GCaMP

GCaMP是一種基因編碼鈣指示劑（GECI），最初由中井淳一於2001年開發。它由綠色螢光蛋白（GFP）、鈣調蛋白（calmodulin,CaM）和源自肌球蛋白輕鏈激酶的肽序列M13通過人工融合構成。當與Ca2+結合時，GCaMP會發出綠色螢光，其激發峰波長峰值為480 nm，發射峰波長約為510 nm。在生物學研究中，GCaMP被廣泛用於測量體外和體內細胞內Ca2+水平，通常通過病毒轉染或在轉基因細胞系與動物品系中表達。GCaMP的編碼基因序列可以置於只在特定細胞類型中活躍的啟動子的控制下，從而實現GCaMP在特定細胞類型中的特異性表達。由於Ca2+是參與多種細胞機制和信號通路的第二信使，GCaMP能夠使研究者定量分析基於Ca2+的各種活動，並研究Ca2+離子在相關生物學過程中所發揮的作用。

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## 結構

GCaMP由三個關鍵結構域組成：位於N端的M13結構域、位於C端的鈣調蛋白（CaM）結構域，以及位於中間的GFP結構域。GFP結構域經過環形重排處理，即其天然的N端和C端通過一個由六個胺基酸構成的連接肽彼此連接，而GFP的胺基酸序列在中間被切開，形成新的N端和C端，再分別與M13結構域和CaM結構域連接。

在缺乏Ca2+的情況下，GFP的發色團暴露於水環境中，並以質子化狀態存在，此時螢光強度很低。當Ca2+結合時，CaM結構域發生構象改變，並緊密結合M13結構域的α螺旋，從而阻止水分子接近發色團，導致發色團迅速去質子化，轉變為帶負電荷的形式，發出類似於天然GFP的強螢光。

## 歷史與發展

2001年，Nakai等人報導了GCaMP1的開發，將其描述為相較於此前螢光Ca2+探針具有更高信噪比的Ca2+探針。2004年，首個表達GCaMP1的轉基因小鼠被報導。然而，在37℃（哺乳動物的生理溫度）下，GCaMP1的摺疊不夠穩定，螢光也不夠強，這限制了其作為體內鈣指示劑的潛在應用。

2006年，Tallini等人隨後報導了由GCaMP1改良而來的GCaMP2。與GCaMP1相比，GCaMP2的螢光更亮，在哺乳動物體溫下也表現出更好的穩定性。Tallini等人將GCaMP2表達於小鼠胚胎的心肌細胞中，實現了首例在哺乳動物體內利用GCaMP成像Ca2+的實驗。

此後，人們對GCaMP進行了進一步改造，包括GCaMP3、GCaMP5、GCaMP6和jGCaMP7等，這些變體在Ca2+檢測的信號強度、靈敏度和動態範圍等方面都不斷得到改善，最近的一些版本在螢光亮度上已接近天然GFP。

### 常用變體

在生物學和神經科學研究中，廣泛使用的既有慢型變體（如GCaMP6s、jGCaMP7s），也有快型變體（如GCaMP6f、jGCaMP7f）。慢型變體亮度更高，對小幅度的Ca2+水平變化（例如單次動作電位）更加敏感；相對地，快型變體的靈敏度較低，但響應速度更快，更適合追蹤在精確時間尺度上發生的Ca2+變化。GCaMP6還包括一種中等動力學的變體GCaMP6m，其動力學特徵介於GCaMP6s和GCaMP6f之間。jGCaMP7也有多種常用的變體：例如jGCaMP7b具有較高的基礎螢光強度，適合成像樹突和軸突；而jGCaMP7c則在最大螢光與基礎螢光之間具有更大的對比度，更適用於成像大規模的神經元群體。

2018年，Yang等人報導了GCaMP-X的開發，該變體額外加入一個鈣調蛋白結合基序。由於GCaMP中的鈣調蛋白結構域在未結合狀態下會干擾L型鈣通道的門控，這一新增的鈣調蛋白結合基序可以防止GCaMP-X干擾鈣依賴的信號傳導機制。

2020年，Zhang等人報導了jGCaMP8的開發，其中包含高靈敏度型、中等型和快型等多個變體，這些變體在動力學和靈敏度上都優於相應的jGCaMP7變體。

此外，人們還開發了紅色螢光指示劑：例如jRCaMP1a和jRCaMP1b使用的是紅色螢光蛋白mRuby的環形重排形式，而jRGECO1a則基於紅色螢光蛋白mApple。由於用於激發GCaMP的藍光在組織中散射嚴重，而其發出的綠色螢光易被血液吸收，紅色螢光指示劑在體內成像時可以提供更好的組織穿透力和成像深度。使用紅色指示劑還可以避免藍光激發所帶來的光損傷。此外，紅色指示劑可以與光遺傳學同時使用，而這對GCaMP來說較為困難，因為GCaMP的激發波長與通道視紫紅質-2（channelrhodopsin-2,ChR2）的激發波長重疊。同時使用紅色和綠色GECI還能實現對不同亞細胞區域或不同細胞群體的雙色可視化。

## 研究應用

### 神經元活動

在神經元中，動作電位通過打開電壓門控Ca2+通道，引發軸突末梢的神經遞質釋放，並伴隨Ca2+內流。因此，GCaMP常被用來測量神經元內Ca2+的升高，以此作為多種動物模型（包括秀麗隱杆線蟲、斑馬魚、果蠅、大鼠和小鼠）神經元活動的指標。近年來，除了GECI之外，基因編碼電壓指示劑（GEVI）也被開發出來（geneticallyencodedvoltageindicator,GEVI），它們可以在細胞水平上更加直接地探測上述動物模型中的神經元活動。

GCaMP在建立動物大規模神經記錄方面發揮了至關重要的作用，幫助研究者探索神經網路活動模式如何影響行為。例如，Nguyen等人(2016)在自由活動的秀麗隱杆線蟲全腦成像中使用GCaMP，識別出與特定運動行為相關的神經元及神經元群體。

Muto等人（2003）在斑馬魚胚胎中表達GCaMP，以測量並繪製脊髓運動神經元在不同腦區的協同活動，這些活動對戊四氮（pentylenetetrazol）誘導的發作起始、傳播和恢復過程十分關鍵。在斑馬魚腦內表達GCaMP也被用於研究認知過程中神經迴路的激活，例如捕食、衝動控制和注意力。

此外，研究人員還通過在小鼠中在Thy1啟動子控制下表達GCaMP，觀察神經元活動。Thy1啟動子主要在興奮性錐體神經元中表達。例如，有研究利用GCaMP觀察Ca2+水平的同步波動模式，從而追蹤神經元在運動學習過程中如何整合進功能迴路。GCaMP也被用於觀察小鼠神經元亞細胞結構中的Ca2+動力學：Cichon和Gan（2015）利用GCaMP表明，小鼠運動皮層中的神經元小在各個樹突棘中出現由NMDA受體驅動的Ca2+升高，而這些升高在不同樹突棘之間相互獨立，從而說明單個樹突棘可獨立調控突觸可塑性。最後，GCaMP還被用於識別小鼠大腦特定區域的活動模式。例如，Jones等人（2018）在小鼠中使用GCaMP6測量視交叉上核（SCN，哺乳動物晝夜節律起搏器）中的神經元活動，結果表明產生血管活性腸肽（VIP）的SCN神經元在體內表現出與VIP釋放相關的晝夜節律活動。

GCaMP技術還可以與光纖光度法結合，用於在自由活動動物中測量特定神經元亞群內Ca2+水平的群體變化。例如，Clarkson等人（2017）利用該方法證明，下丘腦弓狀核的神經元在促黃體生成素（LH）脈衝之前立即同步出現Ca2+升高。結合光纖光度法的GCaMP成像無法分辨單個神經元內部的Ca2+變化，但在觀察大規模變化時可以提供更高的時間解析度。

### 心臟傳導

心肌細胞通過間隙連接傳遞Ca2+電流，從而介導心肌組織的同步收縮。因此，心肌細胞中表達GCaMP，無論是在體外還是體內，都可用於研究斑馬魚和小鼠中依賴Ca2+內流的興奮與收縮過程。例如，Tallini等人（2006）在小鼠胚胎中表達GCaMP2，證明在胚胎發育第10.5天，心房和心室的電傳導已經很快，而房室管的電傳導仍較緩慢。Chi等人（2008）利用一個心臟特異性表達GCaMP的轉基因斑馬魚品系，對整個心動周期中的心肌細胞激活進行了成像；根據這些結果，他們表徵了斑馬魚心臟傳導系統的四個發育階段，並鑑定了17個影響心臟傳導的新突變。然而，如果不加控制地高水平表達GCaMP，會因為過度表達鈣調蛋白基序而導致心肌肥大，並干擾細胞內鈣信號通路。因此，在使用心臟組織進行實驗時，需要謹慎控制GCaMP的表達水平。

### 信號通路激活

由於Ca2+是常見的第二信使，GCaMP被廣泛用於監測信號通路的激活。例如，Bonder和McCarthy（2014）利用GCaMP證明，星形膠質細胞的G蛋白偶聯受體（GPCR）信號及其導致的Ca2+釋放，並不是由於神經血管耦聯（即神經活動變化引起局部血流變化過程）。類似地，Greer和Bear等人（2016）利用GCaMP表徵了頸狀嗅覺神經元（necklaceolfactoryneuron）信號傳導中Ca2+內流的動力學，這種信號通路依賴於MS4A這一跨膜蛋白家族作為化學感受器。