古DNA

古DNA（ancient DNA，缩写aDNA），是指从古代生物遗骸或环境样本中分离提取的DNA。由于降解过程（包括交联、脱氨基和片段化），古DNA与现代遗传物质相比质量较低，其受损特征和保存能力限制了可开展的分析类型，并为成功提取样品的年龄设定了上限。即使在最佳保存条件下，样品中含有足够DNA供现有测序技术分析的上限约为40万至150万年。从物理标本中测序的最古老DNA来自西伯利亚超过一百万年的猛犸象臼齿。

2022年，从格陵兰永久冻土沉积物中回收了约200万年前的遗传物质，目前被认为是迄今发现的最古老DNA。同年，斯万特·帕博因其在已灭绝古人类基因组和人类演化方面的发现，获得诺贝尔生理学或医学奖。古DNA的来源十分广泛，包括古生物学和考古学的骨骼材料、木乃伊化组织、非冷冻医学标本档案收藏、保存的植物遗存、冰芯和永久冻土芯、海洋和湖泊沉积物以及挖掘出的土壤等。

## 历史

### 1980年代：奠基

1984年，加州大学伯克利分校的樋口（Russ Higuchi）及其同事进行了最早的古DNA研究。他们报告称，从已灭绝斑驴的博物馆标本中提取到了DNA，且该标本在个体死亡150多年后仍可被提取和测序。随后两年，斯万特·帕博通过对天然和人工木乃伊化标本的研究，证实这一现象并不局限于相对近代的博物馆标本，也可在早至数千年前的人类木乃伊样本中复现。帕博在1985年成功从古埃及木乃伊中提取并克隆了DNA，开启了古DNA研究的先河。

当时测序古DNA所需的繁重流程（通过细菌克隆）是该领域发展的障碍。然而，随着1980年代末聚合酶链式反应（PCR）技术的发展，该领域开始迅速进步。

### 1990年代：琥珀热与反思

后PCR时代引发了一波发表浪潮，多个研究小组声称成功分离了古DNA。一系列令人难以置信的发现被发表，声称可从数百万年前的标本中提取真实的DNA——林达尔（Lindahl）将其称为“大洪水前DNA”（Antediluvian DNA）。大多数此类声称基于从琥珀中保存的生物提取DNA，包括无刺蜂、白蚁、植物等。甚至有人声称从白垩纪琥珀象鼻虫和恐龙骨骼中提取了超过8000万年前的DNA序列。

然而，随着对DNA保存动力学、样品污染风险和其他复杂因素理解的加深，该领域开始以更审慎的态度审视这些结果。众多谨慎的尝试未能重复许多发现，该十年间所有关于数百万年古DNA的声称最终均被认定为不真实。所谓恐龙DNA后来被揭示为人类Y染色体污染。

### 2000年代：高通量革命

2007年引入了单引物延伸扩增技术以解决死后DNA修饰损伤问题。自2009年起，更便宜的研究技术彻底改变了古DNA研究领域，研究人员自2010年起能够测序古人类DNA并恢复完整基因组。下一代测序（NGS）技术在古DNA研究中的应用，对重建古代或已灭绝生物的基因组至关重要。此外，该领域开始制定更好的DNA结果评估标准和准则，以区隔真实信号和污染干扰。

### 2020年代：诺贝尔奖与最古老DNA

2022年诺贝尔生理学或医学奖授予斯万特·帕博，以表彰其“关于已灭绝古人类基因组和人类演化的发现”。几天后，2022年12月7日，《自然》杂志发表的研究报告称在格陵兰发现了200万年前的遗传物质，这是迄今发现的最古老DNA。该研究利用环境DNA技术从冻土沉积物中重建了一个包含乳齿象、驯鹿、雁类和蚂蚁等物种的古代生态系统。

## 降解与保存极限

古DNA的降解主要通过三种过程进行：交联（DNA链之间形成化学键）、脱氨基（碱基的化学修饰，特别是胞嘧啶转化为尿嘧啶）和片段化（长链断裂为短片段）。这些损伤限制了可开展的分子分析类型，并为样品的可测序年龄设定了理论上限。

理论上的时限与环境条件密切相关。对新西兰恐鸟骨骼中线粒体DNA（mtDNA）和核DNA降解的研究表明，在-5°C条件下，线粒体DNA经过约683万年后平均降解至1个碱基对长度。核DNA的降解速度至少是线粒体DNA的两倍。降解动力学已通过加速老化实验得到验证，进一步显示了储存温度和湿度对DNA降解的强烈影响。即使在挖掘之后，环境效应仍可能加剧DNA的衰变速度。早期研究报告从白垩纪恐龙遗骸中回收了DNA，但这些结果很可能源于样品污染而非真实古DNA的保存。

在最佳保存条件下，样品的可测序DNA上限约为40万至150万年。2016年，研究人员在海洋沉积物芯中测量了叶绿体DNA，发现了可追溯至140万年前的硅藻DNA。该DNA的半衰期显著长于此前研究结果，可达约15,000年。研究还发现，DNA在前约10万年按半衰期速率降解，之后则遵循更慢的幂律衰减速律。

## 污染与鉴定

古DNA研究面临的一个主要问题是现代DNA的污染，包括来自研究人员的现代人类DNA和微生物DNA。由于标本与研究者在生物学上属于同一物种（在人类古DNA研究中），污染问题尤为突出，可能导致数据分析结果严重偏倚。为应对污染，近年来发展出多种预防方法，包括在极度无菌条件下进行提取操作，使用特殊接头区分样品中的内源性分子与分析过程中引入的分子，以及应用生物信息学方法根据已知读取近似污染率。

随着2000年代古DNA领域的发展，对回收的DNA进行鉴定以确认其确为古代DNA而非近期污染产物的重要性日益凸显。由于DNA随时间降解，组成DNA的核苷酸可能发生变化，特别是分子末端的胞嘧啶（C）脱氨基转化为尿嘧啶（U），在测序过程中DNA聚合酶在尿嘧啶对面掺入腺嘌呤（A），导致古DNA数据中出现胞嘧啶（C）到胸腺嘧啶（T）的替换。这些替换的频率随样品年龄增长而增加。C-T水平的频率测量可通过多种软件进行，如mapDamage2.0或PMDtools。此外，由于水解脱嘌呤作用，DNA断裂为较小片段，这种短片段长度特征也有助于区分现代DNA与古代DNA。

## 应用

### 非人类古DNA

尽管古DNA研究面临诸多问题，已发表的动物和植物古DNA序列范围广泛且不断增加。被检测的各类组织包括：人工或天然木乃伊化动物遗骸、骨骼、贝壳、古粪便、酒精保存标本、干植物遗存，以及近年来直接从土壤样品中提取的动植物DNA。

2013年6月，哥本哈根大学的一批研究人员宣布，他们从加拿大育空地区永久冻土中埋藏的腿骨材料中，成功测序了一匹56万至78万年前马的DNA。同年，一个德国团队报告了超过30万年前的德宁格熊（Ursus deningeri）线粒体基因组，证明了真实的古DNA可在永久冻土之外保存数十万年。2021年，来自西伯利亚永久冻土保存的两颗猛犸象牙齿的核DNA被报道，两颗牙齿均超过100万年。2016年，研究人员在海洋沉积物芯中测量了叶绿体DNA，发现了可追溯至140万年前的硅藻DNA。

### 人类古DNA

由于古人类遗骸受到广泛的人类学、考古学和公众关注，其一直是古DNA研究的重要焦点。但同时，由于标本与研究者属于同一物种，污染问题更加突出。重要的标本来源包括天然保存的遗骸，如在阿尔卑斯山冰川中冻结的冰人奥茨以及在安第斯山脉高海拔快速干燥保存的尸身；化学处理保存的组织，如古埃及木乃伊；但大多数人类古DNA研究集中于从骨骼和牙齿中提取DNA，其中颞骨岩部因其致密结构提供良好的DNA保存条件而最为常用。古病理DNA也已成功从超过5,000年的人类样本中提取，涵盖钙化胸膜、石蜡包埋组织和福尔马林固定组织等。

2012年，一项研究分析了西班牙El Sidrón洞穴中一组尼安德特人的骨骼样本，获得了关于潜在亲属关系和遗传多样性的新见解。2015年11月，科学家报告发现了一颗含有丹尼索瓦人DNA的11万年前牙齿。2018年的一项研究表明，青铜时代的大规模迁徙曾极大地影响了不列颠群岛的遗传结构，带来了来自欧洲大陆的贝尔陶器文化。

这些研究还揭示了中亚祖先与美洲原住民之间的联系。在非洲，由于热带气候较暖导致DNA降解更快，古DNA研究更为困难，但2017年已报告了早至8,100年前的古DNA样本。通过测序来自石器时代狩猎采集者（2,000年前）和铁器时代农民（300至500年前）的非洲基因组，研究者将人类群体间最早分化的时间推至35万至26万年前。截至2021年，最古老且已完全重建的人类基因组约为45,000年前，为理解人类迁徙和遗传历史（包括早期欧洲现代人与尼安德特人之间的基因交流）提供了关键见解。

## 重要研究者

- 斯万特·帕博（Svante Pääbo）——2022年诺贝尔生理学或医学奖得主
- 大卫·里奇（David Reich）——哈佛大学，古人类基因组学研究
- 贝丝·夏皮罗（Beth Shapiro）——加州大学圣克鲁兹分校