炭疽毒素

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炭疽毒素（Anthrax toxin）是由炭疽桿菌（炭疽病的病原體）的毒性菌株分泌的三種蛋白質外毒素。這種毒素於1954年由哈里·史密斯 (微生物學家)首次發現。炭疽毒素由一種保護性抗原 (protective antigen，PA) 的細胞結合蛋白和兩種酶成分：水腫因子 (edema factor，EF) 以及致死因子 (lethal factor，LF)。這三種蛋白質成分共同作用，發揮其生理作用。組裝後的含有毒素成分的複合物會被內吞。在胞內體中，毒素的酶促成分轉移到靶細胞的細胞質中。一旦進入細胞質，毒素的酶促成分就會破壞各種免疫細胞功能，即細胞信號傳導和細胞遷移。這種毒素甚至可能誘導細胞裂解，如在巨噬細胞中觀察到的那樣。炭疽毒素使細菌逃避免疫系統、增殖，並最終殺死宿主動物。對炭疽毒素的研究還為了解大分子組裝體的產生以及蛋白質靶向運輸、孔形成、內吞作用和其他生化過程提供了見解。

## 炭疽芽孢桿菌毒力因子

炭疽病是由炭疽芽孢桿菌引起的疾病，炭疽芽孢桿菌是一種產芽孢的革蘭氏陽性杆狀細菌（圖1）。該疾病的致死性是由細菌的兩種主要毒力因子引起的：(i) 抗吞噬作用的聚穀氨酸莢膜，以及 (ii) 三部分蛋白毒素，稱為炭疽毒素。炭疽毒素是三種蛋白質成分的混合物：(i) 保護性抗原 (PA)、(ii) 水腫因子 (EF) 和 (iii) 致死因子 (LF)。

## 作用機制

炭疽毒素是一種AB毒素。每個單獨的炭疽毒素蛋白都是無毒的。當將這些蛋白單獨注射到實驗動物體內時，不會觀察到毒性症狀。PA和EF共同注射會導致水腫，而PA和LF共同注射會導致死亡。前者的組合稱為水腫毒素，後者的組合稱為致死毒素。因此，無論哪種情況，生理症狀的表現都需要PA。

在動物模型實驗中觀察到的PA需求證明了細菌毒素的一個常見範例，稱為A／B範例。A組分具有酶活性，B組分是細胞結合組分。炭疽毒素為A2B形式，其中EF和LF兩種酶是A組分，PA是B組分。PA是酶組分進入細胞所必需的。它通過形成跨越細胞膜的孔隙來實現這一點，從而使毒素進入，但其機制尚不完全清楚。一旦進入細胞質，它們就可能催化破壞正常細胞生理的反應。

### 炭疽毒素的組裝和轉運

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炭疽毒素蛋白組分必須組裝成全毒素複合物才能發揮作用。為了使LF和EF在靶細胞內發揮作用，它們必須定位到細胞內並進入細胞質。通過一系列步驟，PA可以將EF和LF轉位到細胞內（圖2）。當83kDa形式的PA（稱為PA83）與炭疽毒素受體結合時，該過程就開始了。已知有兩種同源受體與PA83結合，分別是腫瘤內皮標誌物-8 (ANTXR1) 和毛細血管形態發生蛋白2（ANTXR2）。然後，一個20kDa的片段（PA20）被弗林蛋白酶家族的膜內切酶從PA83的氨基末端切下。當PA20解離時，剩餘的受體結合部分（稱為PA63）可能組裝成七聚體 或八聚體 環狀低聚物／寡聚體。這種環狀低聚體通常被稱為PA的前孔（或前通道）形式，因為在後續的通路中，它會變成轉位酶孔（或通道）。PA20部分釋放後暴露出的前孔寡聚體表面可以與LF和EF結合。PA寡聚體的七聚體和八聚體形式可以分別與最多三或四個EF和／或LF分子結合。細胞隨後內吞這些組裝好的複合物，並將它們運送到細胞內的酸性區域。內體中遇到的低pH值導致PA63前通道轉變為陽離子選擇性通道。EF和LF在pH梯度的作用下通過該通道，使酶因子進入胞質溶膠。

### LF和EF的酶功能

一旦進入細胞質，EF和LF就會執行各自的損傷誘導過程。

- EF作為一種Ca2+ 和鈣調蛋白依賴性的腺苷酸環化酶，可顯著提高細胞內環腺苷酸（cAMP）的水平。cAMP的增加會擾亂水穩態，嚴重破壞細胞內信號通路的平衡，並損害巨噬細胞的功能，使細菌進一步逃避免疫系統的攻擊。
- LF還能通過殺死巨噬細胞幫助細菌逃避免疫系統的攻擊。進入巨噬細胞後，LF會作為一種 Zn2+依賴性的內切蛋白酶，剪斷絲裂原活化蛋白激酶激酶 (MAPKK) 的N端。這會抑制這些激酶，使其無法有效地與底物結合，從而導致信號通路改變，最終導致細胞凋亡。

因此，這三種蛋白質的協同作用通過一系列事件導致細胞死亡，這些事件使蛋白質進入細胞並破壞細胞功能。

## 細胞外毒素結構-功能關係

炭疽毒素的作用機制是三種毒素蛋白的分子結構與宿主細胞的生物分子結合的結果。通過對PA、EF、LF及其細胞受體（ANTXR1和ANTXR2）的結構進行詳細分析，可以清楚地看出這些分子之間的相互作用。毒素分子（圖3-5）、受體及其複合物的結構均有助於深入了解這些蛋白質的協同作用。結合位點和構象變化的分析補充了結構研究，闡明了PA、LF和EF各結構域的功能，如表1所示。

PA的結構首先被確定（圖3）。這種結構及其細胞受體的結構為識別和結合的特異性提供了很大啟示。PA與受體CMG2（類似於I型整合素）的這種特異性源於它們通過金屬離子依賴性粘附位點 (MIDAS)、疏水溝和β髮夾突起相互作用。這些相互作用共同導致了緊密的相互作用，CMG2（和TEM8）上的大量蛋白質表面積被掩埋。

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佩托薩（Petosa）等人解析了4.5Å (0.45 nm) 的PA63七聚體的結構。他們解析出的結構是一種非膜結合前孔的結構，即複合物延伸β桶穿過質膜將LF和EF運送到細胞質溶膠之前的七聚體的構象。

PA20片段在空間上阻礙了七聚化和孔的形成，但當它從單體頂部移除時，預孔會迅速形成。七聚體的形成不會導致每個單體的構象發生重大變化，但通過聚合，超過15400Å² (154 nm2) 的蛋白質表面被掩埋。這些掩埋的表面主要由來自結構域1和2的極性或帶電側基組成。

PA還形成八聚體前通道結構。八聚體形式比七聚體形式具有更高的熱穩定性，因此八聚體寡聚體可以在炭疽病感染期間在宿主的血漿中持續存在。

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在PA63寡聚化過程中，EF和/或LF分子快速且同時地與PA前通道結合。這種結合的發生是因為在去除PA20結構域後，PA63的結構域1上暴露出了一個較大的疏水表面。域1提供了與EF和LF的N端相互作用的大表面，前約36個殘基幾乎完全同源，前約250個殘基的三級結構相似。對LF和EF結合區域的研究表明，在七聚體構象下，較大的表面積與兩個相鄰PA63分子的結構域1接觸。如此大的結合面積解釋了為什麼先前的研究只能在PA63七聚體上結合最多三個分子。PA八聚體與N端LF複合物的共晶結構表明，結合相互作用實際上是兩個不連續的位點。其中一個位點被稱為C端亞位點，類似於經典的「熱點」，具有預測的鹽橋和靜電相互作用。另一個位點被稱為α鉗亞位點，是一個深裂隙，它非特異性地結合LF的N端α螺旋和短β鏈，從而引導底物的N端向PA通道前腔移動。通過這種方式，α鉗輔助蛋白質轉位，非特異性地結合，並在其從底物展開時展開二級結構。LF/EF結合位點目前正被用於通過融合蛋白傳遞治療劑。

在前孔形成並附著LF和/或EF後，七聚體遷移至脂筏，並在那裡被快速內吞。內吞作用是一系列事件的結果。首先，CMG2或TEM8被棕櫚醯化，從而抑制受體與脂筏的結合。這抑制了受體在PA83被裂解以及LF或EF與七聚體結合之前被內吞。當PA63與受體結合併發生七聚化時，受體與富含膽固醇和糖鞘脂的微區（脂筏）重新結合。一旦受體和PA返回脂筏，E3泛素連接酶Cb1就會泛素化受體的胞質尾部，向受體及其相關毒素蛋白發出內吞信號。這種內吞作用需要縊斷蛋白和Eps15，這表明炭疽毒素通過網格蛋白依賴性途徑進入細胞。

如上所述，每個分子都會與其他幾個分子相互作用，以誘導炭疽毒素的內吞作用。一旦進入細胞，複合物就會被轉移到一個酸性隔室中，在那裡，仍然處於非跨膜前孔構象的七聚體為EF和LF的轉運做好準備，使其能夠進入細胞質。

## 從囊泡到細胞質的結構-功能關係

### 孔隙形成

乍一看，PA的一級序列看起來不像跨膜蛋白。疏水性圖缺乏任何可能跨膜結構域共有的模式。其他多聚體膜蛋白（例如白喉毒素）的結構解釋了PA是如何跨膜的。人們認為PA的作用類似於這些多聚體膜蛋白，它們由每個單體的極性和非極性胺基酸片段構成β桶。

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pH值下降有利於β-桶狀孔的形成。為了在pH值下降時形成桶狀孔，PA63結構域2必須經歷最大的構象變化。檢查結構域2的結構（圖7）後，我們可以看出該結構域包含一個希臘鍵蛋白質結構圖案（圖7中的金色部分）。圖8顯示了希臘鍵基序的示意圖。結構域2中的希臘鍵基序連接著一個巨大的無序環。該環在孔形成過程中的必要性通過誘變和糜蛋白酶水解該環得到證實。進一步的半胱氨酸取代電生理測量表明，該環中的胺基酸位於插入膜孔的腔內。結構域 2 中的無序環也具有親水和疏水胺基酸交替排列的模式，這種模式在孔蛋白的跨膜部分中是保守的。唯一的問題是，該環不夠大，無法以 β-桶狀結構跨越膜。這種膜插入只能通過額外的構象變化來實現。在希臘鍵基序展開的位置發生了巨大的構象變化，形成一個向下伸入膜的β-髮夾結構，並與複合物的其他6個單體一起形成β-桶狀結構（圖9a和9b）。最終孔徑為12Å（1.2nm），符合該模型的理論值。

該模型需要結構域2發生大的構象變化，同時隨著希臘鍵基序從結構域中心剝離，許多氫鍵斷裂。佩托薩等人提出了一個模型來解釋這一過程。當七聚體酸化時，PA希臘鍵基序會插入膜中。在人工雙層膜中，當pH從7.4降至6.5時，就會發生這種情況，這表明插入的觸發因素與組氨酸的滴定有關。這確實符合PA的序列，因為結構域2包含許多組氨酸（在圖9a中以星號表示）。在無序環中發現了三個組氨酸殘基，其中一個與希臘鍵組氨酸一起位於極性胺基酸簇內。該簇（包括兩個組氨酸、三個精氨酸和一個穀氨酸）嵌入希臘鍵基序的頂部，因此很容易看出這些組氨酸的質子化會破壞該簇。此外，另一個組氨酸與一些疏水殘基一起位於希臘鍵基序的底部（在圖7和9a中的綠色片段上）。在pH7.4時，該片段是有序的，但當晶體在pH6.0下生長時，它就變得無序了。這種從有序到無序的轉變是PA膜插入的初始步驟。

PA以可溶性七聚體的形式被內吞，七聚體上附著有LF或EF作為貨物。內吞後的第一步是內吞囊泡的酸化。酸化在毒素的壽命中起著兩個作用。首先，它有助於放鬆CMG2或TEM8受體對PA的緊密結合，促進孔道的形成（不同的受體允許在略有不同的pH下插入PA）。其次，pH值的下降導致PA結構域2中的無序環和希臘鍵基序從七聚體前孔中摺疊出來並插入酸性囊泡壁，從而形成孔（圖 7-9）。

聖泰利（Santelli）等人在確定了PA/CMG2複合物的晶體結構後對該過程進行了更多解釋。該複合物的結構表明，CMG2 同時與 PA 的結構域2和4結合。這種相互作用表明希臘鍵展開的自由度較低。進一步分析表明，PA中的九個組氨酸中有七個位於結構域2/結構域4界面上。這些組氨酸的質子化使結構域分離到足以使希臘鍵脫出並有助於形成參與插入的 β 髮夾結構。此外，當PA與CMG2結合時，插入不再發生在pH為6.5的情況下，而插入到人工膜中則不會發生。相反，它需要pH值為5.0才能插入天然細胞。這種差異被解釋為CMG2中MIDAS基序旁邊的口袋造成的。該口袋底部埋藏著一個組氨酸，結構域2正是在那裡附著的。該組氨酸在較低的pH值下質子化，增強了PA的穩定性。這種增強的穩定性使希臘鍵無法移動，直到酸性條件達到。這些組氨酸協同作用，防止七聚體在內吞作用發生之前過早插入。

聖泰利及其同事（圖10）還構建了膜插入型 PA/CMG2結構的假想結構。該模型顯示，β-桶狀結構長約70 Å（7nm），其中30Å（3nm）跨越膜，而40 Å（4nm）的間隙實際上被CMG2受體胞外部分的其餘部分（約100個殘基）填充。CMG2為該孔道提供了額外的支撐。

### 蛋白質易位

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最近的幾項研究表明，在PA63孔腔如此狹小的情況下，它是如何允許EF和LF進入細胞質的。PA63孔腔直徑僅為15Å（1.5nm），遠小於LF或EF的直徑。轉運是通過一系列事件發生的，這些事件始於內體酸化時。LF和EF對pH敏感，隨著pH值的下降，它們的結構會失去穩定性。當pH值低於6.0（內體的pH值）時，LF和EF都會變成無序的熔球狀。當分子處於這種構象時，N端會被釋放，並在質子梯度和正跨膜電位的作用下被拉入孔道。孔道口內體側的七個苯丙氨酸環（苯丙氨酸鉗）通過與LF或EF中的疏水殘基相互作用，協助LF或EF展開。然後，質子梯度開始將蛋白質穿過孔道。這種穿插機制由梯度驅動，但需要苯丙氨酸鉗來實現棘輪運動。EF和LF的前250個殘基具有鹼性、酸性和疏水殘基的不規則交替序列。苯丙氨酸鉗和質子化狀態之間的相互作用導致棘輪效應，驅動蛋白質穿過孔道，直到足夠多的蛋白質進入細胞質，並在N端重新摺疊時將剩餘的蛋白質拖過孔道。

## 基本資料

- 貨幣符號：Anthrax-tox_M
- 日語原文：炭疽毒素致死因子中域、Anthrax toxin lethal factor middle domain
- Pfam：PF09156
- InterPro：IPR015239
- SCOP：1j7n
- OPM family：35
- 貨幣符號：ATLF
- 日語原文：炭疽毒素致死因子N和C末端域、Anthrax toxin lethal factor N and C terminal domains
- Pfam：PF07737
- InterPro：IPR014781
- MEROPS：M34
- SCOP：1pwq
- 貨幣符號：Anthrax_toxA
- 日語原文：炭疽毒素致死因子亞基、Anthrax toxin LF subunit
- Pfam：PF03497
- SCOP：1jky