空間轉錄組學

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空間轉錄組學（Spatial Transcriptomics）或稱空間分辨轉錄組學（Spatially Resolved Transcriptomics），是一種在完整組織內捕獲轉錄活性位置背景的方法。空間轉錄組學的歷史前身是原位雜交（in situ hybridization），而現代的組學術語指的是測量細胞中所有的mRNA，而非選擇特定的RNA靶標。它是空間生物學的重要組成部分。

空間轉錄組學包含的方法可分為兩種模式：基於下一代測序的基因檢測方法，以及基於成像的方法。解析轉錄本空間分布的一些常見方法包括顯微切割技術、螢光原位雜交方法、原位測序、原位捕獲方案和電腦模擬（in silico）方法。

## 歷史

原位雜交技術在20世紀60年代末由約瑟夫·G·加爾和Mary-Lou Pardue開發，並在20世紀80年代隨著單分子FISH（smFISH）的出現，以及2010年代隨著RNAscope、seqFISH、MERFISH和osmFISH、seqFISH+以及DNA顯微鏡的出現取得了重大發展。顯微切割技術最早於20世紀90年代末（雷射捕獲顯微切割）開發，並於2013年在Michael Eisen實驗室中使用果蠅胚胎與RNA-seq分析相結合。

空間基因組學作為一項技術（現在被稱為空間轉錄組學），是由Michael Doyle（Eolas公司）、Maurice Pescitelli（伊利諾伊大學芝加哥分校）、Betsey Williams（哈佛大學）和George Michaels（喬治·梅森大學）在20世紀90年代發起的，作為可視胚胎項目（Visible Embryo Project）的一部分。Doyle及其共同研究人員描述了一種稱為基因組活性空間分析（Spatial Analysis of Genomic Activity, SAGA）的方法。

這一空間索引概念在2016年被瑞典斯德哥爾摩的Jonas Frisén、Joakim Lundeberg、Patrik Ståhl及其同事進一步擴展。2019年，首批空間轉錄組學商業平台問世，包括NanoString Technologies推出的GeoMx數字空間輪廓分析儀（DSP）以及10x Genomics推出的Visium。同年，在博德研究所，Fei Chen和Evan Macosko的實驗室開發了Slide-seq，該技術使用了附著在微珠上的條形碼寡核苷酸。

## 應用

明確mRNA分子的空間分布有助於檢測組織、腫瘤和免疫細胞中的細胞異質性，以及確定轉錄本在各種條件下的亞細胞分布。這些資訊為破譯組織和單個細胞內的細胞及亞細胞結構提供了獨特的機會。這些方法在胚胎學、腫瘤學、免疫學、神經科學、病理學和組織學領域提供了至關重要的見解。多細胞生物中單個細胞的功能，只有在識別其在體內的確切位置的背景下才能得到完全的解釋。空間轉錄組學技術旨在以這種方式闡明細胞的特性。下文將闡述這些將基因表達與細胞空間組織聯繫起來的方法。

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## 顯微切割

### 雷射捕獲顯微切割

雷射捕獲顯微切割（Laser capture microdissection，LCM）能夠在不引起形態改變的情況下捕獲單細胞。它利用與組織切片貼合的透明乙烯-乙酸乙烯酯薄膜和低功率紅外雷射束。當這樣的光束對準目標細胞時，目標區域正上方的薄膜會暫時熔化，使其長鏈聚合物覆蓋並緊緊捕獲細胞，接著移除切片，目標細胞保留在薄膜中。該方法允許對檢索到的細胞進行進一步的RNA轉錄譜分析和cDNA文庫構建。

### 單個冷凍切片的RNA測序

選定區域單個冷凍切片的RNA測序是另一種能夠產生基於位置的全基因組表達數據的方法。該方法在不使用雷射捕獲顯微切割的情況下進行。它首次被用於確定冷凍切片果蠅胚胎中基因表達的全基因組空間模式。基本上，它意味著只需對樣品選定區域的文庫進行簡單製備。由於每個切片中的總RNA量很少，導致材料損失，該方法在從每個切片獲取高質量RNA-seq文庫時遇到困難。這個問題通過在初始RNA提取後向每個管中添加遠緣果蠅物種的RNA得到了解決。

### GeoMx

GeoMx數字空間輪廓分析儀（DSP）（NanoString Technologies）是第一款開發用於存檔福馬林固定石蠟包埋（FFPE）組織切片中RNA和蛋白質空間分析的自動化商業儀器。由於能夠長期保存組織結構，FFPE是病理學和組織學領域的常見樣本類型。GeoMx DSP技術的核心在於使用者能夠基於組織學結構、功能區室和細胞類型進行「顯微切割」。然而，與LCM不同，基因表達分析是通過光以非破壞性方式進行的，這得益於工程化到原位雜交探針中的紫外光可切割條形碼。為此，顯微鏡載玻片上的組織切片用螢光抗體和核染料進行染色，以便在DSP儀器上以單細胞解析度可視化整個組織切片。感興趣區域的選擇通過基於螢光信號強度的自動分割或繪圖工具（包括幾何或徒手形狀）進行。每個感興趣區域被精確暴露在紫外光下，條形碼被切割、收集並用於識別組織中存在的RNA或蛋白質。定義的感興趣區域大小可以在十到六百微米之間變化，允許包含組織學樣本中的多種結構和細胞。GeoMx DSP可以在空間上解析和測量人類或小鼠的整個轉錄組，超過1200種蛋白質，或在同一載玻片協議中進行RNA和蛋白質的多組學分析。

### TIVA

TIVA（Transcriptome in vivo analysis）是一種在完整活體組織切片中捕獲活體單細胞內mRNA的技術。它使用光激活標籤。TIVA標籤具有幾個功能基團和一個與生物素偶聯的捕獲聚(U)寡核苷酸，與標籤相鄰的二硫鍵連接肽使其能夠穿透細胞膜。一旦進入細胞內部，即可使用雷射光激活來解阻滯目標細胞中的聚(U)寡核苷酸，以便TIVA標籤與細胞內的mRNA雜交。然後，利用鏈霉親和素捕獲生物素基團來提取結合到未受阻標籤上的聚(A)尾mRNA分子，之後通過RNA測序對這些mRNA進行分析。該方法受到低通量的限制，因為一次只能處理少數幾個單細胞。

### tomo-seq

作為上述單個冷凍切片RNA測序的高級替代方案，RNA斷層掃描（tomo-seq）具有更好的RNA定量和空間解析度。它也基於組織冷凍切片以及隨後的單個切片RNA測序，產生全基因組表達數據並保留空間資訊。在該方法中，由於個體組織切片中cDNA的線性擴增，省略了載體RNA的使用。相同的樣品在不同方向上進行切片，然後使用重疊數據進行3D轉錄構建。總體而言，該方法意味著需要對每個切片使用相同的樣本，因此無法應用於臨床材料的處理。

### LCM-seq

LCM-seq結合了雷射捕獲顯微切割（LCM）和Smart-Seq2 RNA測序，適用於單細胞水平，甚至可用於部分降解的組織。其工作流程包括組織冷凍切片，隨後進行雷射捕獲顯微切割，其中細胞被直接收集到裂解緩衝液中，無需RNA分離即可生成cDNA，這既簡化了實驗程序，又降低了技術噪音。由於在LCM過程中記錄了每個細胞的位置身份，在對相應的cDNA文庫進行RNA測序後，可以推斷出每個細胞的轉錄組到其分離的位置。LCM-seq已應用於多種細胞類型以了解其內在特性，包括動眼神經元、面部運動神經元、舌下運動神經元、脊髓運動神經元、紅核神經元、中間神經元、多巴胺神經元和軟骨細胞。

### Geo-seq

Geo-seq是一種同時利用雷射捕獲顯微切割和單細胞RNA測序程序來確定約十個細胞大小的組織區域中轉錄組空間分布的方法。其工作流程涉及去除和冷凍切片組織，然後進行雷射捕獲顯微切割。然後裂解提取的組織，純化RNA並反轉錄成cDNA文庫。對文庫進行測序後，轉錄組譜可以映射回被提取組織的原始位置。該技術允許用戶定義組織中的感興趣區域，提取所述組織並以靶向方法繪製轉錄組圖。

### NICHE-seq

NICHE-seq方法使用光激活螢光標記物和雙光子雷射掃描顯微鏡為生成的轉錄組提供空間數據。被螢光標記物結合的細胞被光激活、解離，並通過螢光激活細胞分選（FACS）進行分選。這為僅標記的光激活細胞提供了分選特異性。分選後，單細胞RNA測序生成可視化細胞的轉錄組。該方法可以在特定生態位（niche）內處理數千個細胞，代價是丟失生態位內細胞之間的空間數據。

### ProximID

ProximID是一種基於對提取的組織進行單細胞迭代微消化（micro digestion）的方法。初始的溫和消化步驟保留了微小的相互作用結構，這些結構在繼續消化之前被記錄下來。然後將單細胞從每個結構中分離出來並進行sc-RNAseq，並使用t-分布隨機鄰域嵌入進行聚類。基於微消化前的相互作用結構，可將聚集的細胞映射到物理相互作用上。雖然該技術的通量相對較低，但它為數據集提供了細胞間物理相互作用的資訊。

## 螢光原位雜交

### CosMx

CosMx空間分子成像儀（NanoString Technologies）是第一個高多重原位分析平台，能夠在細胞和亞細胞解析度下利用福馬林固定石蠟包埋（FFPE）和新鮮冷凍（FF）組織樣本提供空間多組學數據。它能夠快速量化和可視化直至全轉錄組 以及64種經驗證的蛋白質分析物，並且是一個靈活的、具有空間解析度的 單細胞成像 平台，可用於細胞圖譜繪製、組織表型分析、細胞-細胞相互作用、細胞過程和生物標誌物發現。

### smFISH

單分子螢光原位雜交（single-molecule fluorescent in situ hybridization，smFISH）是首批能夠實現單細胞空間分辨RNA分析的技術之一。它採用了結合有5個螢光基團的短序列（50鹼基對）寡核苷酸探針，這些探針可以結合特定的轉錄本，在樣本中產生亮點。對這些斑點的檢測提供了有關細胞中某些基因表達的定量資訊。然而，使用標有多個螢光基團的探針面臨著自猝滅、雜交特性改變以及合成和純化等挑戰。

後來，該方法得到了改進，將上述探針替換為20 bp長的探針，僅連接一個螢光基團，並串聯地與感興趣的mRNA序列互補，這意味著它們將集體結合到目標mRNA上。單個此類探針本身不會產生強信號，但聚集探針的累積螢光將顯示出一個亮點。由於錯誤結合的單個探針不太可能共定位，因此該方法中的假陽性信號受到限制。

因此，這種原位雜交（ISH）技術通過直接對單細胞中的單個RNA分子進行成像，發現RNA表達的空間定位。

### RNAscope

另一種名為RNAscope的原位雜交技術採用特定Z形探針設計，可同時放大雜交信號並抑制背景噪聲。它允許在各種細胞類型中可視化單個RNA。RNAscope的大多數步驟與經典的ISH協議相似。將組織樣本固定到載玻片上，然後用滲透細胞的RNAscope試劑進行處理。Z探針的設計方式是，只有當它們成對結合到靶序列時才有效。這允許該方法的另一個元件（前置放大器）連接到Z探針的頂部尾端。一旦附著，前置放大器就充當其他元件（放大器）的結合位點，放大器繼而與另一種探針（標記探針）結合。結果，在目標序列上形成了一個龐大的結構。最重要的是，前置放大器無法結合單一的Z探針，因此非特異性結合不會導致信號發射，從而消除了開頭提到的背景噪音。

### seqFISH

順序螢光原位雜交（Sequential fluorescence in situ hybridization，seqFISH）是另一種直接在單細胞中識別mRNA並保留其空間背景的方法。該方法通過多輪進行；每一輪都包括螢光探針雜交、成像和隨後的探針剝離。在每一輪中，為不同的基因分配不同的顏色，從而產生唯一的時間條形碼。因此，seqFISH通過連續的顏色代碼（如紅-紅-綠）來區分mRNA。然而，這項技術也有其缺陷，如自發螢光背景，且由於每一輪中使用的探針數量較多導致成本較高。

### MERFISH

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由於不同顏色通道的數量較少，傳統的FISH方法在可同時分析的基因數量上受到限制，多重防錯FISH的設計就是為了克服這一問題。多重防錯FISH（Multiplexed Error-Robust FISH，MERFISH）通過在多輪雜交中採用二進位代碼基因標記，大大增加了單細胞中可同時成像的RNA種類數量。這種方法使用能夠檢測並糾正錯誤的編碼方案，可以一次測量140種RNA。核心原理在於通過結合數個連續雜交輪次的信號並在多輪雜交中為感興趣的基因分配N位二進位條形碼來識別基因。該代碼依賴於特定探針，包含「1」或「0」值，且每個基因的組合設定各不相同。通過使用六位或更長的代碼，且其中任意兩個代碼至少有3位不同，可以避免錯誤。為每種RNA生成一個特定的探針。每個探針是一個特異性針對靶標的寡核苷酸，由20-30個鹼基對組成，在穿透細胞後與mRNA序列互補結合。然後，多輪雜交進行如下：對於每一輪，僅加入在相應二進位代碼位置上包含「1」的探針。在每一輪結束時，使用螢光顯微鏡定位每個探針。如預期那樣，只有那些在指定位置帶有「1」的mRNA會被捕獲，然後對照片進行光漂白並加入新的子集。因此，我們檢索到二進位值的組合，從而能夠區分眾多RNA物種。

### smHCR

基於雜交鏈式反應進行深度單分子RNA檢測（Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction，smHCR）是一種先進的seqFISH技術，可以克服厚實和不透明組織樣本中常見的自發螢光背景問題。在該方法中，多個讀出探針與mRNA的目標區域結合。目標通過一組在定義的子序列中附著於其上的短DNA探針來檢測。每個DNA探針攜帶相同HCR放大器的引發劑。然後，螢光團標記的DNA HCR髮夾結構穿透樣本並組裝成附著在起始探針上的螢光放大聚合物。在多重研究中，使用上述相同的兩階段協議：就像所有的HCR放大器一樣，所有探針組同時引入；然後使用光譜上不同的螢光團進行進一步成像。

### osmFISH

osmFISH（Cyclic-ouroboros smFISH）是smFISH的一種改良，旨在克服光學擁擠的挑戰。在osmFISH中，首先可視化轉錄本，獲取圖像後剝離探針，並用不同的螢光探針可視化新的轉錄本。在連續的輪次後，編譯圖像以查看RNA的空間分布。由於轉錄本是依次被可視化的，它消除了信號相互干擾的問題。這種方法允許用戶生成比其他相關技術更大組織切片的高解析度圖像。

### ExFISH

擴張FISH（Expansion FISH，ExFISH）利用膨脹顯微鏡技術實現對RNA位置的超解析度成像，即使在厚標本（如腦組織）中也是如此。它支持單分子和多重讀出。

### EASI-FISH

擴展輔助迭代螢光原位雜交（Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization，EASI-FISH）對ExFISH進行了優化和拓展，提高了檢測精度，並在比以前可能更厚的樣品（300 μm）中實現了穩健的多輪處理。它還包含一條易用型計算分析流水線。

### seqFISH+

SeqFISH+通過後續幾輪的螢光解決了與空間擁擠相關的光學問題。首先，初始探針退火結合到目標mRNA上，隨後的探針再結合到初始探針的側翼區域，從而產生獨特的條形碼。每個讀出探針被捕獲為圖像，並摺疊合併成超解析度圖像。該方法允許用戶一次靶向多達一萬個基因。

### DNA顯微鏡

DNA顯微鏡（DNA microscopy）是一種獨特的無光學成像方法，用於分子位置映射，並在幾個連續的原位反應中同時保留測序數據。首先，固定細胞併合成cDNA。隨機化的核苷酸然後在原位標記靶向cDNA，為每個分子提供獨特的標籤。被標記的轉錄本在第二次原位反應中被擴增，恢復的拷貝被連接在一起，並加入新的隨機核苷酸。每次連續的連接事件都被標記，從而產生獨特的事件標識符。隨後，算法根據由獲得的連接序列解碼的分子近似度生成原始轉錄本的圖像，同時記錄靶標的單核苷酸資訊。

## 原位測序

### 使用鎖式探針的ISS

ISS padlock方法基於鎖式探針/掛鎖探針（padlock probing）、滾環擴增（RCA）以及連接測序（sequencing by ligation chemistry）。在完整的組織切片內，mRNA被逆轉錄為cDNA，隨後由RNase H進行mRNA降解。接下來，該方法可以通過兩種方式進行。第一種方式，即間隙靶向測序（gap-targeted sequencing），涉及掛鎖探針結合到cDNA上，探針兩端之間留有間隙，這些間隙是以連接測序為靶標的。然後通過DNA聚合作用填補這個間隙，並通過DNA連接酶創建一個DNA環。另一種方式，即條形碼靶向測序（barcode-targeted sequencing），僅通過連接將帶有條形碼序列的掛鎖探針進行DNA環化。在這兩種方法中，末端被連接形成一個DNA環。接著通過RCA進行靶標擴增，產生微米級的RCA產物（RCPs）。RCA由掛鎖探針序列的重複片段組成。隨後，這些DNA分子接受連接測序，根據版本的不同，解碼填補間隙的序列或相鄰末端探針內最長四鹼基的條形碼。無間隙變體聲稱靈敏度更高，而間隙填補變體則意味著讀出轉錄本實際的RNA序列。後來，該方法通過微流控平台的自動化，並以雜交測序（sequencing by hybridization）技術替代連接測序得到了改進。

### FISSEQ

螢光原位測序（Fluorescent in situ sequencing，FISSEQ）與ISS padlock類似，是一種使用逆轉錄、滾環擴增和連接測序技術的方法。它允許在固定細胞中進行空間轉錄組分析。首先，使用常規鹼基和修飾的氨基鹼基以及帶標籤的隨機六聚體RT引物，將RNA逆轉錄為cDNA。氨基鹼基介導cDNA與其細胞周圍環境的交聯。然後通過連接使cDNA環化，並通過RCA進行擴增。結果獲得了直徑為200–400 nm的單鏈DNA納米球。因此，這些納米球包含cDNA序列的眾多串聯重複。然後通過SOLiD連接測序進行測序。如前所述，逆轉錄產物和克隆擴增的RCPs的位置均通過與細胞基質組分的交聯來維持，從而在細胞內創建一個3D原位RNA-seq文庫。一旦與具有不同顏色的螢光探針結合，擴增子就會變得高度螢光，從而允許對信號進行視覺檢測；然而，圖像處理演算法依賴於與參考序列的讀段比對，而非信號強度。

### Barista-seq

條形碼原位靶向測序（Barcode in situ targeted sequencing，Barista-seq）是對間隙掛鎖探針方法的改進，在效率上提高了五倍，讀取長度增加了十五個鹼基，併兼容illumina測序平台。該方法同樣使用掛鎖探針和滾環擴增，但與間隙掛鎖方法不同，這種方法採用合成測序法和交聯。在相同程序中與細胞基質的交聯與FISSEQ相同。

### STARmap

空間分辨轉錄本擴增子讀出映射（Spatially-resolved transcript amplicon readout mapping，STARmap）利用帶有一個額外引物的掛鎖探針，允許直接擴增mRNA，免去了逆轉錄的需要。與其他基於掛鎖探針的方法類似，通過滾環擴增進行放大。DNA擴增子經過化學修飾並嵌入細胞內聚合的水凝膠中。捕獲的RNA然後可以在原位進行測序，提供每個細胞內mRNA的三維位置資訊。

## 原位捕獲

### Stereo-seq (STOmics)

STOmics通過其專有的空間增強解析度組學測序（Stereo-seq）技術，是推進空間分辨轉錄組學分析的先驅。

它結合了原位捕獲和DNB-seq。DNB測序基於用於原位測序的平版刻蝕晶片（圖形化陣列）。與其他微米級別的原位捕獲技術不同，標準DNB晶片具有直徑約220 nm的斑點，中心距為500 nm，每10毫米線性距離可為組織RNA捕獲提供多達20000個斑點，即每1平方厘米有4 × 108個斑點。因此，STOmics可以表現出比其他原位捕獲技術更高的解析度和更寬的視野。

### 空間轉錄組學（技術）

第一個被廣泛採用的方法由Ståhl等人在2016年發表於Science雜誌的一篇里程碑論文中描述，該論文創造了「空間轉錄組學」一詞。這種方法依賴於mRNA從新鮮冷凍組織切片中擴散出來，通過與附著在玻璃載玻片上的oligo(dT)序列雜交來捕獲被多聚腺苷酸化的mRNA。玻璃載玻片上排列有「斑點」（spots），這些斑點包含用於捕獲mRNA轉錄本的oligo(dT)序列、用於指示在陣列載玻片上x和y位置的空間條形碼序列、用於生成序列文庫的擴增和測序柄，以及用於量化轉錄本豐度的唯一分子標識符。冷凍組織樣本使用冷凍切片機切割，然後被固定、染色並小心地平鋪在微陣列上。接下來，酶促通透性處理允許RNA分子擴散到微陣列載玻片上，使被多聚腺苷酸化的mRNA分子與oligo(dT)序列尾部雜交。隨後原位進行逆轉錄以合成第一鏈。結果，合成了具有空間標記的cDNA，提供了有關組織切片確切位置的基因表達資訊。利用cDNA，可以生成用於短讀長測序的文庫。總之，該空間轉錄組學協議結合了對同一樣本的並行測序和染色。在下游分析中，生物資訊學工具允許將組織圖像與基因表達進行疊加。輸出結果是一張在組織切片內捕獲到基因表達的轉錄組圖譜。必須指出的是，第一代陣列載玻片包含約1,000個直徑為100微米的斑點，將其解析度限制在每個斑點~10-40個細胞。

這項技術是一家於2012年成立、名為「Spatial Transcriptomics」的公司的基礎。2018年，10X Genomics收購了Spatial Transcriptomics，作為10X Visium平台的基礎。

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### Slide-seq

Slide-seq依賴於將結合RNA、帶有DNA條形碼的微珠附著在塗有橡膠的玻璃蓋玻片上。這些微珠通過SOLiD測序被映射至它們的空間位置。將組織切片轉移到這個蓋玻片上以捕獲提取的RNA。被捕獲的RNA進行擴增和測序。轉錄本的定位是由捕獲該轉錄本的微珠上的條形碼寡核苷酸序列決定的。

### APEX-seq

APEX-seq允許評估細胞不同區域的空間轉錄組。該方法利用在活細胞中表達的APEX2基因，這些活細胞與生物素-酚和過氧化氫一起孵育。在這些條件下，APEX2酶催化將生物素基團轉移到RNA分子上，然後這些分子可以通過鏈霉親和素磁珠（streptavidin bead purification）進行純化。隨後純化後的轉錄本被測序，以確定哪些分子與生物素標記酶緊密相鄰。

### HDST

高畫質晰度空間轉錄組學（High-Definition Spatial Transcriptomics，HDST）首先解碼玻璃載玻片孔中mRNA捕獲微珠的位置。這是通過順序雜交到每個微珠的條形碼寡核苷酸序列來完成的。一旦解碼了每個微珠的位置，就可以將組織樣本放置在載玻片上並進行滲透處理。然後對捕獲的轉錄本進行測序。HDST使用比Slide-seq更小的微珠，因此可以在兩微米的空間解析度上進行解析，而Slide-seq則為十微米。

### 10X Genomics Visium

10X Genomics Visium測定法是空間轉錄組學測定法更新且改進的版本。它同樣利用玻璃載玻片表面的點陣列mRNA捕獲探針，但增加了斑點數量、最小化了斑點尺寸，並增加了每個斑點的捕獲探針數量。在Visium空間基因表達載玻片的四個捕獲區域內，每個區域大約有5000個帶條形碼的斑點，而這些斑點進而包含數百萬個帶空間條形碼的捕獲寡核苷酸。組織mRNA在滲透化處理後被釋放，並結合到帶條形碼的寡核苷酸上，從而能夠捕獲基因表達資訊。每個帶條形碼的斑點直徑為55 μm，從一個斑點中心到另一個斑點中心的距離約為100 μm。這些斑點交錯排列，以最大限度地減小它們之間的距離。平均而言，每個斑點捕獲來自1至10個細胞的mRNA，這提供了接近單細胞的解析度。

### Takara Bio SEEKER

該 測定法在概念上類似於10X Genomics Visium，但具有更高的斑點密度。與10X Genomics Visium HD（該方法使用的是針對人或小鼠等物種預定義的RNA探針）相反，SEEKER具有類似的密度和解析度，但能夠對任何新鮮冷凍組織樣本進行測定，它利用了樣本中所有mRNA的poly-A接頭進行測序。

## 電腦模擬構建

### 使用ISH進行重建

電腦模擬ISH空間重建（in silico Spatial Reconstruction with ISH）是指根據細胞的表達譜對其位置進行計算式空間重建。存在數種基於該原理的類似方法。它們共同分析相同細胞類型的單細胞轉錄組學以及可用的基於ISH的基因表達圖譜。根據這些數據，細胞隨後被分配到組織中的位置。顯然，該方法受限於ISH參考數據的可用性這一因素。此外，當在複雜的組織中分配細胞時，它會變得更加複雜。由於缺乏配對的參考資料，這種方法不適用於臨床樣本。報告的在腦組織中細胞精確分配的成功率為81%。

### DistMap

使用Distmap演算法映射轉錄組需要高通量的單細胞測序以及目標組織現存的原位雜交圖譜。Distmap算法利用測序細胞的轉錄組和上述參考圖譜生成目標組織的虛擬3D模型。可使用t-分布隨機鄰域嵌入將轉錄組聚類到不同的細胞類型中，並使用虛擬原位雜交將其映射到3D模型上。基本上，該演算法獲取解離組織中產生的單細胞數據，並能夠使用虛擬原位雜交將單個轉錄本映射到該細胞類型在組織中的位置。