寡核苷酸是短 DNA 或 RNA 低聚物，在基因檢測、研究和法醫學方面有廣泛的應用。寡核苷酸通常在實驗室裡透過固相化學合成法制備 1，並可以按照使用者的需求合成指定序列的小片段核酸，對基因合成、聚合酶鏈式反應（PCR）、DNA 測序、分子克隆至關重要。在自然界中，寡核苷酸通常以小 RNA 分子的形式出現 ，在基因表達的調控中發揮作用（如 microRNA）2；或者是較大核酸分子分解後的降解中間體。 寡核苷酸的特點是由構成整個分子的核苷酸殘基序列決定的。寡核苷酸的長度通常用 mer（來自希臘語 meros，部分 的意思）來表示。例如，具有 6 個核苷酸（nucleotide nt）的寡核苷酸，被稱為六聚體，而一個 25 nt 的寡核苷酸通常被稱為 25mer。寡核苷酸很容易以序列互補的方式與各自的互補寡核苷酸、DNA 或 RNA 結合形成雙鏈體，或較少的更高級別的混合體。這一基本特性是使用寡核苷酸作為探針來檢測 DNA 或 RNA 特定序列的基礎。使用寡核苷酸的應用包括 DNA 微陣列，Southern 印跡，等位基因特異性寡核苷酸分析 3， 熒光原位雜交（FISH），PCR 和人工基因的合成。 寡核苷酸由 2 脫氧核糖核苷酸組成，可以在骨架上或脫氧核糖的 2 號位進行修飾，以達到不同的藥理效果。這些修飾使寡核苷酸具有新的特性，使其成為反義的關鍵因素 45。 寡核苷酸的合成 寡核苷酸是使用天然或化學修飾的受保護的核苷亞磷醯胺或在較小程度上使用非核苷化合物透過化學方法合成的。寡核苷酸鏈組裝是按照稱為 合成迴圈 的常規程式從 3 到 5 方向進行的。單個合成迴圈的完成使生長鏈新增一個核苷酸殘基。一般來說，寡核苷酸序列通常很短（1325 個 nt）6。 合成寡核苷酸的最大長度幾乎不超過 200 個核苷酸殘基。 HPLC 或其他方法可用於分離具有所需序列的產物。 寡核苷酸的化學修飾 合成化學穩定的短寡核苷酸是反義寡核苷酸（ASO）療法的首個挑戰。天然存在的寡核苷酸很容易被細胞內豐富的核酸酶降解 7， 短寡核苷酸序列也具有弱的內在結合力和親和力，這有助於它們在體內降解 8。 骨架修飾 核苷酸的核苷有機硫代磷酸鹽 Phosphorothioate，PS 類似物可以使構成的寡核苷酸具備一些有利的特徵。對寡核苷酸進行 PS 骨架修飾可以抵抗核酸酶的降解 10。由於其可以在大多數核苷酸上相對容易和精準的實現，因此該策略能夠被廣泛的使用 9。 此外有研究報道，寡核苷酸 5 和 3 端的熒光修飾可以用於評估寡核苷酸的結構、動力學和與環境的相互作用 11。 糖環修飾 另一種有利於寡核苷酸醫學應用的修飾是糖環 2 位的羥基 氫修飾。透過 2 位羥基 氫的修飾可以增強寡核苷酸與靶標的結合能力從而提高寡核苷酸的有效性，在反義寡核苷酸療法中尤為有效 8。 這一策略還可以減少非特異性蛋白質結合，提高靶向特定蛋白質的準確性 8。兩種最常用的修飾是 2O 甲基和 2O 甲氧基乙基 8。核鹼基的熒光修飾也已經被報道 11。 反義寡核苷酸 反義寡核苷酸是與目標序列互補的 DNA 或 RNA 單鏈 6。其中反義 RNA 可以與特定信使 RNA mRNA 結合，從而阻止蛋白質翻譯，這一過程稱為雜交 12。 反義寡核苷酸可用於靶向特定的互補（編碼或非編碼）RNA。 如果發生結合，雜交體可以被 RNase H 酶降解 12。RNase H 是一種水解 RNA 的酶，用於反義寡核苷酸應用時，會導致 mRNA 表達下調 80956。 使用 Morpholino 反義寡核苷酸在脊椎動物中進行基因敲除，是由 Janet Heasman 首先使用 Xenopus 開發的用於研究改變的基因表達和基因功能的一項發育生物學的標準技術 13。FDA 批准的嗎啉代藥物包括 eteplirsen 和 golodirsen。反義寡核苷酸也被用於抑制流感病毒在細胞系中的複製 1415。 由單個突變蛋白引起的神經退行性疾病是反義寡核苷酸療法的良好靶點，因為反義寡核苷酸能夠以高選擇性靶向和修飾非常特定的 RNA 序列 3。 許多遺傳疾病，包括亨廷頓舞蹈病、阿爾茨海默病、帕金森病和肌萎縮側索硬化症，都與 DNA 改變有關，這些改變導致了不正確的 RNA 序列，造成了具有毒性生理效應的錯誤翻譯的蛋白 16。 寡核苷酸的細胞內化 寡核苷酸的細胞攝取 內化仍然是實現寡核苷酸療法成功的最大障礙。寡核苷酸的直接內化受到聚陰離子骨架的阻礙。 寡核苷酸的細胞攝取和細胞內運輸到作用地點的確切機制仍不清楚。此外，寡核苷酸結構 修飾和細胞型別的微小差異會導致細胞攝取 內化的巨大差異。細胞內化主要以能量依賴性方式（受體介導的內吞作用）進行，但不排除能量非依賴性被動擴散（gymnosis）。 透過細胞膜後，寡核苷酸治療劑被包裹在早期內體中，這些內體被運輸到晚期內體，後者最終在低 pH 值下與含有降解酶的溶酶體融合 17。 為了發揮其治療功能，寡核苷酸需要在其降解之前逃離內體。直到今天，還沒有通用的方法來克服遞送、細胞攝取和內體逃逸的問題，但存在幾種方法總是針對特定細胞 18。 將寡核苷酸療法與負責細胞識別 攝取的實體共軛，不僅會增加攝取，而且還被認為會降低細胞攝取的難度，因為此時主要涉及一種（理想上已知的）機制 17。 這已經透過小分子 寡核苷酸結合物實現，例如帶有靶向肝細胞受體的 N 乙醯半乳糖胺 19。這些共軛物是獲得更多的細胞攝取和靶向遞送的極好例子，因為相應的受體在目標細胞上過度表達，導致靶向治療 18。另一個廣泛使用和深入研究的用於靶向遞送和增加寡核苷酸細胞攝取的實體是抗體。 分析技術 色譜法 烷基醯胺可用作色譜固定相 20。這些固定相已被研究用於分離寡核苷酸 21。離子對反相高效液相色譜法被用於分離和分析自動合成的寡核苷酸 22。 質譜 5 甲氧基水楊酸和精胺的混合物可用作 MALDI 質譜中寡核苷酸分析的基質 23。電噴霧電離質譜 ESIMS 也是表徵寡核苷酸質量的強大工具 24。 DNA 微陣列 DNA 微陣列是寡核苷酸的一種有用的分析應用。與標準 cDNA 微陣列相比，基於寡核苷酸的微陣列對雜交具有更好的可控特異性，並且能夠測量選擇性剪接或聚腺苷酸化序列的存在和普遍性 25。 DNA 微陣列的一個子型別可以被描述為高密度結合寡核苷酸的基質（尼龍、玻璃等）26。 DNA 微陣列在生命科學中有許多應用。 參考文獻 1 Yang J Stolee JA Jiang H Xiao L Kiesman WF Antia FD et al October 2018 SolidPhase Synthesis of Phosphorothioate Oligonucleotides Using Sulfurization Byproducts for in Situ Capping The Journal of Organic Chemistry 83 19 1157711585 doi101021acsjoc8b01553 PMID 30179468 S2CID 52157806 2 Qureshi A Thakur N Monga I Thakur A Kumar M 1 January 2014 VIRmiRNA a comprehensive resource for experimentally validated viral miRNAs and their targets Database 2014 bau103 doi101093databasebau103 PMC 4224276 PMID 25380780 3 Monga I Qureshi A Thakur N Gupta AK Kumar M 2017 ASPsiRNA A Resource of ASPsiRNAs Having Therapeutic Potential for Human Genetic Disorders and Algorithm for Prediction of Their Inhibitory Efficacy G3 Genes Genomes Genetics 7 9 29312943 doi101534g3117044024 PMC 5592921 PMID 28696921 4 Weiss B ed 1997 Antisense Oligodeoxynucleotides and Antisense RNA Novel Pharmacological and Therapeutic Agents Boca Raton Florida CRC Press 5 Weiss B Davidkova G Zhou LW 1999 Antisense RNA gene therapy for studying and modulating biological processes Cellular and Molecular Life Sciences 55 3 33458 doi101007s000180050296 PMID 10228554 S2CID 9448271 6 Dias N Stein CA March 2002 Antisense oligonucleotides basic concepts and mechanisms Molecular Cancer Therapeutics 1 5 34755 PMID 12489851 7 Frazier KS January 2015 Antisense oligonucleotide therapies the promise and the challenges from a toxicologic pathologists perspective Toxicologic Pathology 43 1 7889 doi1011770192623314551840 PMID 25385330 S2CID 37981276 8 DeVos SL Miller TM July 2013 Antisense oligonucleotides treating neurodegeneration at the level of RNA Neurotherapeutics 10 3 48697 doi101007s1331101301945 PMC 3701770 PMID 23686823 9 Eckstein F April 2000 Phosphorothioate oligodeoxynucleotides what is their origin and what is unique about them Antisense Nucleic Acid Drug Development 10 2 11721 doi101089oli1200010117 PMID 10805163 10 Stein CA Subasinghe C Shinozuka K Cohen JS April 1988 Physicochemical properties of phosphorothioate oligodeoxynucleotides Nucleic Acids Research 16 8 320921 doi101093nar1683209 PMC 336489 PMID 2836790 11 Michel BY Dziuba D Benhida R Demchenko AP Burger A 2020 Probing of Nucleic Acid Structures Dynamics and Interactions With EnvironmentSensitive Fluorescent Labels Frontiers in Chemistry 8 112 Bibcode2020FrCh8112M doi103389fchem202000112 PMC 7059644 PMID 32181238 12 Crooke ST April 2017 Molecular Mechanisms of Antisense Oligonucleotides Nucleic Acid Therapeutics 27 2 7077 doi101089nat20160656 PMC 5372764 PMID 28080221 13 Heasman J Kofron M Wylie C June 2000 Betacatenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo a novel antisense approach Developmental Biology 222 1 12434 doi101006dbio20009720 PMID 10885751 14 Kumar P Kumar B Rajput R Saxena L Banerjea AC Khanna M November 2013 Crossprotective effect of antisense oligonucleotide developed against the common 3 NCR of influenza A virus genome Molecular Biotechnology 55 3 20311 doi101007s1203301396708 PMID 23729285 S2CID 24496875 15 Kumar B Khanna M Kumar P Sood V Vyas R Banerjea AC May 2012 Nucleic acidmediated cleavage of M1 gene of influenza A virus is significantly augmented by antisense molecules targeted to hybridize close to the cleavage site Molecular Biotechnology 51 1 2736 doi101007s120330119437z PMID 21744034 S2CID 45686564 16 Smith RA Miller TM Yamanaka K Monia BP Condon TP Hung G et al August 2006 Antisense oligonucleotide therapy for neurodegenerative disease The Journal of Clinical Investigation 116 8 22906 doi101172JCI25424 PMC 1518790 PMID 16878173 17 Hawner Manuel Ducho Christian 20201216 Cellular Targeting of Oligonucleotides by Conjugation with Small Molecules Molecules 25 24 5963 doi103390molecules25245963 ISSN 14203049 18 Crooke S T 2017 Cellular uptake and trafficking of antisense oligonucleotides Nat Biotechnol 35 3 230237 19 Prakash Thazha P Graham Mark J Yu Jinghua Carty Rick Low Audrey Chappell Alfred Schmidt Karsten Zhao Chenguang Aghajan Mariam Murray Heather F Riney Stan Booten Sheri L Murray Susan F Gaus Hans Crosby Jeff July 2014 Targeted delivery of antisense oligonucleotides to hepatocytes using triantennary Nacetyl galactosamine improves potency 10fold in mice Nucleic Acids Research 42 13 87968807 doi101093nargku531 ISSN 13624962 PMC 4117763 PMID 24992960 20 Buszewski B Kasturi P Gilpin RK Gangoda ME Jaroniec M August 1994 Chromatographic and related studies of alkylamide phases Chromatographia 39 34 15561 doi101007BF02274494 S2CID 97825477 21 Buszewski B Safaei Z Studzińska S January 2015 Analysis of oligonucleotides by liquid chromatography with alkylamide stationary phase Open Chemistry 13 1 doi101515chem20150141 22 Gilar M Fountain K J Budman Y Neue U D Yardley K R Rainville P D Russell Rj 2nd Gebler J C 20020607 Ionpair reversedphase highperformance liquid chromatography analysis of oligonucleotides Retention prediction Journal of Chromatography A 958 12 167182 doi101016S00219673 02 003060 ISSN 00219673 PMID 12134814 23 Distler AM Allison J April 2001 5Methoxysalicylic acid and spermine a new matrix for the matrixassisted laser desorptionionization mass spectrometry analysis of oligonucleotides Journal of the American Society for Mass Spectrometry 12 4 45662 Bibcode2001JASMS12456D doi101016S10440305 01 002124 PMID 11322192 S2CID 18280663 24 Shah S Friedman SH March 2008 An ESIMS method for characterization of native and modified oligonucleotides used for RNA interference and other biological applications Nature Protocols 3 3 3516 doi101038nprot2007535 PMID 18323805 S2CID 2093309 25 Relógio A Schwager C Richter A Ansorge W Valcárcel J June 2002 Optimization of oligonucleotidebased DNA microarrays Nucleic Acids Research 30 11 51e51 doi101093nar3011e51 PMC 117213 PMID 12034852 26 Gong P Harbers GM Grainger DW April 2006 Multitechnique comparison of immobilized and hybridized oligonucleotide surface density on commercial aminereactive microarray slides Analytical Chemistry 78 7 234251 doi101021ac051812m PMID 16579618 基因晶片 基因晶片有多種載體（玻璃、尼龍等），在這種晶片上，有高密度的寡核苷酸，可以對基因進行形態研究，基因轉譯表現研究可確診某些疾病。 Category 核酸