光遗传学

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光遗传学融合光学及遗传学的技术，精准控制特定细胞在空间与时间上的活动。其时间上精准程度可达到毫秒，而空间上则能达到单一细胞大小。2010年光遗传学被Nature Methods选为年度方法，同年被Science认为是近十年来的突破之一。这两个期刊也分别在 Youtube影片 及 科学美国人文章 里以科普的方式解释何谓光遗传学。

## 发展

1979年弗朗西斯·克里克首次提出，为了了解大脑如何运作，我们需要一种方法，可以每次只让某一特定型态神经元活动被抑制，而不影响其他神经元的活动。然而就当时技术，利用侵入性电极来控制神经活动，没有办法准确控制哪些神经元被抑制或活化，而利用药物或者基因突变，虽然可以大致知道哪些神经元被影响，却没办法精准地控制何时这些神经元被抑制或活化。其后，许多人尝试将各式各样的基因或化合物结合在一起，希望其能表现在神经元里，利用光来控制神经元活动。这些方法虽然有效，但其在控制神经元活动的速度，标的神经元的精准度，能否表现在深层神经组织，对生物体是否有毒性，以及是否能简易地应用在其他模式生物系统等等考量上，往往并非理想，因而尝试几年之后，科学家转而思考，是否有办法找到在自然界中本身便对光有反应，并且能调控细胞电位的蛋白质。

然而其实早在1973年，微生物学家便发现细菌视紫质照光之后会成为离子转运蛋白，1977年发现盐细菌视紫红质也是离子转运蛋白，照黄绿光后会将氯离子打出细胞外，随后在2002年发现光敏感通道，照蓝光之后会将阳离子打进细胞内。

1994年，Heberle 和 Büldt 已经展示了嗜盐杆菌视紫红质（bacteriorhodopsin）在酵母中的功能性异源表达，并可用于光激活离子流。1995年，Georg Nagel 等人与 Ernst Bamberg 在动物细胞（爪蟾卵母细胞）中尝试异源表达微生物视紫红质（包括嗜盐杆菌视紫红质），并观察到光诱导的电流（Georg Nagel et al., 1995, FEBS Lett.）。

Peter Hegemann 在雷根斯堡大学（University of Regensburg）研究绿藻的光响应时，发现了一种光电流，其速度快到无法用经典的 G 蛋白偶联动物视紫红质（G-protein-coupled animal rhodopsins）来解释。随后，他与法兰克福马克斯·普朗克研究所（Max Planck Institute）电生理学家 Georg Nagel 合作，证明了来自绿藻 Chlamydomonas 的单个基因在青蛙卵母细胞中表达时可产生强烈的光电流。为了识别表达细胞，他们用荧光蛋白 YFP 替换了藻类蛋白的胞质尾部，从而开发出了第一个具有广泛适用性的光遗传学工具。他们在 2003 年的论文中指出，“ChR2 在卵母细胞或哺乳动物细胞中的表达，可作为一种强有力的工具，通过照射简单地增加胞质 Ca²⁺ 浓度或去极化细胞膜。”

2005年八月，科学家第一次将光敏感通道表现在动物神经元里，发现我们可以用蓝光准确控制何时活化神经元，而光遗传学一词也在此时出现。随后发现细菌视紫质与盐细菌视紫红质也都能在神经元表现，准确调控其活动，并对神经元不产生毒害，至此之后，光遗传学迅速改变神经生物学界，成为了解特定神经元在大脑中扮演何种角色，不可或缺的工具。

## 活化神经元的光遗传学工具

光敏感通道-1(Channelrhodopsin-1)及光敏感通道-2(Channelrhodopsin-2)皆从莱茵衣藻里发现，将其基因序列修改成最适合哺乳类表达之后，在大多模式生物系统之中都有很稳定的表达，且对细胞没有毒性。其中光敏感通道-2在全反式视黄醛(all-trans retinal)存在之下，可以在接受蓝光刺激，并在50毫秒内，打开通道，使阳离子钠、钾流入细胞内，引起神经细胞去极化。不同的突变使光敏感通道-2有不同的特质，其中最常见的是将第134位的氨基酸由组胺酸突变为精胺酸(ChR2(H134R))，该蛋白质可以产生两倍的光电流，但通道开关速度也比野生种慢了一倍。

在此之后，各式光遗传学工具纷纷出炉，大致上依其组成型态可分成三类。一类为以光敏感通道-2为基础，对其进行点突变，如上述的ChR2(H134R)、ChR2(T159C)(TC)、ChR2(L132C)(CatCh)等等，其中甚至有被称为跃阶光敏感通道（step function opsin, SFO)的突变，如ChR2(C128S/D156A)可以打开其离子通道长达30分钟。第二类则为将某部分光敏感通道-1及光敏感通道-2组合在一起的蛋白质，如ChIEF。第三类则为将光敏感通道-1及由团藻发现的光敏感通道(VChR1)组合在一起的蛋白质，统称为C1V1。

## 抑制神经元活动的光遗传学工具

第一个有效抑制神经元活动的光遗传学工具，是从嗜盐碱菌里头发现的盐系菌视紫红质，简称NpHR。其在黄绿光照射下会将氯离子打进神经元内，使其过极化，而抑制神经元活动。随后科学家将其加上信号肽，使其能在细胞膜上表现更好，即为eNpHR2.0及eNpHR3.0。由于盐系菌视紫红质与光敏感通道接受不同波长的光，因此可以将此二蛋白质表现在同一神经元上，利用不同波长的光活化或抑制该神经元活动，而能更深刻了解该神经元在大脑中扮演的角色。

此外还有从苏打盐红菌里发现的古紫质(Archaerhodopsin-3, Arch)，古紫质为反质子泵，其对黄绿光非常敏感，使用900毫安培的黄绿光便能活化，将氢离子运送至神经元外，使其去极化。另外还有从真菌茎基溃疡病菌发现的Mac，可在蓝绿光照射下，将氢离子运送至神经元外。

值得注意的是，NpHR与Arch或Mac用不同机转来抑制神经元活动，近来发现NpHR将氯离子送至细胞内所导致的去极化，会在去极化后提升突触所引起的动作电位产生几率，而将氢离子运送至神经元外的Arch或Mac并无此影响，显示抑制神经元活动的光遗传学工具，可能会和神经原本身的讯号系统互相作用。

## 照明应用硬件

另一个必要因素是硬件（例如集成的光纤和固态光源），以允许在行为自由的动物中控制特定类型的细胞，甚至是大脑深处的细胞。最常见的是，后者现在是使用2007年引入的光纤耦合二极管技术来实现的，尽管为避免使用植入的电极，研究人员设计了一种方法来刻写由氧化锆制成的“窗口”，已被修改为透明并植入小鼠头骨，以允许光波更深地穿透以刺激或抑制单个神经元。为了刺激诸如大脑皮层之类的浅层大脑区域，可以将光纤或LED直接安装在动物的头骨上。植入更深的光纤已用于将光传输到更深的大脑区域。作为对光纤束缚方法的补充，已经开发出了完全无线技术，该技术利用无线传输的功率为头戴式LED进行了无阻碍的研究，以自由地研究行为自由的有机体中的复杂行为。最近的进展研究了使用有机LED（OLED）作为光遗传学刺激物。在体外以毫秒量级的时间规模证明了表达微生物视蛋白的神经元的精确和受控刺激。脉冲模式操作允许在兼容的低温范围内进行神经刺激。此外，有机发光二极管（OLED）的厚度非常薄，可以小于1μm，因此适合植入大脑。

## 应用

### 秀丽隐杆线虫

秀丽隐杆线虫因其全身透明，基因克隆技术简单，且其神经网络如何连结大致已被界定，很适合利用光遗传学来研究其神经网络如何控制行为。研究显示光敏感通道-2、盐系菌视紫红质、古紫质(Archaerhodpsin-3, Arch)均能在秀丽隐杆线虫上表现，控制神经元活动。在固定的秀丽隐杆线虫，科学家首次把光遗传学和钙离子成像技术结合起来研究神经元的连接。许多科学研究已经能成功在自由移动的秀丽隐杆线虫，利用光学技术，控制特定神经元活动。利用光遗传学技术，现在研究已经了解部分痛觉网络的神经元扮演的角色，发现控制特定神经元活动得以使秀丽隐杆线虫转弯、后退，甚至沿着 虚拟光梯度前行。