空间转录组学

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空间转录组学（Spatial Transcriptomics）或称空间分辨转录组学（Spatially Resolved Transcriptomics），是一种在完整组织内捕获转录活性位置背景的方法。空间转录组学的历史前身是原位杂交（in situ hybridization），而现代的组学术语指的是测量细胞中所有的mRNA，而非选择特定的RNA靶标。它是空间生物学的重要组成部分。

空间转录组学包含的方法可分为两种模式：基于下一代测序的基因检测方法，以及基于成像的方法。解析转录本空间分布的一些常见方法包括显微切割技术、荧光原位杂交方法、原位测序、原位捕获方案和计算机模拟（in silico）方法。

## 历史

原位杂交技术在20世纪60年代末由约瑟夫·G·加尔和Mary-Lou Pardue开发，并在20世纪80年代随着单分子FISH（smFISH）的出现，以及2010年代随着RNAscope、seqFISH、MERFISH和osmFISH、seqFISH+以及DNA显微镜的出现取得了重大发展。显微切割技术最早于20世纪90年代末（激光捕获显微切割）开发，并于2013年在Michael Eisen实验室中使用果蝇胚胎与RNA-seq分析相结合。

空间基因组学作为一项技术（现在被称为空间转录组学），是由Michael Doyle（Eolas公司）、Maurice Pescitelli（伊利诺伊大学芝加哥分校）、Betsey Williams（哈佛大学）和George Michaels（乔治·梅森大学）在20世纪90年代发起的，作为可视胚胎项目（Visible Embryo Project）的一部分。Doyle及其共同研究人员描述了一种称为基因组活性空间分析（Spatial Analysis of Genomic Activity, SAGA）的方法。

这一空间索引概念在2016年被瑞典斯德哥尔摩的Jonas Frisén、Joakim Lundeberg、Patrik Ståhl及其同事进一步扩展。2019年，首批空间转录组学商业平台问世，包括NanoString Technologies推出的GeoMx数字空间轮廓分析仪（DSP）以及10x Genomics推出的Visium。同年，在博德研究所，Fei Chen和Evan Macosko的实验室开发了Slide-seq，该技术使用了附着在微珠上的条形码寡核苷酸。

## 应用

明确mRNA分子的空间分布有助于检测组织、肿瘤和免疫细胞中的细胞异质性，以及确定转录本在各种条件下的亚细胞分布。这些信息为破译组织和单个细胞内的细胞及亚细胞结构提供了独特的机会。这些方法在胚胎学、肿瘤学、免疫学、神经科学、病理学和组织学领域提供了至关重要的见解。多细胞生物中单个细胞的功能，只有在识别其在体内的确切位置的背景下才能得到完全的解释。空间转录组学技术旨在以这种方式阐明细胞的特性。下文将阐述这些将基因表达与细胞空间组织联系起来的方法。

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## 显微切割

### 激光捕获显微切割

激光捕获显微切割（Laser capture microdissection，LCM）能够在不引起形态改变的情况下捕获单细胞。它利用与组织切片贴合的透明乙烯-乙酸乙烯酯薄膜和低功率红外激光束。当这样的光束对准目标细胞时，目标区域正上方的薄膜会暂时熔化，使其长链聚合物覆盖并紧紧捕获细胞，接着移除切片，目标细胞保留在薄膜中。该方法允许对检索到的细胞进行进一步的RNA转录谱分析和cDNA文库构建。

### 单个冷冻切片的RNA测序

选定区域单个冷冻切片的RNA测序是另一种能够产生基于位置的全基因组表达数据的方法。该方法在不使用激光捕获显微切割的情况下进行。它首次被用于确定冷冻切片果蝇胚胎中基因表达的全基因组空间模式。基本上，它意味着只需对样品选定区域的文库进行简单制备。由于每个切片中的总RNA量很少，导致材料损失，该方法在从每个切片获取高质量RNA-seq文库时遇到困难。这个问题通过在初始RNA提取后向每个管中添加远缘果蝇物种的RNA得到了解决。

### GeoMx

GeoMx数字空间轮廓分析仪（DSP）（NanoString Technologies）是第一款开发用于存档福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片中RNA和蛋白质空间分析的自动化商业仪器。由于能够长期保存组织结构，FFPE是病理学和组织学领域的常见样本类型。GeoMx DSP技术的核心在于用户能够基于组织学结构、功能区室和细胞类型进行“显微切割”。然而，与LCM不同，基因表达分析是通过光以非破坏性方式进行的，这得益于工程化到原位杂交探针中的紫外光可切割条形码。为此，显微镜载玻片上的组织切片用荧光抗体和核染料进行染色，以便在DSP仪器上以单细胞分辨率可视化整个组织切片。感兴趣区域的选择通过基于荧光信号强度的自动分割或绘图工具（包括几何或徒手形状）进行。每个感兴趣区域被精确暴露在紫外光下，条形码被切割、收集并用于识别组织中存在的RNA或蛋白质。定义的感兴趣区域大小可以在十到六百微米之间变化，允许包含组织学样本中的多种结构和细胞。GeoMx DSP可以在空间上解析和测量人类或小鼠的整个转录组，超过1200种蛋白质，或在同一载玻片协议中进行RNA和蛋白质的多组学分析。

### TIVA

TIVA（Transcriptome in vivo analysis）是一种在完整活体组织切片中捕获活体单细胞内mRNA的技术。它使用光激活标签。TIVA标签具有几个功能基团和一个与生物素偶联的捕获聚(U)寡核苷酸，与标签相邻的二硫键连接肽使其能够穿透细胞膜。一旦进入细胞内部，即可使用激光光激活来解阻滞目标细胞中的聚(U)寡核苷酸，以便TIVA标签与细胞内的mRNA杂交。然后，利用链霉亲和素捕获生物素基团来提取结合到未受阻标签上的聚(A)尾mRNA分子，之后通过RNA测序对这些mRNA进行分析。该方法受到低通量的限制，因为一次只能处理少数几个单细胞。

### tomo-seq

作为上述单个冷冻切片RNA测序的高级替代方案，RNA断层扫描（tomo-seq）具有更好的RNA定量和空间分辨率。它也基于组织冷冻切片以及随后的单个切片RNA测序，产生全基因组表达数据并保留空间信息。在该方法中，由于个体组织切片中cDNA的线性扩增，省略了载体RNA的使用。相同的样品在不同方向上进行切片，然后使用重叠数据进行3D转录构建。总体而言，该方法意味着需要对每个切片使用相同的样本，因此无法应用于临床材料的处理。

### LCM-seq

LCM-seq结合了激光捕获显微切割（LCM）和Smart-Seq2 RNA测序，适用于单细胞水平，甚至可用于部分降解的组织。其工作流程包括组织冷冻切片，随后进行激光捕获显微切割，其中细胞被直接收集到裂解缓冲液中，无需RNA分离即可生成cDNA，这既简化了实验程序，又降低了技术噪音。由于在LCM过程中记录了每个细胞的位置身份，在对相应的cDNA文库进行RNA测序后，可以推断出每个细胞的转录组到其分离的位置。LCM-seq已应用于多种细胞类型以了解其内在特性，包括动眼神经元、面部运动神经元、舌下运动神经元、脊髓运动神经元、红核神经元、中间神经元、多巴胺神经元和软骨细胞。

### Geo-seq

Geo-seq是一种同时利用激光捕获显微切割和单细胞RNA测序程序来确定约十个细胞大小的组织区域中转录组空间分布的方法。其工作流程涉及去除和冷冻切片组织，然后进行激光捕获显微切割。然后裂解提取的组织，纯化RNA并反转录成cDNA文库。对文库进行测序后，转录组谱可以映射回被提取组织的原始位置。该技术允许用户定义组织中的感兴趣区域，提取所述组织并以靶向方法绘制转录组图。

### NICHE-seq

NICHE-seq方法使用光激活荧光标记物和双光子激光扫描显微镜为生成的转录组提供空间数据。被荧光标记物结合的细胞被光激活、解离，并通过荧光激活细胞分选（FACS）进行分选。这为仅标记的光激活细胞提供了分选特异性。分选后，单细胞RNA测序生成可视化细胞的转录组。该方法可以在特定生态位（niche）内处理数千个细胞，代价是丢失生态位内细胞之间的空间数据。

### ProximID

ProximID是一种基于对提取的组织进行单细胞迭代微消化（micro digestion）的方法。初始的温和消化步骤保留了微小的相互作用结构，这些结构在继续消化之前被记录下来。然后将单细胞从每个结构中分离出来并进行sc-RNAseq，并使用t-分布随机邻域嵌入进行聚类。基于微消化前的相互作用结构，可将聚集的细胞映射到物理相互作用上。虽然该技术的通量相对较低，但它为数据集提供了细胞间物理相互作用的信息。

## 荧光原位杂交

### CosMx

CosMx空间分子成像仪（NanoString Technologies）是第一个高多重原位分析平台，能够在细胞和亚细胞分辨率下利用福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）和新鲜冷冻（FF）组织样本提供空间多组学数据。它能够快速量化和可视化直至全转录组 以及64种经验证的蛋白质分析物，并且是一个灵活的、具有空间分辨率的 单细胞成像 平台，可用于细胞图谱绘制、组织表型分析、细胞-细胞相互作用、细胞过程和生物标志物发现。

### smFISH

单分子荧光原位杂交（single-molecule fluorescent in situ hybridization，smFISH）是首批能够实现单细胞空间分辨RNA分析的技术之一。它采用了结合有5个荧光基团的短序列（50碱基对）寡核苷酸探针，这些探针可以结合特定的转录本，在样本中产生亮点。对这些斑点的检测提供了有关细胞中某些基因表达的定量信息。然而，使用标有多个荧光基团的探针面临着自猝灭、杂交特性改变以及合成和纯化等挑战。

后来，该方法得到了改进，将上述探针替换为20 bp长的探针，仅连接一个荧光基团，并串联地与感兴趣的mRNA序列互补，这意味着它们将集体结合到目标mRNA上。单个此类探针本身不会产生强信号，但聚集探针的累积荧光将显示出一个亮点。由于错误结合的单个探针不太可能共定位，因此该方法中的假阳性信号受到限制。

因此，这种原位杂交（ISH）技术通过直接对单细胞中的单个RNA分子进行成像，发现RNA表达的空间定位。

### RNAscope

另一种名为RNAscope的原位杂交技术采用特定Z形探针设计，可同时放大杂交信号并抑制背景噪声。它允许在各种细胞类型中可视化单个RNA。RNAscope的大多数步骤与经典的ISH协议相似。将组织样本固定到载玻片上，然后用渗透细胞的RNAscope试剂进行处理。Z探针的设计方式是，只有当它们成对结合到靶序列时才有效。这允许该方法的另一个元件（前置放大器）连接到Z探针的顶部尾端。一旦附着，前置放大器就充当其他元件（放大器）的结合位点，放大器继而与另一种探针（标记探针）结合。结果，在目标序列上形成了一个庞大的结构。最重要的是，前置放大器无法结合单一的Z探针，因此非特异性结合不会导致信号发射，从而消除了开头提到的背景噪音。

### seqFISH

顺序荧光原位杂交（Sequential fluorescence in situ hybridization，seqFISH）是另一种直接在单细胞中识别mRNA并保留其空间背景的方法。该方法通过多轮进行；每一轮都包括荧光探针杂交、成像和随后的探针剥离。在每一轮中，为不同的基因分配不同的颜色，从而产生唯一的时间条形码。因此，seqFISH通过连续的颜色代码（如红-红-绿）来区分mRNA。然而，这项技术也有其缺陷，如自发荧光背景，且由于每一轮中使用的探针数量较多导致成本较高。

### MERFISH

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由于不同颜色通道的数量较少，传统的FISH方法在可同时分析的基因数量上受到限制，多重防错FISH的设计就是为了克服这一问题。多重防错FISH（Multiplexed Error-Robust FISH，MERFISH）通过在多轮杂交中采用二进制代码基因标记，大大增加了单细胞中可同时成像的RNA种类数量。这种方法使用能够检测并纠正错误的编码方案，可以一次测量140种RNA。核心原理在于通过结合数个连续杂交轮次的信号并在多轮杂交中为感兴趣的基因分配N位二进制条形码来识别基因。该代码依赖于特定探针，包含“1”或“0”值，且每个基因的组合设定各不相同。通过使用六位或更长的代码，且其中任意两个代码至少有3位不同，可以避免错误。为每种RNA生成一个特定的探针。每个探针是一个特异性针对靶标的寡核苷酸，由20-30个碱基对组成，在穿透细胞后与mRNA序列互补结合。然后，多轮杂交进行如下：对于每一轮，仅加入在相应二进制代码位置上包含“1”的探针。在每一轮结束时，使用荧光显微镜定位每个探针。如预期那样，只有那些在指定位置带有“1”的mRNA会被捕获，然后对照片进行光漂白并加入新的子集。因此，我们检索到二进制值的组合，从而能够区分众多RNA物种。

### smHCR

基于杂交链式反应进行深度单分子RNA检测（Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction，smHCR）是一种先进的seqFISH技术，可以克服厚实和不透明组织样本中常见的自发荧光背景问题。在该方法中，多个读出探针与mRNA的目标区域结合。目标通过一组在定义的子序列中附着于其上的短DNA探针来检测。每个DNA探针携带相同HCR放大器的引发剂。然后，荧光团标记的DNA HCR发夹结构穿透样本并组装成附着在起始探针上的荧光放大聚合物。在多重研究中，使用上述相同的两阶段协议：就像所有的HCR放大器一样，所有探针组同时引入；然后使用光谱上不同的荧光团进行进一步成像。

### osmFISH

osmFISH（Cyclic-ouroboros smFISH）是smFISH的一种改良，旨在克服光学拥挤的挑战。在osmFISH中，首先可视化转录本，获取图像后剥离探针，并用不同的荧光探针可视化新的转录本。在连续的轮次后，编译图像以查看RNA的空间分布。由于转录本是依次被可视化的，它消除了信号相互干扰的问题。这种方法允许用户生成比其他相关技术更大组织切片的高分辨率图像。

### ExFISH

扩张FISH（Expansion FISH，ExFISH）利用膨胀显微镜技术实现对RNA位置的超分辨率成像，即使在厚标本（如脑组织）中也是如此。它支持单分子和多重读出。

### EASI-FISH

扩展辅助迭代荧光原位杂交（Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization，EASI-FISH）对ExFISH进行了优化和拓展，提高了检测精度，并在比以前可能更厚的样品（300 μm）中实现了稳健的多轮处理。它还包含一条易用型计算分析流水线。

### seqFISH+

SeqFISH+通过后续几轮的荧光解决了与空间拥挤相关的光学问题。首先，初始探针退火结合到目标mRNA上，随后的探针再结合到初始探针的侧翼区域，从而产生独特的条形码。每个读出探针被捕获为图像，并折叠合并成超分辨率图像。该方法允许用户一次靶向多达一万个基因。

### DNA显微镜

DNA显微镜（DNA microscopy）是一种独特的无光学成像方法，用于分子位置映射，并在几个连续的原位反应中同时保留测序数据。首先，固定细胞并合成cDNA。随机化的核苷酸然后在原位标记靶向cDNA，为每个分子提供独特的标签。被标记的转录本在第二次原位反应中被扩增，恢复的拷贝被连接在一起，并加入新的随机核苷酸。每次连续的连接事件都被标记，从而产生独特的事件标识符。随后，算法根据由获得的连接序列解码的分子近似度生成原始转录本的图像，同时记录靶标的单核苷酸信息。

## 原位测序

### 使用锁式探针的ISS

ISS padlock方法基于锁式探针/挂锁探针（padlock probing）、滚环扩增（RCA）以及连接测序（sequencing by ligation chemistry）。在完整的组织切片内，mRNA被逆转录为cDNA，随后由RNase H进行mRNA降解。接下来，该方法可以通过两种方式进行。第一种方式，即间隙靶向测序（gap-targeted sequencing），涉及挂锁探针结合到cDNA上，探针两端之间留有间隙，这些间隙是以连接测序为靶标的。然后通过DNA聚合作用填补这个间隙，并通过DNA连接酶创建一个DNA环。另一种方式，即条形码靶向测序（barcode-targeted sequencing），仅通过连接将带有条形码序列的挂锁探针进行DNA环化。在这两种方法中，末端被连接形成一个DNA环。接着通过RCA进行靶标扩增，产生微米级的RCA产物（RCPs）。RCA由挂锁探针序列的重复片段组成。随后，这些DNA分子接受连接测序，根据版本的不同，解码填补间隙的序列或相邻末端探针内最长四碱基的条形码。无间隙变体声称灵敏度更高，而间隙填补变体则意味着读出转录本实际的RNA序列。后来，该方法通过微流控平台的自动化，并以杂交测序（sequencing by hybridization）技术替代连接测序得到了改进。

### FISSEQ

荧光原位测序（Fluorescent in situ sequencing，FISSEQ）与ISS padlock类似，是一种使用逆转录、滚环扩增和连接测序技术的方法。它允许在固定细胞中进行空间转录组分析。首先，使用常规碱基和修饰的氨基碱基以及带标签的随机六聚体RT引物，将RNA逆转录为cDNA。氨基碱基介导cDNA与其细胞周围环境的交联。然后通过连接使cDNA环化，并通过RCA进行扩增。结果获得了直径为200–400 nm的单链DNA纳米球。因此，这些纳米球包含cDNA序列的众多串联重复。然后通过SOLiD连接测序进行测序。如前所述，逆转录产物和克隆扩增的RCPs的位置均通过与细胞基质组分的交联来维持，从而在细胞内创建一个3D原位RNA-seq文库。一旦与具有不同颜色的荧光探针结合，扩增子就会变得高度荧光，从而允许对信号进行视觉检测；然而，图像处理算法依赖于与参考序列的读段比对，而非信号强度。

### Barista-seq

条形码原位靶向测序（Barcode in situ targeted sequencing，Barista-seq）是对间隙挂锁探针方法的改进，在效率上提高了五倍，读取长度增加了十五个碱基，并兼容illumina测序平台。该方法同样使用挂锁探针和滚环扩增，但与间隙挂锁方法不同，这种方法采用合成测序法和交联。在相同程序中与细胞基质的交联与FISSEQ相同。

### STARmap

空间分辨转录本扩增子读出映射（Spatially-resolved transcript amplicon readout mapping，STARmap）利用带有一个额外引物的挂锁探针，允许直接扩增mRNA，免去了逆转录的需要。与其他基于挂锁探针的方法类似，通过滚环扩增进行放大。DNA扩增子经过化学修饰并嵌入细胞内聚合的水凝胶中。捕获的RNA然后可以在原位进行测序，提供每个细胞内mRNA的三维位置信息。

## 原位捕获

### Stereo-seq (STOmics)

STOmics通过其专有的空间增强分辨率组学测序（Stereo-seq）技术，是推进空间分辨转录组学分析的先驱。

它结合了原位捕获和DNB-seq。DNB测序基于用于原位测序的平版刻蚀芯片（图形化阵列）。与其他微米级别的原位捕获技术不同，标准DNB芯片具有直径约220 nm的斑点，中心距为500 nm，每10毫米线性距离可为组织RNA捕获提供多达20000个斑点，即每1平方厘米有4 × 108个斑点。因此，STOmics可以表现出比其他原位捕获技术更高的分辨率和更宽的视野。

### 空间转录组学（技术）

第一个被广泛采用的方法由Ståhl等人在2016年发表于Science杂志的一篇里程碑论文中描述，该论文创造了“空间转录组学”一词。这种方法依赖于mRNA从新鲜冷冻组织切片中扩散出来，通过与附着在玻璃载玻片上的oligo(dT)序列杂交来捕获被多聚腺苷酸化的mRNA。玻璃载玻片上排列有“斑点”（spots），这些斑点包含用于捕获mRNA转录本的oligo(dT)序列、用于指示在阵列载玻片上x和y位置的空间条形码序列、用于生成序列文库的扩增和测序柄，以及用于量化转录本丰度的唯一分子标识符。冷冻组织样本使用冷冻切片机切割，然后被固定、染色并小心地平铺在微阵列上。接下来，酶促通透性处理允许RNA分子扩散到微阵列载玻片上，使被多聚腺苷酸化的mRNA分子与oligo(dT)序列尾部杂交。随后原位进行逆转录以合成第一链。结果，合成了具有空间标记的cDNA，提供了有关组织切片确切位置的基因表达信息。利用cDNA，可以生成用于短读长测序的文库。总之，该空间转录组学协议结合了对同一样本的并行测序和染色。在下游分析中，生物信息学工具允许将组织图像与基因表达进行叠加。输出结果是一张在组织切片内捕获到基因表达的转录组图谱。必须指出的是，第一代阵列载玻片包含约1,000个直径为100微米的斑点，将其分辨率限制在每个斑点~10-40个细胞。

这项技术是一家于2012年成立、名为“Spatial Transcriptomics”的公司的基础。2018年，10X Genomics收购了Spatial Transcriptomics，作为10X Visium平台的基础。

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### Slide-seq

Slide-seq依赖于将结合RNA、带有DNA条形码的微珠附着在涂有橡胶的玻璃盖玻片上。这些微珠通过SOLiD测序被映射至它们的空间位置。将组织切片转移到这个盖玻片上以捕获提取的RNA。被捕获的RNA进行扩增和测序。转录本的定位是由捕获该转录本的微珠上的条形码寡核苷酸序列决定的。

### APEX-seq

APEX-seq允许评估细胞不同区域的空间转录组。该方法利用在活细胞中表达的APEX2基因，这些活细胞与生物素-酚和过氧化氢一起孵育。在这些条件下，APEX2酶催化将生物素基团转移到RNA分子上，然后这些分子可以通过链霉亲和素磁珠（streptavidin bead purification）进行纯化。随后纯化后的转录本被测序，以确定哪些分子与生物素标记酶紧密相邻。

### HDST

高清晰度空间转录组学（High-Definition Spatial Transcriptomics，HDST）首先解码玻璃载玻片孔中mRNA捕获微珠的位置。这是通过顺序杂交到每个微珠的条形码寡核苷酸序列来完成的。一旦解码了每个微珠的位置，就可以将组织样本放置在载玻片上并进行渗透处理。然后对捕获的转录本进行测序。HDST使用比Slide-seq更小的微珠，因此可以在两微米的空间分辨率上进行解析，而Slide-seq则为十微米。

### 10X Genomics Visium

10X Genomics Visium测定法是空间转录组学测定法更新且改进的版本。它同样利用玻璃载玻片表面的点阵列mRNA捕获探针，但增加了斑点数量、最小化了斑点尺寸，并增加了每个斑点的捕获探针数量。在Visium空间基因表达载玻片的四个捕获区域内，每个区域大约有5000个带条形码的斑点，而这些斑点进而包含数百万个带空间条形码的捕获寡核苷酸。组织mRNA在渗透化处理后被释放，并结合到带条形码的寡核苷酸上，从而能够捕获基因表达信息。每个带条形码的斑点直径为55 μm，从一个斑点中心到另一个斑点中心的距离约为100 μm。这些斑点交错排列，以最大限度地减小它们之间的距离。平均而言，每个斑点捕获来自1至10个细胞的mRNA，这提供了接近单细胞的分辨率。

### Takara Bio SEEKER

该 测定法在概念上类似于10X Genomics Visium，但具有更高的斑点密度。与10X Genomics Visium HD（该方法使用的是针对人或小鼠等物种预定义的RNA探针）相反，SEEKER具有类似的密度和分辨率，但能够对任何新鲜冷冻组织样本进行测定，它利用了样本中所有mRNA的poly-A接头进行测序。

## 计算机模拟构建

### 使用ISH进行重建

计算机模拟ISH空间重建（in silico Spatial Reconstruction with ISH）是指根据细胞的表达谱对其位置进行计算式空间重建。存在数种基于该原理的类似方法。它们共同分析相同细胞类型的单细胞转录组学以及可用的基于ISH的基因表达图谱。根据这些数据，细胞随后被分配到组织中的位置。显然，该方法受限于ISH参考数据的可用性这一因素。此外，当在复杂的组织中分配细胞时，它会变得更加复杂。由于缺乏配对的参考资料，这种方法不适用于临床样本。报告的在脑组织中细胞精确分配的成功率为81%。

### DistMap

使用Distmap算法映射转录组需要高通量的单细胞测序以及目标组织现存的原位杂交图谱。Distmap算法利用测序细胞的转录组和上述参考图谱生成目标组织的虚拟3D模型。可使用t-分布随机邻域嵌入将转录组聚类到不同的细胞类型中，并使用虚拟原位杂交将其映射到3D模型上。基本上，该算法获取解离组织中产生的单细胞数据，并能够使用虚拟原位杂交将单个转录本映射到该细胞类型在组织中的位置。