筛选出具有目标性状的基因型，并将其转化为纯合的双单倍体基因型。Chen等人（1994）利用分子标记辅助回交转育结合BC1代双单倍体技术，在大麦中成功选育出了抗条锈病株系。

### 集群分离分析

在集群分离分析（BSA）中，首先针对目标性状对群体进行筛选，然后分别选取性状极端的两端个体构建两个混合池。随后，检测这两个混合池中分子标记的存在与否。由于两个混合池在贡献正向和负向效应的等位基因上应存在差异，因此两池之间的任何标记多态性都表明该标记与目标性状之间存在连锁关系。BSA依赖于准确的表型鉴定，而DH群体因其纯合遗传、可重复检测的特点而具有独特优势。在分子标记辅助育种中，DH群体常用于集群分离分析法，该方法已在油菜和大麦中得到了广泛应用。

### 遗传图谱

遗传图谱对于理解基因组的结构与组织至关重要，据此可以推断物种间的演化模式和共线性关系。遗传图谱还为定位目标基因、估算其效应大小提供框架，并有助于我们理解基因型与表型之间的关联。在易于获得DH群体的物种中，DH群体已成为遗传作图的标准化资源。双单倍体群体是遗传作图的理想材料。无论物种如何，从最初的杂交开始，通常在两年内即可构建出遗传图谱。由于来源于两个纯合亲本杂交后代的DH群体预期分离比为简单的1:1，因此图谱构建相对容易。目前，DH群体已被用于构建大麦、油菜、水稻、小麦和辣椒等作物的遗传图谱。在推动八种作物分子标记图谱的绘制过程中，DH群体发挥了重要作用。

### 遗传研究

遗传比率和突变率可直接从单倍体群体中读取。一项研究利用小规模的双单倍体群体证明，大麦中的一个矮化基因位于5H染色体上。另一项研究则分析了大麦中一系列标记的分离情况。

### 基因组学

尽管QTL分析已在基因位置及其对许多性状的效应大小方面积累了海量信息，但相关基因的鉴定仍然困难重重，这主要是由于QTL分析的分辨率较低。解决这一问题的途径是构建重组染色体替换系或阶式排列重组自交系。具体方法是通过持续回交直至达到所需的重组水平，并利用分子标记在目标区域筛选目标重组染色体替换系，再通过双单倍体技术使其基因型固定。在水稻中，利用DH群体构建的图谱已发现分子标记与抗稻瘟病、白叶枯病和纹枯病的主效基因及QTL紧密连锁。

### 精英杂交

传统育种方法周期长，培育一个品种需要10至15年。另一个缺点是，由于早期世代存在杂合性，选择效率较低。双单倍体技术可以克服这两大不足，从而在更短的时间内对更多优良杂交组合进行评价与筛选。

### 品种选育

一致性是大多数物种栽培品系的基本要求，而通过双单倍体技术可轻松实现。双单倍体在品种培育中有多种应用方式：DH系本身可作为品种直接推广，可作为亲本用于杂交种生产，或更间接地用于育种品系的创制及种质资源保存。大麦已有超过100个直接来源于DH的品种。据已发表资料，目前全球范围内12个物种中约有300个品种源自DH技术。

近年来，随着25个物种实验方案的建立，双单倍体在植物育种中的重要性显著提升。双单倍体技术已在蔬菜杂交品种培育中发挥重要作用，其在观赏植物育种中的潜力也正得到积极探索。此外，在药用植物缬草中，人们也正利用双单倍体技术筛选具有高药理活性的品系。另一个有趣的进展是，在具有自交不亲和性的物种中，已可培育出可育的纯合双单倍体系。

## DH法的优势

经过单轮重组即可产生纯合株系的能力为植物育种者节省了大量时间。研究表明，随机DH系与系谱法近交选育的株系表现相当。其他优势包括：可在更短时间内培育出大量纯合株系、进行高效遗传分析以及开发与有用性状相关的标记。更具体的益处体现在：在观赏植物中，种子繁殖可作为无性繁殖的替代方式；而在树木等生命周期长且存在近交衰退、传统育种方法难以开展的物种中，双单倍体技术提供了新的解决方案。

## DH法的缺点

DH群体的主要缺点在于无法对其施加选择压力。而在传统育种中，可以选择多个世代，从而对群体中的优良性状进行逐步改良。

在通过花药培养获得的单倍体中，观察到部分植株为非整倍体，另有一些则为单倍体与二倍体混合的嵌合类型。双单倍体技术的另一个缺点在于建立组织培养与生长设施所需的成本较高。此外，过度使用双单倍体技术可能减少育种种质中的遗传变异。因此，在育种计划中采用双单倍体技术之前，需要综合考虑多种因素。

## 结论

技术进步现已为大多数植物属提供了双单倍体实验方案。在短短几十年内，适用于双单倍体技术的物种数量已达到惊人的250种。随着越来越多的物种从顽拗型类别中逐步移除，其响应效率也在不断提高。因此，双单倍体技术将为植物育种带来更高的效率。

## 教程

- Doubled Haploids to Improve Winter Wheat
- 视频： Doubled Haploids: A simple method to improve efficiency of maize breeding.