即时聚合酶链式反应

即时聚合酶链式反应（Real-time polymerase chain reaction）是一种在DNA扩增反应中，以萤光染剂侦测每次聚合酶链锁反应（PCR）循环后产物总量的方法。

此实验法已被众多科学家采用，因为其侦测范围广、灵敏度高、准确、专一及快速。PCR的发展因为侦测感染病患的病毒（不过RNA病毒须先反转录成DNA才进行PCR）或细菌量、癌症监测、诊断个别基因差异的用药反应等应用而大幅提高。

PCR的方法是基于侦测目标物在反应前及PCR后产物的量化关系，越早探测到指定萤光值表示目标基因组越多。相对于终端PCR方式（end-point PCR，传统的PCR配合凝胶电泳，在反应后侦测），qPCR（定量即时聚合酶链式反应）有许多优点。其结果可以较快取得且稳定，因为是采用非常敏感的化学萤光，而且不需要再继续处理PCR反应后的侦测，花费时间与精神的工作步骤便可以省下。此外，因为反应后不需打开管子而减少了操作污染。qPCR分析亦适于更具挑战性的应用，如多重侦测与高通量分析。

## 背景

所有生命体内的细胞都通过基因转录本（单链RNA）的表达量来调节基因表达：一个基因在细胞中的表达量可以通过样品中RNA转录本的量来衡量。为了通过少量的RNA稳定地检测和量化基因表达，大量扩增基因转录本是必需的。聚合酶链式反应（PCR）就是一种常用的扩增DNA的方式；而对于基于RNA的PCR，第一步是通过逆转录酶将RNA样本逆转录为互补DNA（cDNA）。

为了扩增少量的DNA，我们也会在常规的PCR中使用相同的方法，即使用一个DNA模板，至少一对特定的引物，dNTPs，合适的缓冲液以及热稳定的DNA聚合酶。在热循环仪中向上述混合物中添加被荧光基团标记的物质，热循环仪中的传感器会测量荧光基团发出的荧光。通过这一手段我们可以在每一轮PCR中测量扩增出来的产物的量。我们可以在电脑上分析得到的这些数据以便计算不同样本中相关的基因表达量（或者说是mRNA的拷贝量）。定量化的PCR也可以用来检测和量化样品中的DNA的量来检测这些样品中某一特定DNA序列是否存在以及数量是多少。我们可以在每一轮扩增周期后进行这些测量，这也是为什么这种方法叫做即时聚合酶链式反应。

定量PCR和DNA微阵列都是现代用于研究基因表达的技术。过去有一些技术是用于测量mRNA的丰度的，比如mRNA差别显示技术（differential display）、核酸酶保护分析（nuclease protection assay）以及RNA印迹法（Northern blot）。RNA印迹法经常被用于通过可视化样品中基因对应的mRNA的丰度来估计基因表达水平，在这一技术中，我们使用琼脂糖凝胶电泳来分离纯的RNA，再转移到固体基质中（比如尼龙膜），而后使用与其互补的DNA或者RNA探针来检测。虽然这种技术至仍在用于估计基因表达量，但是它需要相对较多的RNA而且只能提供有关mRNA水平的定性的或者半定量的信息。由定量方法引起的估计误差可能与DNA的完整性、酶的效率等等因素相关。鉴于这一原因，众多规范化系统（或者通常被称为规范化方法）逐渐发展了起来。有一些是用于定量化总的基因表达量的，但是最常见的是将我们想要研究的特定的基因与另外一种被称为标准化基因的基因相比较来定量化我们想要研究的基因。这种标准化基因在细胞中的表达量通常是一个定值，通常是从作用与细胞的生存等基础生命活动相关的管家基因中挑选出来的。这样做的好处是可以将我们的目标基因表达量和挑选出来的标准化基因表达量做比得到一个比值，从而使我们无需知道目标基因的绝对表达量就可以进行比较。

标准化基因通常编码以下分子：微管蛋白（tubulin）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、白蛋白（albumin）、亲环素（cyclophilin）以及rRNA。

## 染剂

使用于PCR侦测的化学物基本可分为两类：非专一性化学物，通常是与DNA结合的萤光染剂；目标专一性化学物，是使用萤光探针或引子。

- 目标专一性侦测：、LightUp、 (Fluorescence Resonance Energy Transfer)
- TaqMan probe 是选取PCR上下游引物之间的一段序列作为探针，并在探针的5`-端标记上荧光基团，3`-端标记上相应的淬灭基团(由于两个基团靠得很近，构成荧光能量传递的关系，没有荧光信号产生，在每一个循环的退火过程中，该探针可以与模板相结合，随后的延伸反应中，当引物合成至探针与模板结合处时，Taq酶的5`-外切酶活性可以降解探针的5`-端，并因此使荧光基团与淬灭基团分离，释放荧光，理论上每合成一次新链就有一次荧光信号释放)。
- Molecular Beacon 是探针片段在游离状态下呈茎环(stem-loop)结构，其中茎的部分一般是5至7个高GC含量的核苷酸，环的部分是15至30个可以与PCR模板互补的核苷酸序列，而且探针的5`-端和3`-端分别标记有荧光报告基团和淬灭基团(由于这两个基团处于茎的结构中，靠得很近，没有荧光信号产生，在PCR每一个循环的变性过程中，处于茎环结构的探针被打开，并在黏合过程中与模板结合，使萤光基团远离淬灭基团并释放荧光信号，因而荧光强度与被扩增的模板量成正比)。

## 仪器

- 光源：氙气灯、激光、发光二极管（LED）
- 滤镜
- 侦测方式：光电倍增管（photomultiplier tube, PMT）、光电耦合元件（charge-coupled device, CCD）、光电二极管（photodiodes）
- 控温方式：热电效应元件（peltier elements）、旋转式气流升降温、微流体式
- 容器：聚丙烯（PP）容器、玻璃毛细管

## 数据分析

- 门槛循环（MIQE中定义为Cq值(quantification cycle)；过去通称为Ct, Threshold cycle，Ct值，又称阈值循环数）
- 解离曲线分析（melting curve）
- 高分辨率解离分析（High Resolution Melt, HRM）
- FRET分析

## 应用

PCR的一些应用包括：

1.基因表现分析：例如结核分岔杆菌（Mycobacterium tuberculosis）是一种生长相当缓慢的细菌，传统培养及鉴定一般需要花数周时间，但2015年时Watanabe Pinhata和Cergole-Novella以自己发展的real time PCR检测mpt64，直接检测病人痰液中的结核分岔杆菌，分析715个检体657个病人，其检测灵敏度（sensitivity）及特异性（specificity）分别为90.3%及98.6%，而传统培养方法的灵敏度及特异性分别为90.3%及99.7%。整个实验流程可以在5个小时内完成，此方法可以用于没有套装试剂（kit）可以使用的实验室。

2.检验生物芯片的结果。

3.siRNA与miRNA诊断。

4.基因型鉴定

5.饮食分析

6.兽医微生物检测

## 实验比较

### qPCR的特点

- 荧光实时定量PCR的基本原理有两个要点：首先是对PCR反应中的每一个循环的反应产物进行实时检测并记录下来；其次，用于检测PCR产物实时检测的荧光染料标记在一段可以与单链PCR产物(模板)特异性杂交的探针上，并且处于淬灭状态，只有当探针与模板特异性结合以后才有可能释放出荧光信号。
- 每一轮循环中PCR的产出量都以荧光信号的形式被PCR仪的光学检测系统记录下来，在某一循环中荧光信号的强度达到预先设定的阈值时，此时的循环数称为CT(Threshold Cycle)，Ct值与起始的模板量成反比，起始的核酸量越多，达到阈值的循环数就越少，换句话说CT值会越小。如果要确定量的话，需要做出标准曲线，以Ct值为纵坐标，起始模板数为横坐标作图。在新的 MIQE规范中Ct这个惯用的名词被重新定义为Cq值(quantification cycle)。

### 和PCR比较

- 常规PCR的产物在理论上呈指数级增长，而在实际反应中，由于反应物浓度、酶活性等条件的变化，在循环数不断增加时，反应进入平台期，PCR产物不再呈指数级增长。荧光实时定量PCR的优点在于它避免了常规PCR的平台效应对起始模板量和最终产物量之间相关性的干扰。
- 专一性探针的优点是只有正确的扩增产物才能和用于定量的探针结合并产生荧光信号，这样就避免了假阳性污染，对于临床诊断等工作特别有效。但相对来说，合成萤光探针的价格较于昂贵，不利于小规模的实验检测；因此在研究型实验室还是以SYBR Green的非专一型qPCR为主要选择。

### 普及性

- 因为价格、耗材较贵的因素，qPCR多了光学配件及萤光物质的费用，在普及度上qPCR的机器较PCR机台少。

## 外部链接

- The Reference in qPCR - Academic & Industrial Information Platform
- MIQE: The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments
- RDML: Real-time PCR Data Markup Language
- 实时定量PCR中参照基因的选择