免疫標記

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免疫標記是一種生化方法，用於檢測並定位細胞、組織或器官內特定部位的抗原。抗原通常是有機分子，多為蛋白質，能夠與抗體特異性結合。通過將抗原特異性抗體與一種檢測手段（即「標記」）結合，抗原即可被可視化，該「標記」通常通過共價鍵連接在抗體上。當免疫標記用於揭示細胞或其亞結構相關資訊時，這一過程稱為免疫細胞化學（immunocytochemistry）；若用於較大組織結構，則稱為免疫組織化學。

在製備用於免疫標記的抗體過程中，存在兩個複雜步驟：首先，需要獲得能與目標抗原特異結合的抗體；其次，是將標記物與抗體連接。由於幾乎不可能為所有抗原特異性抗體逐一結合標記，因此大多數免疫標記採用間接檢測方法。在這種方法中，首先使用能特異識別抗原的一抗，然後再使用與標記物結合的二抗，該二抗能夠特異性識別並結合一抗。通過這種方式，二抗可以實現規模化生產並商品化供應。在實驗操作中，研究者先將一抗加入檢測系統，使其結合目標抗原，再引入帶有標記的二抗，二抗隨後與一抗特異結合。

常用的標記物包括：螢光化合物、金顆粒、特定表位標籤、或能催化生成有色產物的酶。通過抗體介導將標記物與目標抗原結合，研究者可以在組織原位（如細胞膜、細胞質或核膜）實現對抗原的識別和可視化。在某些條件下，該方法還可適用於定量分析。

免疫標記廣泛應用於藥理學、分子生物學、生物化學等多個領域，凡需明確抗體可結合分子的精確定位時，均可採用此方法。

## 間接與直接法

免疫標記涉及兩種方法：直接法和間接法。在直接免疫標記方法中，標籤直接與一抗（原抗體）結合。直接法在減少交叉反應方面具有優勢，交叉反應是一種所有抗體固有的非特異性現象，並且每增加一種用於檢測抗原的抗體，這種非特異性反應就會累積。然而，直接法在實驗室中並不常用，其實用性遠低於間接法。這是因為一抗必須進行共價標記，而這需要大量純化抗體的供應。直接法的敏感性通常遠低於間接法。間接法的原理是，多個二抗（次級抗體）可以結合到單個一抗的不同區域或結構域上，每個抗原因此能結合更多帶標籤的抗體，從而產生更強的信號。抗原結合的標籤越多，每個抗原的檢測信號就越強。

為了實現高特異性和高靈敏度，可以採用不同的間接法策略。首先，經常使用兩步法，以避免多種一抗和二抗混合免疫標記之間的交叉反應，通常使用二抗的Fab片段以降低非特異性結合。其次，可採用半抗原化的一抗，此時二抗識別的是與一抗結合的半抗原。半抗原通過琥珀酸共價連接到一抗，或與IgG Fc特異性Fab段共軛。最後，不同Ig亞型的一抗單克隆抗體可以通過針對特定亞型的二抗進行檢測。

## 抗體結合與特異性

總體而言，抗體必須以高特異性和高親和力與抗原結合.。抗體結合的特異性是指抗體能夠識別並僅結合單一靶抗原的能力。科學家通常使用單克隆抗體或多克隆抗體，這些抗體可由合成肽構成。在抗體製備過程中，通過將抗原肽固定在親和柱上，使非特異性抗體直接流過，從而富集特異性抗原抗體。這一過程降低了抗體與初始肽上未存在的抗原表位結合的可能性。因此，抗體的特異性是通過其與用於免疫的蛋白質或肽的特異反應建立的，可採用免疫印跡或免疫沉澱等特定方法進行驗證。

在確定抗體特異性時，關鍵因素是所使用的合成肽或純化蛋白的類型。抗體的特異性越低，出現識別非目標抗原信號的可能性就越大。對於合成肽而言，其優勢在於胺基酸序列易於獲得，但這些肽並不總是呈現天然蛋白的三維結構或翻譯後修飾。因此，針對合成肽產生的抗體在識別天然三維蛋白時可能存在問題。這類抗體在免疫沉澱或免疫組織化學實驗中可能表現不佳，但在免疫印跡實驗中仍可能結合蛋白的變性形式。相反，如果抗體在識別天然純化蛋白時效果良好，而對變性蛋白無效，則免疫印跡實驗就無法作為判斷抗體結合特異性的標準測試，尤其是在免疫組織化學中。

## 特異性免疫標記技術

### 光學顯微鏡

光學顯微鏡是利用光線觀察放大標本的儀器。通常使用複合光學顯微鏡，其通過目鏡和物鏡兩組透鏡的協同作用，實現對標本的放大觀察。光學顯微鏡在研究中常結合免疫標記技術，用於觀察特定的組織或細胞。例如，有研究利用光學顯微鏡及其他電子顯微鏡方法，觀察垂體腺瘤細胞培養的形態及激素分泌情況。研究結果顯示，原代腺瘤細胞培養在體外仍保持其生理特性，與組織學檢查結果相符。研究還通過光學顯微鏡和免疫細胞化學方法觀察人垂體腺瘤的細胞培養，將細胞固定後，用針對人類生長激素（GH）的單克隆小鼠抗體及針對泌乳素（PRL）的多克隆兔抗體進行免疫標記。這一實例說明，通過光學顯微鏡及其他電子顯微鏡技術觀察免疫標記的垂體腺瘤細胞培養，有助於腫瘤的準確診斷。

### 電子顯微鏡

電子顯微鏡的放大倍率可達兩百萬倍，而光學顯微鏡的放大倍率僅為1000至2000倍。電子顯微鏡主要分為兩類：透射電子顯微鏡（TEM）和掃描電子顯微鏡（SEM）。

電子顯微鏡常結合免疫標記技術，用於觀察帶有特定標記的組織或細胞。其原理與光學顯微鏡下的免疫標記基本相同，即通過特定抗體識別目標抗原的位置，再通過電子顯微鏡進行觀察。與光學顯微鏡相比，電子顯微鏡的優勢在於能夠在亞細胞水平上直接觀察目標區域。通常，在電子顯微鏡觀察中使用高電子密度的重金屬材料，它能夠有效反射入射電子。免疫標記通常先通過光學顯微鏡確認抗原的存在，再進一步採用電子顯微鏡進行詳細觀察。

免疫標記結合電子顯微鏡技術常用於染色體的觀察。有研究探索免疫標記染色體結構的改進方法，如拓撲異構酶 IIα（topoisomerase IIα）和凝縮蛋白（condensin）在分離的有絲分裂染色體中的分布情況。研究者通過對分離的細胞核進行紫外線照射，或通過高水平特異性免疫標記，揭示染色體的輔助結構，並利用電子顯微鏡進行觀察。

### 透射電子顯微鏡

透射電子顯微鏡（TEM）利用電子束穿過組織薄片形成二維圖像。圖像中亮度越高的區域，表明有更多電子能夠透過樣本。TEM已被廣泛用於觀察經過免疫標記的組織和細胞。例如，通過免疫標記處理後，細菌可以在TEM下清晰可見。一項研究利用TEM結合負染和免疫標記技術，分析了不同大腸桿菌菌株中CS3和CS6菌毛的結構。具體而言，對菌毛的免疫標記驗證了不同表面抗原的存在。

### 掃描電子顯微鏡

掃描電子顯微鏡（SEM）是一種利用掃描電子束獲取樣品圖像的顯微技術。儘管觀察到的圖像呈現三維效果，但實際上並非真正的三維。該顯微鏡通過將電子束集中於樣品的極小區域（約2–3納米）上，激發樣品釋放二次電子。釋放的二次電子被傳感器捕捉，從而在一定時間內生成樣品的圖像。

掃描電子顯微鏡是常用的免疫標記技術之一。SEM能夠以高解析度檢測細胞組分的表面結構。這種免疫標記方法與免疫螢光技術非常相似，不同之處在於它使用膠體金標記取代螢光團。總體思路也非常相似：首先使用未標記的一級抗體，然後依次加入針對一級抗體的標記二級抗體。

在將SEM與金粒子免疫標記結合使用時，偶爾會遇到電子束下粒子和電荷解析度的問題；隨著SEM儀器技術的發展，採用背散射電子成像的方法，這一解析度問題已得到有效解決。這是因為電子背散射衍射圖案能夠提供一個乾淨的樣品表面，使其與主電子束充分作用，從而改善圖像質量。

### 免疫金標記

金粒子免疫標記，也稱為免疫金染色，常用於掃描電子顯微鏡（SEM）和透射電子顯微鏡（TEM）研究中，以精確定位細胞或組織中抗原的分布位置。這一技術最早由Faulk和Taylor發表，他們通過一步法將金粒子標記到抗沙門氏菌兔伽瑪球蛋白上，從而成功識別沙門氏菌抗原在細胞中的位置。

研究表明，為了在低倍顯微觀察中清晰呈現細胞，金粒子的尺寸需要放大（>40 nm），但粒子過大可能降低金標結合的效率。科學家們認為，應使用較小的金粒子（1–5 nm），並通過銀增強法進行放大。儘管四氧化鋨染色可能會刮掉銀層，但金粒子增強後則不易受到四氧化鋨的影響。因此，在不同基質的細胞粘附研究中，可通過金粒子的增強實現免疫金標記的有效應用。

## 未來應用

研究顯示，免疫標記技術與指紋檢測具有一定的兼容性。在一些情況下，指紋的脊線圖案不夠清晰，難以進行識別。免疫標記可能為法醫人員提供一種手段，用以縮小嫌疑人的範圍。研究人員開展了一項實驗，測試了免疫標記技術與多種指紋顯現方法的兼容性。結果表明，吲哚酮-鋅（IND-ZnCl）、吲哚酮-鋅後施用茚三酮噴霧（IND-NIN）、物理顯影法（PD）、氰基丙烯酸酯熏蒸法（CA）、氰基丙烯酸酯後結合基本黃染色（CA-BY）、螢光氰基丙烯酸酯熏蒸（Lumi-CA）以及多聚氰基丙烯酸酯熏蒸（Poly-CA）均與免疫標記技術兼容。免疫標記不僅能夠從指紋中提取供體的生物學特徵信息，還能提升指紋圖像的質量，這兩方面在刑事案件中均具有重要的應用價值。