雙單倍體

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雙單倍體（doubled haploid，簡稱DH）是單倍體細胞經過染色體加倍後所形成的基因型。在植物育種中，人工培育雙單倍體具有重要意義。

單倍體細胞源於花粉、卵細胞或配子體的其他細胞，再經人工誘導或自然發生的染色體加倍，形成雙單倍體細胞，該細胞可進一步發育為雙單倍體植株。若原始植物為二倍體，則其單倍體細胞為一倍體，此類加倍後的個體可稱為「雙一倍體」。由四倍體或六倍體衍生而來的單倍體生物有時稱為「二單倍體」（其加倍後的個體則分別成為四倍體或六倍體）。

傳統近交繁殖方法需要六代才能達到近乎完全純合，而雙單倍體技術僅需一代即可實現。由四倍體作物衍生出的二單倍體植株，對於涉及作物二倍體野生近緣種的育種項目可能具有重要意義。

## 歷史

關於單倍體植物的首次報導由Blakeslee等人於1922年發表，研究對象為曼陀羅。此後，在多種其他植物中也相繼報導了單倍體。Guha和Maheshwari於1964年創立了花葯培養技術，可在實驗室條件下誘導產生單倍體。通過遠緣雜交獲得單倍體的方法在大麥（Kasha與Kao, 1970）和菸草（Burk等, 1979）中均有報導。菸草、油菜和大麥是雙單倍體生產中反應最為敏感的物種。目前，雙單倍體技術已應用於超過250個物種。

## 雙單倍體的生產

雙單倍體可通過體內或體外方法獲得。體內產生單倍體胚胎的途徑包括孤雌生殖、假受精或遠緣雜交後的染色體消除。將單倍體胚胎進行胚拯救、培養，再經染色體加倍，即可得到雙單倍體。體外方法包括雌核發育（子房和花培養）以及雄核發育（花葯和小孢子培養），其中雄核發育是更常用的方法。另一種產生單倍體的技術是遠緣雜交。在大麥中，通過與近緣種球莖大麥雜交可產生單倍體：受精雖能完成，但在種子發育早期，球莖大麥的染色體會被消除，從而留下單倍體胚。在菸草中，與非洲菸草的遠緣雜交應用廣泛。用非洲菸草授粉於普通菸草時，後代中有0.25%至1.42%的植株能夠存活，並可明顯區分為F1品種或母本來源的單倍體。儘管這些比例看似較低，但由於菸草種子產量極大且多數幼苗早期死亡，在相對較小的土培容器中仍可獲得可觀數量的可育雜種和單倍體。這種種間授粉方法為生產菸草的源於種子的單倍體提供了一條實用途徑，可作為花葯培養的替代或補充方法。

近年來，雙單倍體技術已與CRISPR/Cas9基因編輯技術相結合，形成了一種稱為「單倍體誘導介導的基因組編輯」（haploid inducer-mediated genome editing，簡稱HI-Edit）的方法。在該方法中，負責誘導單倍體的親本攜帶Cas9蛋白及靶向另一親本某個基因的引導RNA。受精後不久，在誘導親本的染色體被消除之前，編輯即可發生，從而產生可能攜帶目標突變但不繼承CRISPR/Cas9轉基因的單倍體後代。在小麥中，這一策略已通過將小麥與表達Cas9及引導RNA的轉基因玉米進行雜交而得到驗證。一項2023年的研究針對小麥感病基因TaHRC和Tsn1進行編輯，成功獲得的編輯單倍體小麥植株頻率為15%至33%。這些經過編輯的單倍體可再經染色體加倍，從而產生純合的雙單倍體株系，用於功能基因組學或植物育種研究。

## DH群體的遺傳學

在雙單倍體方法中，對於一對等位基因A和a，僅產生兩種基因型：AA和aa，其頻率各為1/2；而在二倍體方法中，則產生三種基因型：AA、Aa、aa，頻率分別為1/4、1/2、1/4。因此，若AA為目標基因型，單倍體方法獲得該基因型的機率高於二倍體方法。若涉及n個分離的基因座，則單倍體方法獲得目標基因型的機率為$(1/2)^n$，二倍體方法為$(1/4)^n$。由此可見，當相關基因數量較大時，單倍體方法的效率更高。

研究表明，比較雙單倍體法與其它常規育種方法後得出結論：採用雙單倍體育種不會導致群體中基因型出現任何偏倚，隨機DH系甚至與常規系譜法選育的品系表現相當。

## DH法在植物育種中的應用

### 數量性狀基因座定位

大多數經濟性狀由效應微小但具有累加作用的基因控制。儘管人們早已認識到DH群體在定量遺傳學中的潛力，但直到分子標記圖譜的出現，才推動其用於控制數量性狀的基因座的鑑定。由於數量性狀基因座（QTL）效應較小，且受環境因素影響較大，因此需要藉助重複試驗進行精確的表型鑑定。雙單倍體生物因其具有純合遺傳的特性，且能夠方便地大量生產，從而滿足了這一要求。利用DH群體，已在9種作物中定位了130個數量性狀。總共有56個DH群體用於QTL檢測。

### 回交育種

在回交轉育過程中，目標基因通過反覆回交從供體品種或相關物種漸滲到受體優良品系中。該流程的一個難題在於如何從每一代中篩選出攜帶目標性狀的株系。若目標性狀為隱性性狀，則問題尤為突出，因為每次回交後該性狀僅以雜合狀態存在。分子標記技術的發展提供了一種基於基因型（標記）而非表型的更簡便選擇方法。若與雙單倍體技術相結合，其效率將進一步提高。在分子標記輔助的回交轉育中，將受體親本與供體系雜交，再將雜種（F1）與受體親本回交，所得後代（BC1）繼續回交，如此重複直至獲得目標基因型。雙單倍體技術與分子標記的結合則提供了一條捷徑：在BC1代即可篩選出具有目標性狀的基因型，並將其轉化為純合的雙單倍體基因型。Chen等人（1994）利用分子標記輔助回交轉育結合BC1代雙單倍體技術，在大麥中成功選育出了抗條銹病株系。

### 集群分離分析

在集群分離分析（BSA）中，首先針對目標性狀對群體進行篩選，然後分別選取性狀極端的兩端個體構建兩個混合池。隨後，檢測這兩個混合池中分子標記的存在與否。由於兩個混合池在貢獻正向和負向效應的等位基因上應存在差異，因此兩池之間的任何標記多態性都表明該標記與目標性狀之間存在連鎖關係。BSA依賴於準確的表型鑑定，而DH群體因其純合遺傳、可重複檢測的特點而具有獨特優勢。在分子標記輔助育種中，DH群體常用於集群分離分析法，該方法已在油菜和大麥中得到了廣泛應用。

### 遺傳圖譜

遺傳圖譜對於理解基因組的結構與組織至關重要，據此可以推斷物種間的演化模式和共線性關係。遺傳圖譜還為定位目標基因、估算其效應大小提供框架，並有助於我們理解基因型與表型之間的關聯。在易於獲得DH群體的物種中，DH群體已成為遺傳作圖的標準化資源。雙單倍體群體是遺傳作圖的理想材料。無論物種如何，從最初的雜交開始，通常在兩年內即可構建出遺傳圖譜。由於來源於兩個純合親本雜交後代的DH群體預期分離比為簡單的1:1，因此圖譜構建相對容易。目前，DH群體已被用於構建大麥、油菜、水稻、小麥和辣椒等作物的遺傳圖譜。在推動八種作物分子標記圖譜的繪製過程中，DH群體發揮了重要作用。

### 遺傳研究

遺傳比率和突變率可直接從單倍體群體中讀取。一項研究利用小規模的雙單倍體群體證明，大麥中的一個矮化基因位於5H染色體上。另一項研究則分析了大麥中一系列標記的分離情況。

### 基因組學

儘管QTL分析已在基因位置及其對許多性狀的效應大小方面積累了海量資訊，但相關基因的鑑定仍然困難重重，這主要是由於QTL分析的解析度較低。解決這一問題的途徑是構建重組染色體替換系或階式排列重組自交系。具體方法是通過持續回交直至達到所需的重組水平，並利用分子標記在目標區域篩選目標重組染色體替換系，再通過雙單倍體技術使其基因型固定。在水稻中，利用DH群體構建的圖譜已發現分子標記與抗稻瘟病、白葉枯病和紋枯病的主效基因及QTL緊密連鎖。

### 精英雜交

傳統育種方法周期長，培育一個品種需要10至15年。另一個缺點是，由於早期世代存在雜合性，選擇效率較低。雙單倍體技術可以克服這兩大不足，從而在更短的時間內對更多優良雜交組合進行評價與篩選。

### 品種選育

一致性是大多數物種栽培品系的基本要求，而通過雙單倍體技術可輕鬆實現。雙單倍體在品種培育中有多種應用方式：DH系本身可作為品種直接推廣，可作為親本用於雜交種生產，或更間接地用於育種品系的創製及種質資源保存。大麥已有超過100個直接來源於DH的品種。據已發表資料，目前全球範圍內12個物種中約有300個品種源自DH技術。

近年來，隨著25個物種實驗方案的建立，雙單倍體在植物育種中的重要性顯著提升。雙單倍體技術已在蔬菜雜交品種培育中發揮重要作用，其在觀賞植物育種中的潛力也正得到積極探索。此外，在藥用植物纈草中，人們也正利用雙單倍體技術篩選具有高藥理活性的品系。另一個有趣的進展是，在具有自交不親和性的物種中，已可培育出可育的純合雙單倍體系。

## DH法的優勢

經過單輪重組即可產生純合株系的能力為植物育種者節省了大量時間。研究表明，隨機DH系與系譜法近交選育的株系表現相當。其他優勢包括：可在更短時間內培育出大量純合株系、進行高效遺傳分析以及開發與有用性狀相關的標記。更具體的益處體現在：在觀賞植物中，種子繁殖可作為無性繁殖的替代方式；而在樹木等生命周期長且存在近交衰退、傳統育種方法難以開展的物種中，雙單倍體技術提供了新的解決方案。

## DH法的缺點

DH群體的主要缺點在於無法對其施加選擇壓力。而在傳統育種中，可以選擇多個世代，從而對群體中的優良性狀進行逐步改良。

在通過花葯培養獲得的單倍體中，觀察到部分植株為非整倍體，另有一些則為單倍體與二倍體混合的嵌合類型。雙單倍體技術的另一個缺點在於建立組織培養與生長設施所需的成本較高。此外，過度使用雙單倍體技術可能減少育種種質中的遺傳變異。因此，在育種計劃中採用雙單倍體技術之前，需要綜合考慮多種因素。

## 結論

技術進步現已為大多數植物屬提供了雙單倍體實驗方案。在短短幾十年內，適用於雙單倍體技術的物種數量已達到驚人的250種。隨著越來越多的物種從頑拗型類別中逐步移除，其響應效率也在不斷提高。因此，雙單倍體技術將為植物育種帶來更高的效率。

## 教程

- Doubled Haploids to Improve Winter Wheat
- 影片： Doubled Haploids: A simple method to improve efficiency of maize breeding.