Cre-Lox重組

Cre-Lox重組是一種用於在細胞DNA的特定位點上進行刪除、插入、轉座和倒位操作的位點特異性重組酶技術，其特點在於可以讓DNA修改對指定的特定細胞群進行，或是使修改過程由特定的外部刺激所觸發。此技術對真核和原核細胞都適用。特別地，對研究由各種複雜細胞和神經通路複合而形成認知行為的大腦的神經生物學家而言，這種技術已被證明是相當實用的。

這個重組體系由單個酶組成，即可以讓一對被稱為Lox序列的短目標序列進行重組的Cre重組酶，除此之外不需要插入其他的額外蛋白或序列。Cre重組酶和源Lox序列（即LoxP序列）是從P1噬菌體中獲取的。

通過合適地插入Lox序列可以使特定基因活化、沉默或者和其他基因交換位置——在DNA的層面上，許多操作都可以進行。Cre酶的活性可控，可以使之只在一種特定細胞類型中表達，也可以使之由特定的外部刺激（如化學信號、熱刺激）觸發表達。這些特異性DNA修飾對細胞系追蹤以及有致命性的突變研究十分有效。

Cre-Lox重組系統在操作和用途上都與FLP-FRT重組系統十分相似。

## 歷史

Cre-Lox重組是一種由Brian Sauer博士發明的特殊的位點特異性重組技術，最初用於在哺乳動物細胞系中激活基因表達。之後，Jamey Marth博士的研究團隊發現了Cre-Lox可以對轉基因動物體內特殊T細胞中由loxP序列所夾的染色體DNA進行高效地刪除，他們由此提出這一技術可以用於確定特定細胞類型中內源基因的功能、標記細胞命運決定中的祖細胞、誘導染色體重組以構建疾病生物學模型、以及確定早期基因損傷對疾病發展的作用。

不久，就已經有研究者報導獲得了具有loxP側位（floxed）DNA聚合酶基因的多能胚胎幹細胞。結合上述的發展，在1994年已有實驗室報導了Cre-Lox重組可以用於小鼠T細胞發育中的條件性基因敲除。之後的文獻中重組的效率不斷提高，但是當細胞中有兩份floxed序列時，由於Cre酶活性問題，不完全的敲除仍是常見情況。

Cre-Lox技術的發展使生物醫學研究中條件性誘變得到廣泛使用，使之成為確定特殊細胞類型和發育階段中基因功能的主流方法，特別是神經生物學領域。

## 概覽

Cre-Lox重組，即對一段特定的DNA序列進行定位，並用Cre重組酶對其進行剪接。這一技術常用於避免研究中系統性的多基因失活帶來的胚胎致死情況。此外，對轉基因動物模型中基因型（基因組DNA的改變）和表型（生物學功能的變化）之間關係的判斷，Cre-Lox技術也提供了當前最好的實驗對照控制。

Cre蛋白是一個位點特異性DNA重組酶，它能夠催化DNA分子中特定位點之間的重組。這些位點就是loxP位點，其兩端包含了可以讓Cre特異性結合的序列，圍繞著一個有方向性的核心序列，而DNA重組就發生在核心序列上。

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當一個基因組中含有loxP位點的細胞表達Cre蛋白時，DNA重組就可能會發生在loxP位點之間。Cre重組酶蛋白會分別與一個loxP位點的前13bp和後13bp區域結合，形成一個二聚體；這個二聚體又會和另一個loxP位點上的二聚體結合成一個四聚體。Lox位點是有方向性的，而兩個由四聚體連接的位點在方向上是平行的。Cre蛋白將把兩個位點的DNA雙鏈都切開，而DNA連接酶將快速將其重新連接。重組的結果取決於LoxP位點的定向，對同一條染色體臂上的兩個位點，反向的情況將會導致目標序列的倒位，而同向的情況將導致其被直接刪除；如果兩個位點位於兩條不同的染色體上，則可能引發染色體易位。Lox變體可用於兩個質粒的連接。

### Cre 重組酶

Cre蛋白（最初由「導致重組（Cause recombination）」命名，也有文獻是「環化重組酶（Cyclization recombinase）」）由4個亞基組成，全蛋白有343個胺基酸殘基，2個結構域：較大的C-末端結構域，和較小的N-末端結構域。C-末端結構域在結構上和λ噬菌體中分離出的整合酶家族有相似性，這也是Cre酶的催化活性位點。

### loxP位點

loxP（Locus Of X-over P1）是P1噬菌體基因組中34bp的特殊位點序列。序列由8bp的不對稱序列（決定了loxP序列的方向），和不對稱序列兩邊的兩段13bp對稱序列組成，具體序列見下：「N」代表這個鹼基是可變的，小寫字母則表示這個鹼基是從野生型突變而來。在基因操作中loxP序列一般成對使用，被一對loxP序列包圍的序列稱為floxed序列。如果floxed序列兩側的loxP序列方向相同，floxed序列將會被刪除；而如果兩側的loxP序列方向相反，floxed序列將會發生倒位。如果有另一段外源的floxed序列，兩者可能發生重組，這稱為重組酶介導的盒交換。這是一種十分方便省時的基因重組技術，但是由於可能發生反向重組和反式刪除，重組效率可能較低，loxP序列的突變形式即是用於解決這些問題。

13bp｜8bp｜13bp

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名稱｜13bp 識別區｜8bp 不對稱區｜13bp 識別區

Wild-Type｜ATAACTTCGTATA｜ATGTATGC｜TATACGAAGTTAT

lox 511｜ATAACTTCGTATA｜ATGTATaC｜TATACGAAGTTAT

lox 5171｜ATAACTTCGTATA｜ATGTgTaC｜TATACGAAGTTAT

lox 2272｜ATAACTTCGTATA｜AaGTATcC｜TATACGAAGTTAT

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## 位點特異性重組

位點特異性重組（Site-Specific Recombination）和一般的同源重組相對，是指在DNA上的特定位點發生的由特定重組酶介導的重組過程。

在原核和真核細胞中，都已經有一些位點特異性重組系統被發現和描述，基本上它們都是利用一個或多個蛋白對非對稱的DNA序列進行特異性識別操作，生成非對稱DNA序列的方向所決定的重組產物。除了重組酶外，一般還有一些其他蛋白會對重組過程進行調控。

### 作用機理

位點特異性重組由重組蛋白對其特異性識別的DNA序列進行結合開始，一個重組酶一般可以結合同一個DNA分子或兩個DNA分子上的兩個特異性位點。結合上去後，重組酶的酪氨酸殘基會與DNA分子的磷酸基團發生轉酯化反應，將酶蛋白和DNA連接起來，這一步反應保存了磷酸二酯鍵中的能量，使其不需要高能輔因子也可以發生逆反應。

另一條DNA鏈上也發生了相同的反應，這樣就在兩條鏈的骨架上分別暴露了兩個游離的3'羥基，這時的DNA-酶複合物即是反應的中間體。下一步，DNA上游離的3'羥基會與另一條DNA上的5'磷酸基團共價連接，並使後者和重組酶上的酪氨酸殘基解離，生成重組反應中的霍利迪交叉。

這樣，兩條原本並不相連的DNA鏈連接在了一起，再通過後續的酶切和連接，兩端DNA序列發生了互相交換，蛋白質之間的相互作用促進並指導了這個過程的進行。

當某些病毒，比如一些噬菌體侵染細菌細胞時，會將自己的遺傳物質整合進宿主的基因組中。發生整合的特異性位點稱作att（attachment）位點，在上述過程中，病毒DNA上的attA位點與細菌DNA上的attB位點發生重組，而其他位點不會發生，這就屬於位點特異性重組的例子。

### 效率

現已發現兩個因素會影響Cre-lox重組的效率。第一個因素是lox序列中不對稱區段的鹼基序列，突變的lox序列會表現出與野生型不同的重組效率，但一般低於野生型。推測這可能是因為突變的鹼基影響了反應中間體的生成和解離。

第二個影響因素是一對lox序列之間floxed序列的長度，Cre-lox重組的效率隨著其長度的增大而降低，或許是因為反應動力學的影響。floxed序列在基因組中的位置會對Cre重組酶的結合有影響，也會影響重組效率。此外，cre基因的啟動子選擇也很重要，低表達的啟動子往往會造成異常的重組結果。

### 時間控制

在Cre-Lox重組系統中常用的表達調控機制還有三苯氧胺誘導系統。通過在Cre酶的蛋白序列上添加一個雌激素受體結構域，可以實現重組反應在特定時間點的觸發。重組過後的Cre酶在沒有三苯氧胺的情況下會被運輸到細胞質中，不能介導重組反應；當我們加入三苯氧胺後，三苯氧胺可以與Cre蛋白上的受體結構域結合，並導致其被運送到細胞核中，從而使重組反應可以進行。

## Cre-lox系統的自然功能

P1噬菌體是一種溫和噬菌體，既可以進行裂解循環也可以進行溶源循環。在裂解循環的情況下，一旦噬菌體的基因組進入細菌體內，噬菌體的蛋白就開始表達，新的病毒粒子開始組裝，細菌很快就會裂解並釋放出大量新的噬菌體，從而繼續這個循環；在溶源循環中，噬菌體的基因組將和宿主的基因組共存，並在宿主分裂時傳入子細胞，直到某些刺激（紫外線、飢餓等）導致其轉入裂解循環。

溫和噬菌體中，有的會像λ噬菌體一樣，在溶源期間將其基因組整合進宿主的基因組內。但是P1噬菌體的基因組則是以質粒的形式存在於宿主的細胞內，這時Cre-lox系統就會發揮功能：幫助環化線性的噬菌體DNA、分開複製後連結的兩個質粒DNA分子使其平均分配到兩個子細胞中，還可能作為備選的複製方式來維持質粒DNA的拷貝數。

## 多對loxP位點的插入

多種loxP的變體，特別是lox2272和loxN，被用於產生不同Cre-lox重組（誘導的和組成的）的結合體，從而實現小鼠腦部多達4種的螢光顯色（「Brainbow」系統）。

## 外部連結

- Introduction to Cre-lox technology by the "Jackson Laboratory"