基因治疗

基因治疗或基因疗法（gene therapy）是利用分子生物学方法将目的基因导入患者体内，使之操控基因表现或改变活细胞生物特性的基因产物，从而使疾病得到治疗，为现代医学和分子生物学相结合而诞生的新技术。基因治疗作为疾病治疗的新手段，它已有一些成功的应用，并且科学突破将继续推动基因治疗向主流医疗发展。

科学家尝试将基因直接植入人体细胞中，其中，重点关注一些由单基因缺陷引起的疾病，如囊肿性纤维化、血友病、肌肉萎缩症和镰状细胞性贫血。不过，由于携带大段DNA并将其置入基因组的正确的位置非常困难，这种技术没有得到普及。今天，大多数的基因治疗研究的目的都是弥补癌症和遗传疾病的基因缺陷或丢失。

科学家曾尝试用此方法去治疗严重复合型免疫缺乏症（Severe Combined Immunodeficiency，SCID），并得到一定的成果。基本原理是用已经被驯化了的病毒携带健康的基因，植入病人的细胞里，以此去修补本身有缺陷的基因。

应用肿瘤抑制基因（抑癌基因），对癌症进行靶向治疗，是基因治疗领域里重要的研究项目。目前应用较多的是p53抑瘤蛋白基因。

## 类型

### 种系基因疗法

在种系基因治疗的情况下，生殖细胞，即精子或卵子，通常依据功能基因被修改整合进入基因组中。因此，这种通过治疗后的改变可以遗传且能传给后代。这种新的方法，从理论上说，应该会对基因性疾病和遗传性疾病的对抗非常有效。然而，因为种种技术与伦理问题，许多司法管辖区禁止在人类身上应用这一治疗手段。

### 体细胞基因治疗

在体细胞基因治疗（Somatic gene therapy）的情况下，治疗基因转移到病人的体细胞。任何基因的修改和产生的效果将只体现在接受治疗的病人身上，并不会被病人的子女或后人继承，这主要与体细胞的性质与功能有关。

## 载体

### 病毒载体

病毒会与他们的宿主细胞结合，引入它们的遗传物质作为其宿主细胞复制循环的一部分。这种遗传物质包含病毒的基本信息，比如如何产生这些病毒的副本，如何破坏人体的正常生产机制以满足该病毒的需要。宿主细胞将执行这些指令并产生更多的病毒副本，以至于越来越多的正常细胞将受到感染。某些类型的病毒将自己的基因插入到宿主的基因组，但自己并不进入细胞；还有的病毒可以伪装成蛋白质分子穿透细胞膜进入细胞（例如腺病毒会被内吞到内体复合体从而进入细胞）。

病毒有两种类型的转化：裂解和溶源。裂解性病毒DNA插入后不久，在该病毒生长期中的裂解期，细胞裂解液中数目急剧增加的病毒会被释放，感染更多的细胞。溶源性病毒整合自己的DNA到宿主细胞DNA中，并可能在体内存活好几年才爆发。该病毒感染的宿主细胞也并不会造成身体伤害，直到被触发引起宿主细胞破裂，释放宿主细胞DNA来产生新的病毒。如SARS病毒和艾滋病毒就是溶源性病毒。一些科学家认为，如果他们找到其触发来源，他们将能够阻止整个身体不断复制该病毒。

慢病毒载体（Lentiviral vectors）是以慢病毒（Lentivirus，一种反转录病毒）为基础开发的，它能够修改细胞的核基因组，使某种基因达到永久表达；不过，载体也可以经过修改以防止其整合。在2018年之前，有18%的临床试验使用反转录病毒。Libmeldy则是一种用于治疗异染性脑白质退化症（MLD）的离体（ex vivo）干细胞疗法，它使用慢病毒载体，并于2020年获得欧洲药品管理局（EMA）的授权。

#### 反转录病毒

反转录病毒的遗传本质是RNA分子，而其宿主细胞的遗传物质是DNA。当反转录病毒感染宿主细胞，其RNA将与逆转录酶和整合酶共同作用，从而进入细胞。这种病毒的RNA分子必须反转录产生对应的DNA分子，才能与宿主细胞的遗传物质相结合。这种由一个RNA分子得到其对应DNA的过程称为反转录，反转录过程在病毒携带的逆转录酶作用下完成。此后，反转录产生的DNA必须纳入宿主细胞DNA分子中，此过程在整合酶作用下进行。此时宿主细胞已包含病毒的遗传物质，如果宿主细胞分裂，其后代都将包含病毒的遗传物质，但这些基因有时并不会及时表达。有时使用反转录病毒进行基因治疗会出现问题，整合酶会随机插入到宿主遗传物质中病毒基因组的任意位置，如果恰好在宿主细胞的一个正常基因的中间插入，正常基因将被破坏，称为插入突变；如果恰好插入的是调节细胞分裂的基因，那么插入后细胞分裂失控，即癌症可能发生。譬如使用逆转录病毒载体治疗的10例X连锁重度复合型免疫缺陷病(X-SCID)，患者中，有4例因载体整合在原癌基因LMO2等的附近，激活下游基因的表达而罹患白血病。但此问题最近开始得到解决，比如利用锌指核酸酶技术在干细胞的DNA的安全位点插入野生型珠蛋白基因，基因编辑后获得的含正常β-珠蛋白基因的干细胞分化形成的红细胞能表达正常的β-珠蛋白。

#### 腺病毒

腺病毒是以双链DNA为遗传物质的病毒。他们引起人类呼吸道、肠道、和眼睛感染（尤其是上呼吸道感染）。当这些病毒感染宿主细胞时，会将它们的DNA引入到宿主的DNA分子中。腺病毒遗传物质DNA分子在宿主细胞的核中自由存在，并像其他基因一样转录。唯一不同的是，这些基因在细胞分裂时不会复制，其后代细胞将不会有这种基因。这个载体系统已用于治疗癌症，并且第一个基因治疗产品即用于癌症的治疗。腺病毒Gendicine是以p53基因的腺病毒为基础的基因疗法，在2003年被中国食品监督局SFDA（现更名为国家食品药品监督管理总局CFDA）批准用于治疗头颈部癌症。关于腺病毒载体的担忧在1999年杰西基辛格（Jesse Gelsinger）死后被提出来予以重视。从那时起，利用腺病毒载体进行基因治疗的工作重点便被放在病毒的遗传学缺陷上。

#### 腺相关病毒

腺相关病毒，来自于parvovirus病毒家族，是拥有单链DNA的基因组的小型病毒。野生型腺相关病毒的遗传物质可以有近100％的准确性插入在19号染色体上的特定位点。但是，重组腺相关病毒，其中不包含任何病毒基因只有治疗基因，不整合到基因组中。相反，重组病毒在其两端通过ITR（末端反向重复）重组基因融合，形成圆环式可表达的基因组。同时这种病毒的利用也有一些缺点，其中包括可携带DNA及其少量（低容量），并且生产它存在难度。生产问题最近由Amsterdam Molecular Therapeutics得到解决。这类型的病毒正在使用阶段，但是，因为它不具有致病性（大多数人携带这种无害的病毒）。与腺病毒不同的是，与大多数腺相关病毒治疗的人不会建立一种免疫应答来清除它。腺相关病毒的试验仍在进行中或准备中，主要是用于治疗肌肉和眼部疾病，病毒似乎对于这两种组织特别有用。然而，临床试验也已展开腺相关病毒载体用于基因传递到大脑的实验。这是很可能的，因为腺病毒能够感染非分裂（静态）细胞，如它们的基因组中神经元长时间表达。

#### 病毒载体的蛋白质包被的假型化

上述的病毒载体具有天然宿主的细胞群，他们感染最有效。逆转录病毒的天然宿主细胞的范围有限，虽然腺病毒和腺相关病毒能够有效感染相对范围内的细胞，但某些细胞类型很难控制并驾驭这些病毒体。进入易感细胞是由病毒表面的蛋白包膜介导的。逆转录病毒和腺相关病毒有一个单一的蛋白质包被膜，而腺病毒有包膜蛋白和纤维共同交联于病毒表面。对这些病毒的包膜蛋白结合到每个细胞表面分子，如heparin sulfate，他们定位在潜在寄主的表面，像特定的蛋白质受体一样。进入潜在寄主需要宿主细胞表面蛋白与病毒表面蛋白很好的相互作用。根据基因治疗的目的，我们应该尽量控制细胞的易感性适中。为此，许多载体发展到 内源性病毒包膜蛋白已被其他病毒包膜蛋白或嵌合体蛋白所取代。这种嵌合体包含病毒蛋白必须的部分，可以协同进入寄主并且与宿主细胞蛋白相互作用。其中包膜蛋白病毒已被描述成pseudotyped viruses。例如，最流行的基因治疗试验中使用的逆转录病毒载体是lentivirusSimian免疫缺陷病毒包膜蛋白-G蛋白，来自Vesicular stomatitis virus。

#### 顺式反式作用元件

复制缺陷型载体始终包含一个“传输结构”。它携带那些对基因功能执行相关的基因序列，包装序列，复制和在必要时启动反转录。这些均是顺式作用元件。反式作用元件是病毒性的元素，它可以在不同的DNA分子进行编码。例如，病毒结构蛋白可以从不同的基因组元件进行表达。

#### 单纯疱疹病毒

单纯疱疹病毒是一种人类嗜神经病毒。这主要是研究基因在神经系统的传递。野生型HSV - 1的病毒能够感染细胞。受感染的神经元都没有能够对抗的免疫系统。虽然没有转录病毒潜伏明显，它具有神经元特异性启动子，可以继续正常工作。单纯疱疹病毒抗体- 1比较常见，但疱疹病毒感染的并发症很罕见。

### 非病毒方法

非病毒的方法比某些病毒方法更有优势，因为其大规模生产的简单工艺和低免疫原性。在此之前，转染和基因表达水平低的缺点是非病毒基因治疗十分困难。然而，在载体技术的最新进展下，这种手段与病毒式治疗异曲同工。

#### 裸露DNA

这就是非病毒转染的最简单方法。临床试验已成功进行了一些裸露DNA质体的肌肉注射，但是相比其他的转染方法，其表达非常低。除了质体实验，naked PCR的试验也有开展并取得一定的成功。这一成功为更有效的方法提供可能，诸如电穿孔仪（electroporation）、声孔作用（sonoporation）还有基因枪的应用，其中利用高压气体击中包覆DNA的金粒子进入细胞。

#### 寡核苷酸

合成的寡核苷酸的用途是灭活疾病过程有关的基因。其中有几种方法达到这一目的。将目的基因antisense达到破坏基因转录的目的。另一种小分子RNA称siRNA，利用它来标记细胞，在mRNAh缺陷基因转录中分开特定的序列，从而打断缺陷mRNA的表达，即基因的表达。还有一种更优方法，使用双链寡核苷酸作为转录因子激活靶基因的转录。转录因子结合，而不是有缺陷的基因，从而降低了目的基因的转录，降低表达。此外，单链寡核苷酸DNA已被用来指导一个突变基因的单碱基改变。寡核苷酸介导的基因修复，有针对性的基因修复，或有针对性的核苷酸改变成为热点。

#### Lipoplexes和polyplexes

为了提高新的DNA进入细胞内，DNA必须得到保护，免受损害，其进入细胞必须提供便利。为此新的分子lipoplexes和polyplexes，已经成功创建，有能力保护降解过程中的DNA转染。质体DNA可包被脂质，形态有胶束或脂质体。当结构物质复合DNA的成为lipoplex。有三种类型的脂质，阴离子（负电荷），中性，或阳离子（带正电）。起初，阴离子和中性脂质被用于建立lipoplexes来合成载体。然而，在事实的，很少有与他们相关的毒性，它们与体液兼容，但根据组织特异性可适应也有可能，阳离子脂质，由于其正电荷，首次使用带负电荷的DNA分子凝聚，以促进脂质体DNA导入的封装。后来人们发现，利用阳离子脂质显著提高了lipoplexes稳定。另外由于他们负责的结果，阳离子脂质体与细胞膜相互作用，内吞作用被广泛认为是主要路线，使细胞吸收lipoplexes。内涵体的形成，作为内吞作用的结果，但是，如果破坏细胞质内体膜释放基因仍不能成功，它们将被溶酶体消化。有人还发现，虽然可以浓缩阳离子脂质和脂质体封装到的DNA，但由于能力在“内体逃离”方面的不足，转染效率非常低。然而，当助手脂类（通常电中性脂肪，如涂料）分别加入，形成lipoplexes，可以观察到更高的转染效率。后来，有人想出了某些脂类有能力颠覆内体膜，以便DNA逃脱从内体，因此那些被称为脂质膜融合脂质。虽然阳离子脂质体载体已被广泛用作传递一种替代基因，阳离子脂质剂量依赖性毒性也可能会限制他们的治疗用途。lipoplexes的使用最普遍的基因已经被转移到癌细胞，其中所提供的基因在细胞中激活肿瘤抑制基因的控制，降低致癌基因的活性。最近的研究表明lipoplexes可用于治疗遗传性疾病如囊性纤维化呼吸。DNA复合物与聚合物被称为polyplexes。

### 混合方法

由于每一个基因转移方法都是有缺陷的，开发有两个或两个以上相结合的混合方法的一些技术会更有效。譬如Virosomesare结合脂质体灭活艾滋病病毒或流感病毒，这已被证明具有更有效的转移方法，位于呼吸道上皮细胞相比于比任何单独的病毒或脂质体。其他方法包括与orhybridising病毒混合阳离子脂质与其他病毒载体。

## 延伸阅读

- Tinkov, S., Bekeredjian, R., Winter, G., Coester, C., Polyplex-conjugated microbubbles for enhanced ultrasound targeted gene therapy, 2008 AAPS Annual Meeting and Exposition, 16–20 November, Georgia World Congress Center, Atlanta, GA, USA,

## 外部链接

- Gene Therapy: Molecular Bandage? University of Utah's Genetic Science Learning Center
- The American Society of Gene & Cell Therapy
- The European Society of Gene & Cell Therapy
- Research Group at Cambridge, UK working on overcoming current hurdles to successful gene therapy
- Council for Responsible Genetics
- Molecular Medicine and Gene Therapy at Lund University
- Gene Therapy Frees β-Thalassemia Patient From Transfusions
- Clinical Trial at Sloan Kettering
- Stem Cell Therapy Trial Offers Hope