Sơ lược những phương pháp chẩn đoán huyết thanh - Phần 2

Bài viết được thực hiện bởi bác sĩ khoa Xét nghiệm - Bệnh viện Đa khoa Quốc tế Vinmec C en tra l Pa r k Có nhiều sự so sánh những kỹ thuật huyết thanh học được kể ra trong bài viết, có lẽ tốt nhất là thừa nhận những cái chung có thể làm, nhưng bổ sung bất kỳ kỹ thuật nào thì tùy thuộc rất nhiều vào tác nhân cụ thể và tình huống gây ra bệnh. Nói chung, có xu hướng tiến tới sự chuẩn hóa, thực hiện tự động với số lượng lớn bệnh phẩm và p oi nt - o f - ca re te s ting. 6. Miễn dịch huỳnh quang (Im mu no f lu o re s c en c e) Miễn dịch huỳnh quang gián tiếp được sử dụng trong nhiều chẩn đoán vi khuẩn, và tiếp tục được sử dụng trong nhiều mục đích tương tự. Chất nền sử dụng thường là môi trường thạch hay môi trường lỏng, vi khuẩn có thể mọc trên tế bào chân hạt (e u ka r y o ti c c e l l s) [ như ch la my di a e hay ri c ke t t sia e (50, 51)] hoặc là tế bào kết hợp [ đôi khi sử dụng huyết thanh học cho Ba r to ne l la hen se la e (52)]. Vi khuẩn có thể kết hợp hoặc không kết hợp với tế bào chân hạt, được gắn trên thủy tinh. Cơ chất được cho vào trong dãy huyết thanh pha loãng trong những giếng khác nhau trên lam kính, và kháng thể gắn huỳnh quang được sử dụng để phát hiện kháng thể người (hình 3). Tín hiệu phải được đọc bằng kính hiển vi huỳnh quang có độ lọc thích hợp. Kháng thể phát hiện có thể là I g G hoặc I g M. Trong quá khứ, sự hằng định của f lu o re s c e in kết hợp cơ chất là có vấn đề, nhưng vấn đề này được làm giảm bớt một cách đáng kể. Hơn nữa để phát quang, có một số chất phát huỳnh quang khác có thể được sử dụng để gắn với kháng thể. Cả phương pháp cố định và bản chất của vi khuẩn phân lập có thể ảnh hưởng đến chất lượng phát huỳnh quang. Hầu hết những biến thiên quan trọng là do người quan sát, những người này phải có sự am hiểu về cường độ phát quang dù bất kể phương pháp tính điểm hay tiêu chuẩn sử dụng để xác định điểm cuối phát huỳnh quang (f lu o re s c en c e en d - p oi nt). Chỉ vì lý do này, hiệu giá của I F A có thể thay đổi theo những nơi thử khác nhau. Đánh giá tốt nhất là mang đến nơi có kinh nghiệm nhiều trong quan sát kính hiển vi huỳnh quang hơn là ở nơi mà không thường làm. Do phát hiện I g M dễ dàng nên I F A được sử dụng cho chẩn đoán nhanh, vì I F A có thể thực hiện xong trong vòng vài giờ. Hiệu giá I g M có ý nghĩa trong I F A có xu hướng tương đối thấp khi so sánh với hiệu giá I g G. Sự thay đổi I g G - I F A hơn bốn lần sẽ có ý nghĩa như là thử nghiệm C F. Sự thay đổi I g G - I F A hơn bốn lần sẽ có ý nghĩa như là thử nghiệm C F. Nhiều thử nghiệm I g M - I F A đã có dạng thương mại và một số trong đó còn đang được tiếp tục sử dụng. Hầu hết những những thử nghiệm tốt là những phương pháp phát hiện I g M. Thử nghiệm I g M - I F A có thể nhạy nhưng không đặc hiệu với yếu tố thấp (r he u ma toi d f a ct o r). Những thử nghiệm I F A qui ước như trên, sử dụng giá cứng và được quan sát trực tiếp bằng kính hiển vi, nhưng thử nghiệm huỳnh quang pha cứng có thể cũng được đọc bằng máy đọc tự động. Điều này dựa trên hệ thống F I A X (53). Hơn nữa, dấu hiệu huỳnh quang có thể được sử dụng trong pha lỏng nhờ đó sự tương tác kháng nguyên - kháng thể được xảy ra trong pha lỏng tốt hơn là trong pha cứng. 7. Miễn dịch phóng xạ (Ra di o im mu noa s say) Sử dụng dấu hiệu đồng vi phóng xạ được phát triển từ dấu hiệu huỳnh quang và những dấu hiệu khác, và phương pháp đo có khả năng tăng cường dấu hiệu phát hiện và độ nhạy. Nói chung, sử dụng miễn dịch phóng xạ trên pha cứng thì khá cũ trong chẩn đoán huyết thanh vi khuẩn và đã bị thay thế bởi E I A hơn 15 năm trước. Nói chung, sử dụng miễn dịch phóng xạ trên pha cứng thì khá cũ trong chẩn đoán huyết thanh vi khuẩn và đã bị thay thế bởi E I A hơn 15 năm trước. Mặc dù đồng vị phóng xạ cho kết quả nhạy hơn so với những phương pháp khác, điều này có thể hứa hẹn mở ra một chương liên quan tới cơ sở dấu hiệu. Sự khó khăn trong việc đánh giá ‘ si g na l - to - noi se ’ cũng là quan trọng trước tiên trong sự phát triển thử nghiệm có ích lợi, và biểu hiện ‘ g re y ’ z o ne s nhất thiết xảy ra. Sử dụng đồng vị phóng xạ và những tình hình đặc biệt liên quan là những yếu tố chống lại kỹ thuật này. Sự kết tủa đồng vị phóng xạ (54) với kháng nguyên vi khuẩn có gắn phóng xạ chủ yếu phục vụ cho những nghiên cứu để biết rõ về đáp ứng miễn dịch thể dịch giống như im mu no b lo t ting hiện nay, nhưng có mặt như là kiểu chẩn đoán huyết thanh quan trọng mặc dù có khả năng được sử dụng như là thử nghiệm xác định. 8.8. Những thử nghiệm miễn dịch trên pha cứng (So li d pha se im mu noa s say s) Sự ra đời của thử nghiệm miễn dịch trên pha cứng với kháng thể đánh dấu en z y m (en z y me im mu noa s say s; E I A) được chứng minh là một trong những tiến bộ quan trọng trong thời đại chẩn đoán huyết thanh, và nhiều thử nghiệm được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực chẩn đoán vi sinh học cũng như trong nhiều chẩn đoán y khoa khác (không phải lĩnh vực vi sinh) (55 - 57). Những biến thể của E I A thì nhiều, nhưng thường được áp dụng nhất là E I A, E I A tóm bắt kháng thể (an ti bo dy - ca p tu re E I A), và an ti bo dy - ca p tu re do u b le san d w i ch E I A (hình 4 - 6). Nhiều loại en z y me được sử dụng cho thử nghiệm E I A, nhưng thường được sử dụng nhất là p e ro xi da se và a l ka li ne pho s pha ta se. Bản chất của việc gắn kháng nguyên hoặc kháng thể với en z y me (mà không ảnh hưởng đến hoạt tính của en z y m) là hoạt tính này gây biến đổi cơ chất en z y me, sự thay đổi màu cơ chất sẽ chỉ định lượng kháng thể hiện diện trong huyết thanh. Rõ ràng như hình trên, thử nghiệm E I A là đơn giản và thích được sử dụng trong hầu hết những thử nghiệm chẩn đoán huyết thanh. Rõ ràng như hình trên, thử nghiệm E I A là đơn giản và thích được sử dụng trong hầu hết những thử nghiệm chẩn đoán huyết thanh. Thử nghiệm dạng này thì nhạy nên có thể cho kết quả dương tính giả khi kháng thể trong huyết thanh thử gắn trên giá cứng hay thành phần của kháng nguyên điều chế mà không thật sự gắn với kháng nguyên đặc hiệu của vi khuẩn. Cũng như vậy, kiểu cạnh tranh trực tiếp, thử nghiệm E I A gián tiếp cũng cho kết quả dương tính giả do nồng độ cao của kháng thể thuộc giống trong huyết thanh kết hợp không đặc hiệu với giá cứng. Vì những lý do này, thử nghiệm tóm bắt kháng thể được tạo ra. Thử nghiệm này có thể sử dụng kháng nguyên đánh dấu để phát hiện hoặc phức hợp san d w i ch mà kháng thể đánh dấu được phát hiện. Dù là gián tiếp hay tóm bắt kháng nguyên, E I A có thể sử dụng tìm kháng thể I g M hoặc I g G hay I gA; hơn nữa, phát hiện I g M là có giá trị vì có khả năng chẩn đoán chỉ với một bệnh phẩm huyết thanh. Thử nghiệm E I A dễ chuẩn hóa, tự động, quay vòng nhanh và có thể thử nhiều mẫu cùng lúc. Thử nghiệm có thể hoàn tất từ 3 - 5 giờ và một số phương pháp nhanh có thể rút ngắn thời gian từ 1 ⁄ 2 giờ đến 1 giờ. Thử nghiệm có thể hoàn tất từ 3 - 5 giờ và một số phương pháp nhanh có thể rút ngắn thời gian từ 1 ⁄ 2 giờ đến 1 giờ. Loại kháng nguyên sử dụng có thể thay đổi từ vi khuẩn nguyên thể đến so ni ca te s hoặc những thành phần trích xuất tinh khiết hay tổng hợp (p e p ti de s tổng hợp hoặc tái tổ hợp). Những kháng nguyên đó có thể là p ro te in s, li pi ds, ca r bo hy d ra te s, hoặc dạng kết hợp. Chúng được gắn thụ động hay chủ động trên giá cứng. Dung dịch đệm A l ka li ne ca r bo na te (pH ~ 9.0 - 9.5) làm gia tăng sự gắn kết của nhiều kháng nguyên trên những giá cứng thông thường. Chất dẻo và những biến thể của nó thường được sử dụng nhất làm giá cứng và hình thể của giếng thích hợp để rửa cho hầu hết những hệ thống. Sử dụng những hạt làm bề mặt kết hợp hoặc sử dụng những loại giá khác như thủy tinh, ni tro c e l lu lo se và n y lon cũng được quan tâm. Khi kháng nguyên được gắn vào giá cứng, có khả năng kháng thể trong huyết thanh bệnh nhân cũng gắn vào giá cứng theo kiểu giống như vậy do đó những chỗ còn có thể kết hợp cần phải được ngăn chặn lại bằng một số chất. Những dung dịch thích hợp để ngăn chặn bao gồm dung dịch đệm với a l bu min, ge la tin và sữa không kem. Những dung dịch thích hợp để ngăn chặn bao gồm dung dịch đệm với a l bu min, ge la tin và sữa không kem. Có nhiều cố gắng trong việc tăng cường hoạt tính en z y m bằng nhiều cơ chế (như khuếch đại dấu hiệu a vi din - bi o tin), nhưng hầu hết những cải tiến đó chỉ thu được những lợi ích về độ nhạy và thường trả giá bằng những vấn đề khác mà thường là liên quan đến độ đặc hiệu. Tuy nhiên, chất lượng của con j u ga te s được cải thiện rất lớn trong hơn 2 thập kỷ qua và kháng thể tinh chế cũng sẵn có. Sử dụng kháng thể đơn dòng hay là kháng thể đa dòng cũng đều có giá trị. Trong một số hệ thống, có thể không đánh dấu en z y m; sự phát quang bằng phản ứng hóa học (che mi lu mi ne s c en c e) tạo ra do sử dụng sự oxy hóa hợp chất tạo ra cuối cùng. Sử dụng hệ thống đọc tự động đã đơn giản hóa việc giải thích và đo lượng sản phẩm (re p ro du c i b le). Mặc dù thử nghiệm miễn dịch trên pha cứng chuẩn bao gồm lớp kháng nguyên và kháng thể, có nhiều sản phẩm chẩn đoán huyết thanh dạng thương mại ra đời và cũng sử dụng nguyên tắc miễn dịch học nhưng thời gian thử nghiệm nhanh hơn với thử nghiệm đơn giản chỉ một bước thực hiện (a sim p le o ne - s te p mem b ra ne a s say). Một số cách xét nghiệm nhanh được sử dụng trong thực tế như chẩn đoán huyết thanh He li co ba ct e r p y lo ri (58). Cả thử nghiệm miễn dịch trên pha cứng và thử nghiệm nhanh (ra pi d mem b ra ne a s say) đều có thể được sử dụng trong sàng lọc khi có số lượng lớn mẫu hoặc đơn giản chỉ do phương pháp là đơn giản. I g M đặc hiệu cho bệnh xuất hiện sớm khoảng 5 - 7 này sau khi bệnh trong một số nhiễm khuẩn mặc dù thường là từ 7 - 10 ngày. Xác định I g G có thể làm ở huyết thanh giai đoạn cấp và huyết thanh giai đoạn lui bệnh, tuy nhiên yêu cầu sự thay đổi tối thiểu của E I A cho chẩn đoán dương tính có thể còn là chủ đề bàn cãi. Tiêu chuẩn In te r p re ti ve c ri te ria thường bao gồm ‘ g re y z o ne ’ của kết quả nghi ngờ dựa vào hoạt tính en z y me đo ở quang phổ liên tục (con ti nu o u s s p e ct rum). Chọn ngưỡng chẩn đoán đặc hiệu còn là vấn đề quan trọng trong thử nghiệm miễn dịch. Những thử nghiệm ngăn chặn (B lo c kin g a s say s), sự có sự cạnh tranh kháng thể bởi sử dụng kháng thể đặc hiệu kháng nguyên khác, có thể sử dụng cho mục đích xác định, dù nhiều phương pháp thường được sử dụng trong tình huống đảm bảo kết quả dương tính khi thử nghiệm miễn dịch trên pha cứng để phát hiện kháng nguyên. Kháng thể mong muốn cũng có thể được ước lượng bằng những thử nghiệm miễn dịch này, dù điều này không thực sự có nhiều giá trị cho chẩn đoán huyết thanh. Bản chất của những thử nghiệm miễn dịch này làm tăng độ nhạy tối đa để có thể phát hiện được kháng thể từ nhiều tháng đến nhiều năm sau nhiễm khuẩn cấp, thậm chí cả I g M. I g M có thể khó hiểu nếu tác nhân quan tâm có khả năng nhiễm lại. Yếu tố thấp có thể cản trở giải thích chính xác kết quả I g M. Sự dư thừa I g G đặc hiệu cũng cản trở việc xác định I g M. Đối với vấn đề này, sự cản trở có thể được loại trừ bởi huyết thanh thử được hấp phụ I g G trước khi thử I g M. 9. Thử nghiệm miễn dịch trong pha lỏng (Li qui d pha se im mu noa s say s) Dĩ nhiên là sử dụng pha cứng là dễ dàng cho sự tương tác kháng nguyên - kháng thể như chi tiết ở trên, tuy nhiên pha lỏng sẽ thích hợp cho nhiều thử nghiệm xác định (59). Cơ bản là, sự thay đổi hoạt tính en z y me hoặc sự phát huỳnh quang có thể làm tăng sự kết hợp kháng nguyên và kháng thể thay đổi hoạt tính đánh dấu. Thử nghiệm có thể được chế ra dạng thử nghiệm một bước (o ne - s te p) và máy đọc tự động có thể sử dụng để chuẩn hóa việc định lượng. Thử nghiệm có thể được chế ra dạng thử nghiệm một bước (o ne - s te p) và máy đọc tự động có thể sử dụng để chuẩn hóa việc định lượng. Từ khi phản ứng được làm trong pha lỏng, bản chất của kháng nguyên cho phép phức hợp miễn dịch còn lơ lửng và rồi dạng này có lợi do kháng nguyên nhỏ hơn, như là những thành phần vi khuẩn, en z y me s hoặc độc tố vi khuẩn, hơn là vi khuẩn nguyên thể hoặc những phức hợp lớn. Chẳng hạn, một phương pháp bị ảnh hưởng bởi mức độ kháng sinh, như a mi no g ly co si de s. Thử nghiệm miễn dịch trong pha lỏng cũng được biết là thử nghiệm thuần nhất (ho mo gen eo u s). 10. l m mu no b lo t ting Thực chất, im mu no b lo t ting quy ước (thường nói đến là W e s te r n b lo t ting) để chẩn đoán huyết thanh là khác với những biến thể của E I A trên pha cứng (60 - 62). Sự khác biệt lớn là hiệu giá những giếng ở E I A trên pha cứng thường được đo bằng quang phổ kế (co lo ri me tri c), gián tiếp cho biết hiện diện kháng thể, ngược lại phản ứng của kháng thể với kháng nguyên đặc hiệu có thể nhìn trong thử nghiệm im mu no b lo t tách những kháng nguyên vi khuẩn ra (se g re ga te d ba ct e ria l an ti gen s). Hầu hết những kháng nguyên trong thử nghiệm im mu no b lo t ting được biểu hiện bằng những vạch khử so di um do de cy l su l pha te p o l ya cr y la mi de trên ge l điện di (S DS - PA GE) (63). Chúng sắp xếp theo sự thay đổi trọng lượng phân tử từ cao nhất đến thấp nhất trên đường di chuyển. Dù một số kháng nguyên có thể xuất hiện có tỉ lệ di chuyển nhất định liên quan đến trọng lượng phân tử chẩn, thật ra chúng có thể có khác biệt trọng lượng phân tử do diều kiện điện di và cấu trúc của kháng nguyên. Kiểu phân giải của kháng nguyên được di chuyển trên giá cứng sẽ biểu hiện cho kháng thể trong huyết thanh và gắn en z y m cho kháng thể phát hiện. Giá cứng có thể là n y lon, ni tro c e l lu lo se (thường nhất), và những dẫn xuất c e l lu lo se. Hầu hết những cấu trúc phân giải trong S DS - PA GE thường qui là toàn bộ hay từng phần p o ly p e p ti de s. Tuy nhiên, có thể kiểu phân giải của g ly co li pi ds sử dụng kỹ thuật khác và tiếp theo là im mu no b lo t ting, nhưng hiếm khi được khảo sát. Tuy nhiên phải thừa nhận rằng những kháng nguyên được nhận biết từ im mu no b lo t ting được chọn trước bởi quá trình mà đã chọn lựa sự phân giải và kích thước hoặc bản chất kháng nguyên có thể biểu hiện khác nhau. Im mu no b lo t ting có thể thực hiện chọn lọc cho kháng thể I g M, I g G hoặc I gA bằng cách sử dụng con j u ga te d thích hợp. Bản chất của thử nghiệm có khả năng đưa ra một phương pháp xác định huyết thanh học hơn những phương pháp khác sử dụng chất chỉ thị gián tiếp sự tương tác kháng nguyên - kháng thể. Điều này được minh họa tốt nhất bằng sử dụng im mu no b lo t ting trong bệnh Ly me (chương 25). Kiểu nhìn đáp ứng tương tự để chẩn đoán xác định có thể gồm 1 hay nhiều kháng nguyên. Có sự thay đổi đáng kể trong đáp ứng thể dịch với hầu hết vi khuẩn và nhiều tính không đồng nhất có thể thấy với im mu no b lo t ting ở đây nhiều phản ứng kháng nguyên được xác định một lần. Ngược lại có thể có một số kháng nguyên trội hơn thường được nhận biết, nhiều kháng nguyên khác có thể là chủ đề của sự nhận biết trái ngược nhau (the su b j e ct o f in con si s te nt re co g ni t ion). Hơn nữa, nhiều sự nhận biết là không tuyệt đối là âm tính hay dương tính khi những vạch chia độ dương tính có thể thấy đối với bất kỳ kháng nguyên đã nói (64). Thật vậy, những chi tiết của phương pháp có thể tạo ra ảnh hưởng lớn đến kết quả im mu no b lo t ting. Thật vậy, những chi tiết của phương pháp có thể tạo ra ảnh hưởng lớn đến kết quả im mu no b lo t ting. Cũng vậy, có thể thấy một số thay đổi của từng đợt chạy trong mô hình đáp ứng kháng thể (i t i s p o s si b le to se e so me run - to - run va ria t ion in an ti bo dy re s p on se pa t te r n s). Một số kháng nguyên có thể thường gặp ở nhiều vi khuẩn và do đó phải được xem xét thận trọng như là chỉ thị cho chẩn đoán huyết thanh, như p ro te in s roi của bo r re lia e và tre p o ne me s (65). Mặc dù kháng nguyên trội hơn có thể thấy, sự đặc hiệu của mô hình phản ứng dường như lớn hơn nếu sử dụng hơn một kháng nguyên trong tiêu chuẩn đánh giá dương tính. Trong những năm 1980, sự chuẩn hóa im mu no b lo ts là vấn đề rất khó khăn (66), nhưng đã có nhiều cải tiến trong lĩnh vực này, như là chế ra thử nghiệm im mu no b lo ts dạng thương mại cho kết quả đáng tin cậy. Sự giải thích tình huống im mu no b lo t dương tính để chuẩn đoán cho tất cả các nơi trên thế giới phải được xem xét cẩn thận từ đó nó có thể đảm bảo rằng phản ứng kháng nguyên sẽ giống nhau khi cơ chất kháng nguyên thông thường được sử dụng. Thí dụ trong bệnh Ly me (xem chương 25), thấy rõ có một số khác biệt đáng kể về cấu trúc giữa chủng ở Bắc Mỹ và chủng ở Châu Âu. Thí dụ trong bệnh Ly me (xem chương 25), thấy rõ có một số khác biệt đáng kể về cấu trúc giữa chủng ở Bắc Mỹ và chủng ở Châu Âu. Một khó khăn của im mu no b lo t ting, thậm chí khi chất nền (su bs tra te s) là dạng thương mại, đòi hỏi rằng phương pháp có thể sử dụng cho số lượng bệnh phẩm ít và thông thường cho mục đích xác định hơn là thử cho một lô nhiều bệnh phẩm. Sự sản xuất p o ly p e p ti de từ tế bào nguyên thể, có thể làm hư những p ro te in s khác từ môi trường tăng trưởng, làm xuất hiện lợi ích lý thuyết tăng cơ hội kể cả những kháng nguyên không đặc hiệu. Về mặt này, hứa hẹn trong tương lai sẽ phát minh những kháng nguyên tinh chế và tái tổ hợp có thể giải quyết tình trạng trên (67). Im mu no b lo t ting có thể là kỹ thuật rất nhạy so với phương pháp E I A. Vì tất cả kháng thể mất đi sau vài tháng nhiễm khuẩn, sự thay đổi trong mô hình im mu no b lo t có thể khác nhau như là hoạt tính kém hơn những kháng nguyên thông thường không xuất hiện trước tiên (68). Mời Quý vị theo dõi bộ tài liệu về Chẩn đoán huyết thanh bệnh nhiễm trùng của Bác sĩ Trần Thị Ngọc Anh bao gồm: Chẩn đoán huyết thanh bệnh nhiễm trùng Kháng nguyên và sự biến đổi kháng nguyên Mối liên hệ kháng nguyên Tính không đặc hiệu của đáp ứng miễn dịch thể dịch Sơ lược những phương pháp chẩn đoán huyết thanh - Phần 1 Sơ lược những phương pháp chẩn đoán huyết thanh - Phần 2 Những khía cạnh của sự sử dụng (Gen e ra l a s p e c ts o f u ti li z a t ion) trong chẩn đoán huyết thanh Tình huống phức tạp trong chẩn đoán huyết thanh Nguồn: Ne vi o C i mo lai Chi l d ren ’ s an d W o men ’ s He a l t h C en tre o f B ri ti s h Co lum bia, Van co u ve r, B ri ti s h Co lum bia, Ca na da