聚合酶連鎖反應（，縮寫：PCR）又稱多聚酶鏈式反應，是一項利用 DNA 雙鏈複製的原理，在生物體外複製特定 DNA 片段的核酸合成技術。透過這項技術，可在短時間內大量擴增目的基因（標的基因），而不必依賴大腸桿菌或酵母菌等生物體。DNA 體外擴增的實現首先基於 DNA 半保留複製原理，還有鹼基互補配對原則，即複製的過程中雙鏈 DNA 會解鏈，由雙鏈變成單鏈，溫度一般為 95；之後溫度降下來，引物會結合到 DNA 單鏈上，在 DNA 聚合酶的作用下，把遊離的 dNTP 按照鹼基互補配對原則結合到單鏈上，形成一條由舊鏈和新鏈雜合成的新的雙鏈 DNA。這個過程可概括為變性、黏合、延伸三個基本步驟。 PCR 是一種簡單，廉價和可靠的複製 DNA 片段的方法， 可能也是分子生物學中使用最廣泛的技術。這個概念適用於現代生物學和相關科學的許多領域，如生物醫學研究，犯罪取證和分子考古學等。 微生物複製是一個費時耗力的流程。首先要將 DNA 經限制酶剪裁，再利用連線酶（Ligase）加到運載體（Vector）中，之後利用受控電脈衝瞬間電擊，在質膜上形成可逆性微孔的 電穿孔（electroporation）或是利用生理極限高溫刺激的 熱休克（heat shock）的方式，送到大腸桿菌感受態細胞（competent cell）中，將此菌於培養皿大量繁殖培養，再經過繁複的分離、純化過程，時間通常需要近一週，才能大量複製片段。所以僅需一小時的 PCR 能節省大量時間和繁複的操作，聚合酶鏈式反應技術被廣泛地運用在醫學和生物學的實驗室，例如用於判斷檢體中是否會表現某遺傳疾病的圖譜、傳染病的診斷、基因複製，以及親子鑑定。 歷史 Baby Blue a prototype polymerase chain reaction PCR c 1986 9663810586jpg 最早的 PCR 機器 Baby Blue 1986Thermocycler Thermocycler2JPG 能協同操作的兩組式機器 Cycler offenJPG8 塊加熱板的迴圈機型 凱利穆利斯（Kary Mullis）Mullis Kary B et al Process for amplifying detecting andorcloning nucleic acid sequences ，時為 Cetus 公司的僱員，於 1983 年開發了此技術。這項技術使他成為 1993 年諾貝爾化學獎的獲得者。穆利斯的想法是，利用一種人工方法，和反覆相同程式的方法，並利用一種特殊的酶 即 DNA 聚合酶來擴增特定的 DNA 片段。 DNA 聚合酶天然存在於生物體內，在細胞分裂前進行 DNA 的複製。當 DNA 開始複製時，解旋酶將雙股的 DNA 分開成兩個單股。DNA 聚合酶便結合在兩 DNA 單股鏈上，生成互補鏈。在穆利斯最初的聚合酶鏈式反應中，將 DNA 聚合酶用於體外試驗。但是，沒有採用正常細胞常溫解旋的方法，而是把雙鏈 DNA 加熱到 96，使得雙鏈分離成為兩條單鏈。但是在這個溫度下，DNA 聚合酶被破壞，因此在每個迴圈的加熱步驟後必須補充新的聚合酶。穆利斯的原始聚合酶鏈式反應效率極低，需要大量時間和 DNA 聚合酶，並且在整個聚合酶鏈式反應中都需要人來照看。 後來，由嗜熱細菌水生棲熱菌（Thermus aquaticus）體內產生的 DNA 聚合酶改善了這種低效的聚合酶鏈式反應。由於嗜熱細菌生活在溫度達到 50 至 80 C（122 至 176 F）的間歇泉中，它的 DNA 聚合酶具有耐熱性。在用於聚合酶鏈式反應時，高溫並不能破壞這種 DNA 聚合酶，因此不需要不斷加入新的聚合酶，聚合酶鏈式反應由此變得簡單並且可以由機器操作。 最初的具有耐熱性的 DNA 聚合酶來自於水生棲熱菌（Thermus aquaticus），是 1976 年臺灣科學家錢嘉韻（Alice Chien）從黃石國家公園發現的，因此被稱為 Taq。Taq 酶被廣泛用於當前的聚合酶鏈式反應操作中，Taq 酶的缺點是它缺少 35 校正外切酶活性，因此在複製 DNA 時有時會出錯，造成 DNA 序列突變（錯誤）。但是又是從古菌中獲得的 Pwo 酶及 Pfu 酶，發現均有校正機制，能夠大大降低聚合酶鏈式反應中的突變。將 Taq 與 Pfu 結合使用可以保證真實準確的能夠擴增 DNA。不但如此，現在一些廠商利用蛋白質的模擬分析，將 DNA 聚合酶的結構進行人工修改，還可以合成出效能遠超原本自然提取而來的酶。 專利之爭 聚合酶鏈式反應技術的專利由 Cetus 公司持有，穆利斯發明聚合酶鏈式反應技術的時候在那個公司工作。Taq 聚合酶也受專利保護。關於這個技術有幾個訴訟案，包括著名的杜邦訴訟案。製藥公司 HoffmannLa Roche 於 1992 年買下了專利並持有至今。 在世界各地的多個司法管轄區，羅氏與 Promega 公司與 Taq 聚合酶相關的專利爭鬥仍然在繼續。法律上的爭論已經超出了聚合酶鏈式反應和 Taq 聚合酶專利的期限，這些專利已於 2005 年 3 月 28 日到期。 操作過程 聚合酶鏈式反應用於擴增一小段已知的 DNA 片段，可能是單個基因，或者僅僅是某個基因的一部分。與活體生物不同的是，PCR 只能複製很短的 DNA 片段，通常不超過 10kbp。DNA 是雙鏈分子，因此用互補 DNA 雙鏈的構造單位（核苷酸）來度量其大小，單位為鹼基對（base pair bp）。某些特定的方法可以擴增 40kbp 左右的片段，但是這種大小與真核細胞的染色體 DNA 相比仍然是很少的。例如，人的體細胞 DNA 含有大約 30 億個鹼基對。目前應用的聚合酶鏈式反應需要幾個基本組成： DNA 模板（template），含有需要擴增的 DNA 片段。 2 種引物（primer），決定了需要擴增的起始和終止位置。（見下面引物一節） DNA 聚合酶（polymerase），複製需要擴增的區域。 脫氧核苷三磷酸（dNTP），用於構造新的互補鏈。 含有鎂離子的緩衝體系，提供適合聚合酶行使功能的化學環境。 聚合酶鏈式反應在熱迴圈裝置中進行。PCR 儀可以將反應管加熱或冷卻到每步反應所需的精確的溫度。為防止反應體系中液體產生蒸氣，通常在反應管上加蓋加熱的蓋子（比加熱板溫度來的高），或者在反應體系表面加入一層石蠟油。 引物 特定的專一性引物決定了所擴增的 DNA 片段。而引物（primer）本質上是人工合成的短 DNA 片段，一般不超過 50 個鹼基（通常 18－25 個），它們與所要擴增的 DNA 片段的起始和終止區域完全互補。在 黏合 時引物結合於 DNA 模板的起始和終止點，DNA 聚合酶結合到這兩個位置，開始合成新的 DNA 鏈。 選擇引物的長度和熔點（Tm）要考慮許多條件。引物的熔點與聚合酶鏈式反應第一步中 DNA 的熔點不同，是指 50％的引物與模板結合的溫度，高於這個溫度的引物與模板就不能有效結合。這個溫度隨著引物長度的增加而升高。如果引物長度太短，就有可能與 DNA 模板的幾個位置結合，造成非特異性複製。另一方面，引物長度也受限於 Tm。如果 Tm 太高，即高於 80，也會導致問題，因為 DNA 聚合酶在此溫度下活性較低。引物最優長度通常為 20 到 40 個鹼基，熔點從 60到 75。 有時也用到簡併引物，是一些相似但不相同的引物的混合物。通常用於從不同的生物 DNA 中擴增相同的基因，因為這些基因通常都是近似但不相同的。應用兼併引物的另一種情況是根據蛋白質序列設計引物時，由於幾個不同的密碼子都能編碼一個氨基酸，通常難以判斷在 DNA 中究竟是哪個密碼子編碼的這個氨基酸。例如編碼異亮氨酸的引物可能使用 ATH，A 是腺嘌呤，T 是胸腺嘧啶，H 可能是腺嘌呤，胸腺嘧啶或者胞嘧啶（關於鹼基如何編碼蛋白質，可檢視遺傳密碼）。使用簡併引物在很大程度上降低了聚合酶鏈式反應擴增等特異性，這個問題可以使用遞減 PCR（touchdown PCR）部分地解決。 基於上述考慮，設計引物可以採取以下原則： GC 所佔比例為 40％－60％ 計算兩個引物的 Tm（Tm 值 4 GC 2 AT），使之不相差 5，並且擴增產物的 Tm 與引物的相差不超過 10。 黏合溫度通常比計算的最低 Tm 低 5，但是要根據經驗為不同條件下的聚合酶鏈式反應選擇不同的黏合溫度。 內部的具有自身互補性的髮夾結構不超過 4 個，其二聚體中不超過 8 個。 3 末端尤其重要，必須不含有與其他引物互補的序列，並且要與模板完全互補。 現有一些幫助設計引物的程式（見外部連結）。 步驟 一般的聚合酶鏈式反應由 20 到 35 個迴圈組成，每個迴圈包括以下 3 個步驟： 變性：利用高溫（9398）使雙鏈 DNA 分離。高溫將連線兩條 DNA 鏈的氫鍵打斷。在第一個迴圈之前，通常加熱長一些時間以確保模板和引物完全分離，僅以單鏈形式存在。該步驟時間 12 分鐘，接下來機器就控制溫度進入迴圈階段。 黏合，又稱復性、退火、降溫貼合、緩冷配對、引子黏合：在 DNA 雙鏈分離後，降低溫度使得引物可以結合於單鏈 DNA 上。此階段的溫度通常低於引子熔點 5。錯誤的黏合溫度可能導致引物不與模板結合或者錯誤地結合。該步驟時間 12 分鐘。新技術的融合型核酸聚合酶在此階段的溫度會高於熔點 35，僅需時間 510 秒。 延長：DNA 聚合酶由降溫時結合上的引子開始沿著 DNA 鏈合成互補鏈。此階段的溫度依賴於 DNA 聚合酶。該步驟時間依賴於聚合酶以及需要合成的 DNA 片段長度。傳統的 Taq 估計合成 1000bp 大概需要 1 分鐘、較新的 Tbr（來自於嗜熱菌 Thermus brockianus）約 40 秒、商業公司生產的融合型聚合酶僅需約 1015 秒。有修正功能的則會比較慢。 例項 最佳化聚合酶鏈式反應 在實踐中，聚合酶鏈式反應可以因各種原因而失敗，原因可能是由於其對於汙染的敏感性，導致擴增出錯誤的 DNA 產物。因此，人們已經開發了一些技術和步驟來最佳化聚合酶鏈式反應的反應條件，透過將聚合酶鏈式反應前的混合物與潛在 DNA 汙染物分開的實驗室方案和流程解決了外源 DNA 的汙染問題。這通常包括從用於分析的區域分離出聚合酶鏈式反應的設定區域（聚合酶鏈式反應產物的純化）、一次性塑膠製品的使用以及對反應裝置之間的工作臺面徹底清潔。引物的設計技術在改善聚合酶鏈式反應產物產率和避免雜產物的形成是很重要的。替代緩衝成分和聚合酶的使用有助於較長或存在其他問題的 DNA 區域的擴增。在緩衝體系中加入試劑，如甲醯胺，或會增加聚合酶鏈式反應的特異性和產量。此外，可以利用計算機模擬理論聚合酶鏈式反應結果（電子聚合酶鏈式反應），以協助引物的設計。 最新進展 PCR 及其延伸技術 遞減 PCR（touchdown PCR）：前幾迴圈溫度逐漸下降。 逆轉錄 PCR（RTPCR）：以由 mRNA 逆轉錄而來的 cDNA 為模板，也因為是從表現型基因來進行增量的，由此產生出來的 cDNA 產物不帶有內含子（基因中不具意義的段落），常應用於分子克隆技術。 熱啟動 PCR（hot start PCR）：以高熱活化型核酸聚合酶進行反應，減少非專一性產物。 即時 PCR（realtime PCR）：PCR 過程中利用螢光探針或染料定量檢測，又稱定量 PCR（quantitative PCR），可以進行多組對比。 巢式 PCR（nested PCR）：先用低特異性引物擴增幾個迴圈以增加模板數量，再用高特異性引物擴增。 多重 PCR（multiplex PCR）：在同一個管中使用多組引物。 復原條件 PCR（reconditioning PCR）：PCR 產物稀釋 10 倍後重新放入原濃度的引物和 dNTP 等迴圈 3 次，以消除產物中的異二聚體。 dsRNA 合成（dsRNA replicator）：合併使用 highfidelity DNA polymersae、T7 RNA 聚合酶與 Phi6 RNA replicase；從雙股 DNA 轉錄為對應的雙股 RNA（dsRNA）。可應用於 RNAi 實驗操作。 （COLDPCR coamplification at lower denaturation temperaturePCR） 用以檢測突變或特殊等位基因的 PCR 應用技術。 數字 PCR（DigitalPCR digital polymerase chain reaction）：將標準的 PCR 反應分割至每一個反應中僅 12 個 copy。藉以偵測微小比例的基因差異。應用於：癌症突變基因、病原體檢測、藉由母血對胎兒做產前檢測。 一般 PCR 的原理是，靠著探針偵測設定的遺傳目標序列，接著經歷升溫、降溫的迴圈，將目標不斷複製放大，直到能夠判斷訊號。判斷陽性的標準，英文稱作「cycle threshold （CT） value」，即是 CT 值。例如，若迴圈 35 次後能識別目標存在，CT 值便是 35。 通常樣本內的病毒含量愈高，複製愈少次，便足以判斷陽性。舉例來說，原始量多隻需 20 次，便能放大到超過足夠的量；原始量低需要到 35 次，才能放大到有存在感。（或是可以想像成自己的存款，要翻倍幾次才會超過 1 億元；存款愈多的話，需要翻倍愈少次。） 應用 鑑定基因 人體內的細胞共有約為 30 億個鹼基對的 DNA，每個人的 DNA 會有差異，具有差異的鹼基對數目達幾百萬之多，因此透過分子生物學方法顯示的 DNA 圖譜也因人而異，由此可以識別不同的人。所謂 DNA 指紋，就是把 DNA 作為像指紋那樣的獨特特徵來識別不同的人。由於 DNA 是遺傳物質，因此透過對 DNA 鑑定還可以判斷兩個人之間的親緣關係。 親子鑑定 診斷遺傳病 聚合酶鏈式反應允許白血病、淋巴瘤等惡性疾病的早早期診斷。此法是當今癌症研究中最發達的，並已被常規使用。聚合酶鏈式反應分析能以高於其他細胞 10000 倍的敏感度在核酸 DNA 樣本中直接探測具特定轉錄的惡性細胞。 聚合酶鏈式反應同樣可以對不可培養的或生長緩慢的微生物（如分支桿菌、厭氧細菌、組培分析和動物模型中的病毒）進行定位。在微生物學中，聚合酶鏈式反應診斷性應用的基礎是傳染媒介的探測和從病原種系中藉助特定基因的分離出非致病的種系。 複製特定基因 基因工程中目的基因常用 PCR 技術擴增，再匯入載體內，以增加匯入成功的機率。 誘變 分析遠古 DNA 鑑定特定表型的突變體基因 比較基因表達量 基因圖譜建立 偵測遺傳疾病 基因突變研究 DNA 遺傳演化 基因表現比較 參考資料 外部連結 PrimerBLAST NCBI 提供的線上 primer 設計與比對軟體 The reference in realtime PCR eQMSDNA DNA Fingerprint Software 重疊延伸 PCR 克隆 Category 分子生物學 Category 實驗室技術 CategoryDNA 圖譜技術 Category 放大器 Category 羅氏藥廠 Category 生物技術 Category 分子生物學技術 Category 美國發明