黄素腺嘌呤二核苷酸

黄素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，缩写：FAD），又称活性型维生素B2、核黄素-5'-腺苷二磷酸（Riboflavin-5'-adenosine diphosphate）。在生物化学中，该物质是一种与各种蛋白质相关并具有氧化还原活性的辅酶，参与代谢中的几种酶促反应。黄素蛋白是一种含有黄素组（黄素基团）的蛋白质，其形式可以是FAD或黄素单核苷酸 (FMN)。已知许多种黄素蛋白：琥珀酸脱氢酶复合体的成分、α-酮戊二酸脱氢酶和丙酮酸脱氢酶复合体的成分。FAD是一种比烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）更强的氧化剂，能被1个电子或2个电子途径还原。

FAD有两种常见的氧化态：完全氧化形态（FAD）和完全还原的二氢化形态（FADH2）。此外，还存在中间氧化态，包括黄素-N(5)-氧化物和半醌态。FAD在其完全氧化状态下，接受两个电子和两个质子，生成FADH2。半醌态 (FADH·) 可以通过FAD的还原或FADH2的氧化形成，前者接受一个电子，后者捐献一个质子。然而，某些蛋白质会生成并维持黄素辅因子的超氧化形式，即黄素-N(5)-氧化物。

## 历史

黄素蛋白于1879年在分离牛奶成分时首次被发现。由于其来源于牛奶且呈黄色，最初被称为乳色素（lactochrome）。科学界花了50年时间才在鉴定黄色素分子方面取得实质性进展。20世纪30年代，随着许多黄素和烟酰胺衍生物结构及其在氧化还原催化中的重要作用的发表，随后辅酶的研究领域应运而生。德国科学家奥托·瓦尔堡和沃尔特·克里斯蒂安（Walter Christian）于1932年发现了一种由酵母衍生的黄色蛋白质，是细胞呼吸所必需的。他们的同事胡戈·特奥雷尔将这种黄色酶分离成脱辅基酶和黄色素，并证明酶和色素本身都无法氧化还原型的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），但将它们混合在一起即可恢复活性。特奥雷尔于1937年证实这种色素是核黄素的磷酸酯，即黄素单核苷酸（FMN），这是酶辅因子存在的第一个直接证据。1938 年，瓦尔堡和克里斯蒂安通过类似的实验发现FAD是D-氨基酸氧化酶的辅助因子。瓦尔堡把烟酰胺与氢负离子（氢化物）转移联系起来的研究和黄素发现——这也为20世纪40年代和50年代的许多科学家发现大量的氧化还原生物化学反应，并将它们通过诸如柠檬酸循环和三磷酸腺苷合成等途径的联系铺平了道路。

## 特性

黄素腺嘌呤二核苷酸由两部分组成：腺嘌呤核苷酸（单磷酸腺苷）和黄素单核苷酸（FMN），它们通过磷酸基团连接在一起。腺嘌呤与环状核糖在核酸符号碳原子处结合，而磷酸盐则与核糖在5'碳处结合形成腺嘌呤核苷酸。核黄素由异咯嗪（isoalloxazine）和核糖醇之间的碳-氮键 (C-N) 形成。磷酸基团随后与末端核糖碳结合，形成黄素单核苷酸。由于异咯嗪和核糖醇之间的键不被认为是糖苷键，因此黄素单核苷酸并非真正的核苷酸。这使得二核苷酸名称具有误导性；然而，黄素单核苷酸组在结构和化学性质上仍然非常接近核苷酸。

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FAD可以通过添加2个H+和2个 e−还原为FADH2。FADH2也可以通过失去1个H+和1个e−而被氧化，形成FADH。FAD形式可以通过进一步失去1个H+和1个e−来重新生成。FAD也可以通过黄素-N(5)-氧化物的还原和脱水形成。根据氧化状态，黄素在水溶液中呈现特定的颜色。黄素-N(5)-氧化物（超氧化态）呈黄橙色，FAD（完全氧化）呈黄色，FADH（半还原）根据pH呈蓝色或红色，完全还原形式为无色。改变形态会对其他化学性质产生很大影响。例如，FAD的完全氧化形态容易受到亲核攻击，完全还原形式FADH2具有高极化性，而半还原形式在水溶液中不稳定。FAD是一种芳香环系统，而FADH2 则不是。这意味着FADH2的能量明显更高，但没有芳香结构提供的通过谐振的稳定作用。FADH2是一种携带能量的分子，因为一旦被氧化，它就会重新获得芳香性并释放出这种稳定所代表的能量。

FAD及其变体的光谱特性使得我们能够利用紫外-可见光谱和荧光光谱来监测反应。每种形式的FAD都有不同的吸收光谱，便于观察氧化状态的变化。在450nm处观察到FAD的主要局部吸光度最大值，消光系数为11,300M−1 cm−1。黄素在未结合时通常具有荧光活性（与黄素核酸衍生物结合的蛋白质称为黄素蛋白）。可以利用这一特性来检查蛋白质结合情况，观察结合状态下荧光活性的丧失。氧化黄素具有约450nm的高吸光度，并在约515—520nm处发出荧光。

## 化学状态

在生物系统中，FAD在其完全氧化形式下充当H+和e−的受体，在FADH形式下充当受体或供体，在还原FADH2形式下充当供体。下图总结了它可能经历的潜在变化。

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除了上述所见，FAD的其他反应形式也可以形成和消耗。这些反应涉及电子转移和化学键的形成／断裂。通过反应机制，FAD能够参与生物系统内的化学活动。下图描绘了 FAD可能参与的一些反应的一般形式。

机理1和2代表氢负离子的获得，其中分子获得相当于一个氢负离子的量。机理3和4代表自由基的形成和氢负离子的损失。自由基物质含有未配对的电子原子，化学性质非常活泼。氢负离子的损失是之前看到的氢负离子获得的逆过程。最后两种机理展示了亲核加成和使用碳自由基的反应。

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## 生物合成

FAD与另一种源自核黄素的分子黄素单核苷酸一起作为酶辅因子 发挥主要作用。细菌、真菌和植物可以产生核黄素，但其他真核生物，例如人类，已经失去了制造核黄素的能力。因此，人类必须从饮食来源中获取核黄素，也称为维生素B2。核黄素通常在小肠中被摄入，然后通过载体蛋白运输到细胞。核黄素激酶（EC 2.7.1.26）将磷酸基团添加到核黄素上，生成黄素单核苷酸（FMN），然后黄素单核苷酸腺苷酸转移酶将腺嘌呤核苷酸添加至黄素单核苷酸形成FAD。细菌通常具有一种双功能酶，但古菌和真核生物通常使用两种不同的酶。目前的研究表明，在胞质溶胶和线粒体中存在不同的蛋白异构体／同工型。据此看来看来FAD在两个地方都合成，并可能被运输到需要的地方。

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## 功能

黄素蛋白利用黄素部分独特而灵活的结构来催化复杂的氧化还原反应。由于黄素具有多种氧化还原状态，它们可以参与涉及一个或两个电子、氢原子或水合氢离子转移的过程。完全氧化的黄素环的N5和C4a也容易受到亲核攻击。黄素部分的这种多种多样的电离和修饰可归因于异咯嗪环系统和黄素蛋白在结合时剧烈扰乱黄素动力学参数的能力，包括黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）

基因组（黄素蛋白质组）中黄素依赖性蛋白质编码基因的数量因物种而异，范围从0.1%到3.5%，人类有90个黄素蛋白编码基因。FAD是黄素中更复杂、更丰富的形式，据报道可与75%的总黄素蛋白质组 以及84%的人类编码黄素蛋白结合。据报道，在多种培养的哺乳动物细胞系中，游离或非共价结合黄素的细胞浓度分别为FAD（2.2—17.0阿摩尔/细胞）和FMN（0.46—3.4阿摩尔/细胞）。

FAD的还原电位比氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）更高，是一种非常强的氧化剂。细胞利用这一点进行许多能量上困难的氧化反应，例如碳-碳键脱氢生成烯烃。FAD依赖性蛋白质在多种代谢途径中发挥作用，包括电子传递、DNA修复、核苷酸生物合成、脂肪酸的β-氧化、氨基酸分解代谢，以及其他辅因子（如辅酶A、辅酶Q10 和血红素组）的合成。一个众所周知的反应是柠檬酸循环（也称为三羧酸循环或克雷布斯循环）的一部分；琥珀酸脱氢酶（电子传递链中的复合体II）需要共价结合的FAD来催化琥珀酸氧化为富马酸，并将其与泛醌还原为泛醇相结合。氧化产生的高能电子通过将FAD 还原为FADH2暂时储存起来。然后，FADH2氧化为FAD，将其两个高能电子送入电子传递链；FADH2中的能量足以通过氧化磷酸化产生1.5个的三磷酸腺苷（ATP）。一些氧化还原黄素蛋白非共价结合FAD，如参与脂肪酸β-氧化的酰基辅酶A脱氢酶和氨基酸分解代谢的亮氨酸（异戊酰辅酶A脱氢酶）、异亮氨酸（短/支链酰基辅酶A脱氢酶）、缬氨酸（异丁酰辅酶A脱氢酶）和赖氨酸（戊二酰辅酶A脱氢酶）。调节代谢的FAD依赖性酶的其他例子是参与嘌呤核苷酸分解代谢的甘油-3-磷酸脱氢酶（甘油三酯合成）和黄嘌呤氧化酶。FAD在黄素蛋白中发挥的非催化功能包括作为结构作用，或参与调节生物钟的蓝光敏感光感受器以及生物发光细菌的发育和光的产生。

## 黄素蛋白

黄素蛋白以黄素单核苷酸（FMN）或FAD分子作为辅基，这些辅基可以紧密结合，也可以共价连接。只有约5—10%的黄素蛋白具有共价连接的FAD，但这些酶具有更强的氧化还原能力。在某些情况下，FAD可以为活性位点提供结构支撑或在催化过程中提供中间体的稳定性。根据现有的结构数据，已知的FAD结合位点可分为200多种类型。

人类基因组中编码了90种黄素蛋白；约84%需要 FAD，约16%需要FMN，而5种蛋白质需要两者同时存在。黄素蛋白由于其氧化还原能力而主要位于线粒体中。在所有黄素蛋白中，90%进行氧化还原反应，其余10%是转移酶、裂合酶、异构酶、连接酶。

### 碳杂原子键的氧化

#### 碳-氮键

单胺氧化酶（MAO）是一种被广泛研究的黄素酶，因其在去甲肾上腺素、血清素和多巴胺的分解代谢中具有重要的生物学意义。MAO氧化伯胺、仲胺和叔胺，这些胺在非酶促条件下从亚胺水解为醛或酮。尽管这类酶已被广泛研究，但其作用机制仍存在争议。目前已提出了两种机制：自由基机制和亲核机制。自由基机制的接受度较低，因为没有光谱或电子顺磁共振证据表明存在自由基中间体。亲核机制更受青睐，因为它得到了定点诱变研究的支持，该研究通过突变两个酪氨酸残基来增加底物的亲核性。

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#### 碳-氧键

葡萄糖氧化酶（GOX）催化β-D-葡萄糖氧化为D-葡萄糖酸-δ-内酯，同时还原酶结合的黄素。GOX以同型二聚体的形式存在，每个亚基结合一个FAD分子。晶体结构显示，FAD结合于二聚体界面附近的酶深层口袋中。研究表明，用8-羟基-5-碳-5-脱氮杂FAD取代FAD后，反应的立体化学取决于与黄素的右面（Re面）的反应。在转化过程中，观察到中性和阴离子半醌，这表明反应采用的是自由基机制。

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#### 碳-硫键

异戊二烯半胱氨酸裂解酶 (Prenylcysteine lyase，PCLase) 催化异戊二烯半胱氨酸 (一种蛋白质修饰) 的裂解，形成异戊二烯醛和蛋白质靶标上游离的半胱氨酸残基。FAD与PCLase以非共价键结合。目前关于黄素反应的机理研究并不多，但推测的机理如下所示。提出了从异戊烯基部分的C1到FAD的氢负离子转移，导致黄素还原为FADH2。COformED是一种由邻近硫原子稳定的碳正离子。FADH2随后与分子氧发生反应，还原被氧化的酶。

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### 碳-碳键

尿苷二磷酸（UDP）-N-乙炔醇丙酮酸葡萄糖胺还原酶 (UDP-N-acetylenolpyruvylglucosamine Reductase，MurB) 是一种酶，它催化还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）依赖性的还原反应，将烯醇丙酮酸-UDP-N-乙酰葡萄糖胺〔enolpyruvyl-UDP-N-acetylglucosamine〕（底物）还原为相应的D-乳酰化合物UDP-N-乙酰胞壁酸〔D-lactyl compound UDP-N-acetylmuramic acid〕（产物）。MurB是一个单体，含有一个FAD分子。在底物转化为产物之前，NADPH必须先还原FAD。一旦NADP+ 解离，底物就可以结合，还原的黄素就可以还原产物。

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### 硫醇/二硫化物化学

谷胱甘肽还原酶（GR）催化谷胱甘肽二硫化物 (GSSG) 还原为谷胱甘肽 (GSH)。GR需要FAD和NADPH来促进该反应；首先，氢负离子必须从NADPH转移到FAD。还原后的黄素可以作为亲核试剂攻击二硫化物，形成C4a-半胱氨酸加合物。该加合物消除后，形成黄素-硫醇盐电荷转移复合物。

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### 电子转移反应

催化单加氧酶（羟基化）反应的细胞色素P450型酶依赖于两个电子从FAD转移到P450。真核生物中存在两种类型的P450系统。位于内质网中的P450系统依赖于含有FAD和FMN的细胞色素P450还原酶（cytochrome P450 reductase，CPR）。还原型FAD（FADH2）上的两个电子一次一个地转移到FMN，然后单个电子从FMN传递到P450的血红素。

位于线粒体中的P450系统依赖于两种电子转移蛋白：一种是含有肾上腺铁氧还蛋白（adrenodoxin reductase，AR）的FAD，另一种是含有小铁硫基团的肾上腺素能蛋白（adrenodoxin）。FAD嵌入AR的FAD结合域中。AR的FAD被还原为 FADH2，这是通过从与AR的NADP结合结构域结合的NADPH转移两个电子实现的。该酶的结构高度保守，能够精确地维持电子供体NADPH和受体FAD的排列，从而实现高效的电子转移。还原型FAD中的两个电子一次一个地转移到肾上腺素能蛋白，后者又将单个电子捐赠给线粒体P450的血红素基团。

微粒体还原酶与线粒体P450系统还原酶的结构完全不同，并且没有同源性。

### 氧化还原

对羟基苯甲酸羟化酶（p-Hydroxybenzoate hydroxylase，PHBH）催化对羟基苯甲酸（p-hydroxybenzoate，pOHB）氧化为3,4-二羟基苯甲酸酯（3,4-dihyroxybenzoate，3,4-diOHB）；该反应需要FAD、NADPH和分子氧。NADPH首先将一个氢化物当量转移给FAD，生成FADH−，然后 NADP+从酶上解离下来。还原的PHBH然后与分子氧反应形成黄素-C(4a)-氢过氧化物。黄素氢过氧化物迅速羟基化pOHB，然后消除水以再生氧化黄素。另一种由黄素介导的氧合机制涉及使用黄素-N(5)-氧化物而不是黄素-C(4a)-(氢)过氧化物。

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### 非氧化还原

分支酸合酶 (CS) 催化莽草酸途径的最后一步——分支酸的形成。已知有两类分支酸合酶，它们都需要FMN，但对于是否需要NADPH作为还原剂存在分歧。提出的CS机制涉及自由基种类。在不使用底物类似物的情况下，自由基黄素种类在光谱上无法被检测到，这表明其寿命较短。然而，当使用氟化底物时，检测到了中性黄素半醌。

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### 复合体黄素酶

谷氨酸合酶催化2-酮戊二酸转化为L-谷氨酸，L-谷氨酰胺作为该反应的氮源。所有谷氨酸合成酶均由含有铁硫簇和FMN的铁硫黄素蛋白组成。谷氨酸合成酶根据其序列和生化特性分为三类。尽管这种酶有三类，但人们认为它们都通过相同的机制发挥作用，仅在于首先还原FMN的物质不同。该酶产生两个谷氨酸分子：一个由谷氨酰胺水解（形成谷氨酸和氨）产生，另一个由第一个反应中产生的氨攻击2-酮戊二酸，氨被FMN还原为谷氨酸。

## 临床意义

### 黄素蛋白相关疾病

由于黄素蛋白的重要性，大约60%的人类黄素蛋白发生突变会导致人类疾病也就不足为奇了。在某些情况下，这是由于对FAD或FMN的亲和力降低所致，因此过量摄入核黄素可能会减轻疾病症状，例如 戊二酸血症2型。此外，核黄素缺乏本身（以及由此导致FAD和FMN的缺乏）会导致健康问题。例如，在肌萎缩侧索硬化症患者中，FAD合成水平下降。这两种途径都会导致各种症状，包括发育或胃肠道异常、脂肪分解障碍、贫血、神经系统问题、癌症或心血管疾病、偏头痛、视力恶化和皮肤病变。因此，制药行业在某些情况下会生产核黄素来补充膳食。2008年，全球核黄素需求量为每年6000吨，产能为10000吨。这个价值1.5亿至5亿美元的市场不仅用于医疗应用，还用作农业行业动物饲料的补充剂和食品着色剂。

### 药物设计

随着细菌对常见抗生素的耐药性不断增强，抗菌药物的新型药物设计在科学研究中持续发挥着重要作用。一种利用FAD（复合物II）的特定代谢蛋白对细菌的毒力至关重要，因此靶向FAD的合成或构建FAD类似物可能是一个有用的研究方向。科学家已经确定了FAD结合后通常呈现的两种结构：伸展构象或蝴蝶构象，其中分子基本上折叠成两半，导致腺嘌呤和异咯嗪环堆叠。能够以类似方式结合但不允许蛋白质发挥作用的FAD模仿者（类似物）可能是抑制细菌感染的有效机制。或者，阻断FAD合成的药物也可以达到同样的目的；这一点尤其有趣，因为人类和细菌的FAD合成依赖于非常不同的酶，这意味着针对细菌FAD合酶的药物不太可能干扰人类FAD合酶。

### 光遗传学

光遗传学可以以非侵入的方式控制生物事件。近年来，该领域取得了许多进展，涌现出许多新工具，包括一些能够触发光敏感性的工具，例如利用蓝光的FAD结构域（Blue-Light-Utilizing FAD domains，BLUF）。BLUF编码一个100至140个氨基酸的序列，该序列源自植物和细菌的光感受器。与其他光感受器类似，光会导致BLUF域的结构变化，从而导致下游相互作用的中断。当前的研究调查了附加BLUF结构域的蛋白质以及不同的外部因素如何影响这些蛋白质。

### 治疗监测

人体内有许多具有天然荧光的分子，包括色氨酸、胶原蛋白、FAD、NADH和卟啉。科学家们利用这一点来监测疾病进展或治疗效果，或辅助诊断。例如，FAD和NADH的天然荧光在正常组织和口腔黏膜下纤维化中有所不同，这是侵袭性口腔癌的早期征兆。因此，与标准的活检相比，医生一直采用荧光来辅助诊断和监测治疗。

## FAD的氧化还原态

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在上面的反应中，左边是FAD，它通过得到2个电子转化为右边的FADH2。因此，FAD可起到一种传递质子（电子）的作用。

## FAD的意义

FAD广泛参与体内各种氧化还原反应，可促进糖、脂肪和蛋白质的代谢。同时FAD作为一种维生素B2衍生物，对维持皮肤、粘膜和视觉的正常机能均有一定的作用。特别是在细胞呼吸中拥有一定的地位。

## 与FAD有关的反应

- 三羧酸循环
- 甘油磷酸穿梭
- 电子传递链

## 参阅

- 黄素单核苷酸
- 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸
- 含黄素单加氧酶

## 外部链接

- 黄素腺嘌呤二核苷酸与蛋白质结合在蛋白质数据库（PDB）
- 黄素腺嘌呤二核苷酸 在美国国立卫生研究院（NIH）化学数据库中的条目

## 基本资料

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