中华人民共和国上海知识产权法院
民 事 判 决 书
（2016）沪73民初896号
原告：王召印(ZHAOYINWANG)，男，1962年9月15日出生，住中华人民共和国上海市徐汇区。
委托诉讼代理人：娄俊，上海市君悦律师事务所律师。
委托诉讼代理人：叶杨斌，上海市君悦律师事务所律师。
被告：贝达药业股份有限公司，住所地中华人民共和国浙江省杭州市。
法定代表人：丁列明，该公司董事长、总经理兼首席执行官。
委托诉讼代理人：罗云，浙江天册律师事务所律师。
委托诉讼代理人：周琳，浙江天册律师事务所律师。
被告：上海倍而达药业有限公司，住所地中华人民共和国(上海)自由贸易试验区郭守敬路XXX号XXX-XXX室。
法定代表人：张晓东，该公司董事长。
委托诉讼代理人：任立民，北京市隆安律师事务所上海分所律师。
委托诉讼代理人：吴志滔，北京市隆安律师事务所上海分所律师。
被告：张晓东(DONXIAODONGZHANG)，男，1957年11月7日出生。
委托诉讼代理人：任立民，北京市隆安律师事务所上海分所律师。
委托诉讼代理人：施菊花，北京市隆安律师事务所上海分所律师。
被告：谢国建(GUOJIANXIE)，男，1953年9月29日出生，住中华人民共和国湖南省长沙市。
被告：王印祥(YINXIANGWANG)，男，1965年2月10日出生。
原告王召印(ZHAOYINWANG)(以下简称王召印)与被告贝达药业股份有限公司(以下简称贝达公司)、上海倍而达药业有限公司(以下简称倍而达公司)、张晓东(DONXIAODONGZHANG)(以下简称张晓东)、谢国建(GUOJIANXIE)(以下简称谢国建)、王印祥(YINXIANGWANG)(以下简称王印祥)发明创造发明人署名权纠纷、专利权权属纠纷一案，本院于2016年12月20日立案受理后，依法适用普通程序，于2017年4月25日公开开庭进行了审理。原告王召印及其委托诉讼代理人娄俊，被告贝达公司委托诉讼代理人罗云、周琳，被告倍而达公司、张晓东共同委托诉讼代理人任立民，被告谢国建到庭参加诉讼。被告王印祥经本院传票传唤，无正当理由拒不到庭，本院依法进行缺席审理。本案现已审理终结。
原告诉称：原告1982年毕业于兰州大学化学系，后获得美国耶鲁大学有机合成化学博士学位，在新药研发科研领域具有较高造诣，现任职中国科学院上海有机所研究员和课题组负责人。被告张晓东系原告在兰州大学同学，在美国投资设立BetaPharmaInc.(以下简称美国贝达公司)，并邀请原告担任美国贝达公司的科学顾问。原告曾于2004年3月向张晓东提供了治疗糖尿病药物的原始技术文稿，张晓东于2004年4月以其在国内设立的贝达医药开发(上海)有限公司(以下简称上海贝达公司，系被告倍而达公司的前身)的名义向中国国家知识产权局申请了名称为“胰高血糖素样肽类似物、其组合物及其使用方法”(专利号：ZLXXXXXXXXXXXX.9)的发明专利。该专利的中文专利申请文本系直接翻译自原告的原始技术文稿，专利申请文件上记载的六位发明人张晓东、谢国建、王印祥、郇正伟、查理斯·大卫、陈杭均不是真正发明人，真正发明人系原告。2003年1月，张晓东实际控制的美国贝达公司与其他投资方共同出资设立浙江贝达药业有限公司(以下简称浙江贝达公司，系被告贝达公司前身)。后上海贝达公司将涉案专利转让给被告贝达公司。2010年，原告与张晓东签署合作意向书，张晓东与浙江贝达公司向原告书面承诺原告将享有300万股浙江贝达公司股份。浙江贝达公司后变更名称为被告贝达公司，并在上市过程中将涉案专利作为核心专利技术记载于招股说明书中。但张晓东与被告贝达公司并未兑现对原告的承诺。综上，原告认为其系涉案专利的真正发明人，被告倍而达公司无偿占有该专利，将张晓东、谢国建、王印祥等人列为发明人，并随后将该专利转让给被告贝达公司，侵害了原告的合法权益，故提起本案诉讼，请求判令：1、确认原告是中国发明专利“胰高血糖素样肽类似物、其组合物及其使用方法”(专利号：ZLXXXXXXXXXXXX.9)的发明人；2、确认原告是中国发明专利“胰高血糖素样肽类似物、其组合物及其使用方法”(专利号：ZLXXXXXXXXXXXX.9)的专利权人；3、本案诉讼费用由五被告共同承担。本案公开开庭审理前，原告撤回对被告郇正伟、查理斯·大卫、陈杭的起诉，本院予以准许。
被告贝达公司辩称：1、贝达公司受让涉案专利系善意取得，且已在国家知识产权局完成转让登记，原告无权向贝达公司主张权利；2、现有证据无法证明涉案专利技术方案系原告研发，无法证明原告系涉案专利的发明人或专利权人；3、原告早就知悉涉案专利被申请，其提起本案诉讼已过诉讼时效。
被告倍而达公司、张晓东共同辩称：1、原告没有证据证明其系涉案专利的发明人和专利权人，也未能证明其主张的专利手稿的技术方案与涉案专利技术方案系同一技术方案；2、倍而达公司并非涉案专利的发明人和专利权人，故倍而达公司并非本案适格被告。
被告谢国建辩称：涉案专利申请时其系美国贝达公司员工，对涉案专利并不知情，也不清楚涉案专利将其列为发明人；直至2007年从美国到被告贝达公司北京研究中心工作时，才知晓上述情况。
被告王印祥向本院提交书面答辩意见称：1、其参与了涉案专利技术的课题筹备、立项、化合物活性筛选及候选化合物的活性评价等重要环节，为涉案专利的实质性特点做出了创造性的贡献，系涉案专利的发明人之一；2、本案涉及专利权属纠纷，而其仅为涉案专利的发明人，故与原告确认其为涉案专利权人的诉请没有关联。
本院经审理查明：
一、当事人基本情况
原告王召印1982年毕业于兰州大学分析化学专业，1988年获得耶鲁大学博士学位；1988年8月至2010年10月任职于默克制药公司加拿大研发中心，从事新药研发；2012年7月入选南京领军型科技创业人才引进计划，2012年12月被江苏省人才工作领导小组确定为“江苏省高层次创新创业人才引进计划”引进人才。中国科学院上海有机化学研究所与原告签订有聘用合同，聘用原告担任生物和化学交叉研究中心课题组长，合同期限自2013年10月25日至2018年10月24日。另外，2000年至2010年间，原告亦担任美国贝达公司技术顾问。
美国贝达公司成立于1996年，股东为被告张晓东。上海贝达公司成立于2002年5月24日，股东和法定代表人均为被告张晓东。2016年8月24日，上海贝达公司变更企业名称为上海备尒达药业有限公司，2016年9月20日变更企业名称为被告倍而达公司。
浙江贝达公司成立于2003年1月7日，股东为丁列明、杭州济和科技投资有限公司和美国贝达公司。2013年8月29日，浙江贝达公司名称变更为被告贝达公司。被告张晓东自2003年3月至2008年8月任浙江贝达公司董事长，2008年8月至2013年6月任浙江贝达公司副董事长，自2013年6月起不在浙江贝达公司担任职务。被告王印祥自浙江贝达公司成立至2013年8月担任公司董事、总经理，2013年8月以后担任被告贝达公司董事、总裁。
被告谢国建2000年至2012年间任职于美国贝达公司，系美国贝达公司科研人员。
二、涉案专利基本情况
涉案专利名称为“胰高血糖素样肽类似物、其组合物及其使用方法”，申请日为2004年4月14日，申请人为上海贝达公司，发明人为张晓东、谢国建、郇正伟、查理斯·大卫、王印祥及陈杭。2007年8月1日，上海贝达公司将涉案专利申请权转让给浙江贝达公司。2009年6月24日，涉案专利获得授权，专利号为ZLXXXXXXXXXXXX.9。该专利权利要求为：1.一种式I化合物或其药学上可接受的盐：R1-X-R2式I其中，R1选自：L-组氨酸、D-组氨酸、脱氨基组氨酸、2-氨基组氨酸、β-羟基组氨酸、α-氟甲基组氨酸和α-
甲基组氨酸；X是选自下组连接单元：
R2是选自下组的肽部分或片段：
-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-R4；R3选自甲基；R4选自NH2。2.一种药物组合物，其特征在于，含有权利要求1所述的化合物和药学上可接受的载体。3.权利要求1所述化合物的用途，其特征在于，用于制备治疗糖尿病、胰岛素耐受性和神经系统紊乱的药物。该专利说明书包括以下内容：
技术领域
本发明涉及胰高血糖素样肽类似物及其组合物，它们用来上调哺乳动物体内的胰岛素表达，从而用于治疗糖尿病。具体地说，这些肽衍生物可以用于长期治疗糖尿病和其它与促胰岛素肽相关疾病，以及与胰高血糖素水平相关的胃肠道功能活动性疾病。
背景技术
胰岛的内分泌被一套复杂的机制掌控着，这套机制不仅由葡萄糖、氨基酸和儿茶酚胺这样的代谢物影响着，但也受局部旁分泌的影响。主要的胰岛激素、胰高血糖素、胰岛素以及生长激素抑制素与特定的胰腺细胞相结合(分别为A细胞，B细胞和D细胞)来调节分泌反应。虽然胰岛素的分泌主要由血中胰岛素水平所决定，但是人生长激素会释放抑制素以抑制葡萄糖调节性胰岛素的分泌。除了胰岛素分泌的内岛旁分泌调节以外，有事实证明肠内促胰岛素因子的存在。
内分泌的概念起源于对以下现象的观察：和同样数量的从静脉内注射的能量(葡萄糖)相比，由食物摄取或肠葡萄糖吸收所得的能量能激起更大的刺激来促进胰岛素的释放(Elrick，H.等人，J.Clin.Endocrinol.Metab.，24，1076-1082，1964；McIntyre，N.等人，J.Clin.Endocrinol.Metab.，25，1317-1324，1965)。因此，这假设当能量通过胃肠道摄取而非通过胃肠外途径摄取的时候，口头营养物质的摄取所激发的肠源性信号代表了促使胰岛素释放增加的有效的胰岛素促分泌素(Dupre，J.等人，Diabetes，15，555-559，1966)。
虽然一些神经递质和肠激素也有类似内分泌的活性，但从免疫、拮抗剂以及剔除(knockout)研究中所得到的大量证据表明，葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)和胰高血糖素样肽(GLP)-1才代表了对大多数营养物质刺激所引起的胰岛素分泌起主导作用的肽。2型糖尿病病人进餐所刺激的胰岛素分泌释放表现出明显的数量上的缩减这一观察结果，引起了人们对以下研究的兴趣：不完全的内分泌或者内分泌抗性是否与糖尿病患者β-
细胞功能紊乱的病理生理学有关。
1987年，人类首次发现了胰高血糖素样肽-1(GLP-1)，认为它是一种内分泌激素，是一种在食物摄取后由肠道分泌的肽。GLP-1是由160个氨基酸的前体蛋白(即前胰高血糖素原)经蛋白水解过程之后由肠L细胞分泌的。前胰高血糖素原(preproglucagon)经切割后首先生成一种由37个氨基酸组成的肽GLP-1，即GLP-1(1-37)OH，该肽的活性很弱。随后在7位上的切割生成有生物活性的GLP-1(7-37)OH。当在L-
细胞中将在末端甘氨酸残基被去除后，大约80％合成的GLP-1(7-37)OH在末端C位上被酰胺化。游离酸GLP-1(7-37)OH和酰胺化合物GLP-1(7-37)NH2的生物学影响和代谢更新是无法区分的。
众所周知，GLP-1刺激胰岛素分泌引起细胞中葡萄糖浓度上升，从而降低血糖水平(Mojsov，S.等人，J.Clin.Invest.，79，616-619，1987；Kreymann，B.等人，Lancetii，1300-1304，1987；Orskov，C.等人，Endocrinology，123，2009-2013，1988)。急性脑室内注射GLP-1或GLP-1受体收缩会产生短暂的食物摄入减少(TurtonM.D.等人，Nature，379，60-72，1996)，然而一些研究表明，更多的长期脑室内注射或胃肠外GLP-1受体促效剂的给药和体重减轻有关(Meeran，K.等人，Endocrinology，140，244-250，1999；Davies，H.R.Jr.，Obes.Res.，6,147-156，1998；Szayna，M.等人，Endocrinology，141，1936-1941，2000；Larsen，P.J.等人，Diabetes，50，2530-2539，2001)。大量具有促胰岛素作用的GLP-1类似物在本领域中是已知的。例如，这些类似物包括GLP-1(7-36)，Gln9-GLP-1(7-37)，D-Gln9-GLP-1(7-37)，乙酰基-
Lys9-GLP-1(7-37)，Thr16-Lys18-GLP-1(7-37)和Lys18-GLP-1(7-37)；GLP-1的衍生物包括酸加成盐，羧酸盐，低级烷基酯以及酰胺化合物(WO91/11457；EPO733,644；US专利5,512,549)。
在临床前的试验中所描绘的大多数GLP-1作用在人体研究中也被证实了。在快速的葡萄糖摄入及食物摄取状态下，在正常人体内注入GLP-1(7-36)NH2会刺激胰岛素分泌，明显降低血糖(Orskov，C.等人，Diabetes，42，658-661，1993；Qualmann，C.等人，Acta.Diabetol.，32，13-16，1995)。
对于用对磺脲类药物治疗失败的糖尿病患者而言，选用基于GLP-1的肽来治疗肯定会有良好的疗效(Nauck，M.A.等人，DiabetesCare，21，1925-1931，1998)。GLP-1只在高血糖症的情况下刺激胰岛素分泌。GLP-1的这个特性使之和胰岛素相比起来更具安全性，而且已观察到分泌的胰岛素的数量和高血糖症的程度是成正比的。另外，GLP-1的治疗将导致胰腺释放胰岛素及在肝脏中胰岛素首次通过时起作用。和皮下胰岛素注射相比，这可导致外周胰岛素的低循环水平。GLP-1使胃肠道的清空变慢，这更有利于让营养物质在较长的时期内被吸收，以此降低餐后的葡萄糖高峰。一些报道提示，GLP-1可以提高外周组织(比如肌肉、肝脏和脂肪)中胰岛素的敏感性。最后，GLP-1还表现出潜在的食欲调节的功能。
如果应用于1型糖尿病患者身上，GLP-1及其类似物在治疗方面的潜能会更加突出。大量研究证明了天然GLP-1在治疗胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)中的有效性。与非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)患者类似，GLP-1通过它的稳定胰高血糖素的(glucagonostatic)特性，能有效的缓解饥饿性高血糖症。另外的研究表明，很可能通过延长胃的清空，GLP-1还减少了IDDM患者的餐后血糖偏移。这些观察暗示，GLP-1可用于治疗IDDM和NIDDM。
然而，天然GLP-1分子的生物半衰期受二肽酶IV(DPPIV)活性的影响，是相当短暂的。例如，GLP-1(7-37)OH的生物学半衰期仅仅3-5分钟(美国专利XXXXXXX)。只有通过持续的灌输才能持续降低血中葡萄糖浓度，就像研究中所证明的那样，24小时的静脉内输注才能控制GLP-1的浓度(Larsen，J.等人，DiabetesCare，24，1416-1421，2001)。酶DPPIV是一种在倒数第二个NH2-末端的脯氨酸(Xaa-
Pro-)或丙胺酸(Xaa-
Ala-)之后的位置优先水解肽的丝氨酸蛋白酶(Mentlein，R.，Regul.Pept.，85，9-25，1999)，这种酶已经表现出能够在体外迅速使GLP-1产生代谢变化。因此，对DPPIV有抗性的长效的基于GLP-1的肽在治疗糖尿病患者方面具有巨大的治疗潜能。
发明内容
本发明提供了GLP-1类似物，与天然GLP-1相比，它能发挥更持久的作用，并且对酶DPPIV的水解作用具有完全的抗性。
该发明包括具有以下通式I的化合物或其药学上可接受的盐：
R1-X-R2
式I
式中，
R1选自：L-组氨酸、D-组氨酸、脱氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基一组氨酸、高组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基组氨酸；
X是选自下组连接单元：
R2是选自下组的肽部分或片段：
-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-R4
-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-lle-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-R4
-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys-R4
-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-
-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-ASp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-
-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Y-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Z-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-R4
-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Y-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Z-Phe-lle-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-R4；
Y和Z独立地选自：Glu、Gln、Ala、Thr、Ser、和Gly；
R3选自C1-6烷基；
R4选自NH2和OH，它们表示末端氨基酸的游离酸或酰胺化合物形式；
R5选自C6-10无支链的酰基。
本发明还提供了一种下式化合物或其药学上可接受的盐：
R1-X-R6
其中：
R1选自：L-组氨酸、D-组氨酸、脱氨基组氨酸、2-氨基组氨酸、β-羟基组氨酸、同型组氨酸、α-氟甲基组氨酸和α-甲基组氨酸；
X如上所定义；
R6为肽片段，这些片段除了含有与天然存在的GLP-1肽基本同源的片段外，在其羧基末端还含有一个或多个额外的氨基酸。
本发明还提供了一种下式化合物或其药学上可接受的盐：
R1-X-R7
其中：
R1为酪氨酸；
X如上所定义；
R7为肽片段，这些片段含有与天然存在的GIP(3-42)肽：
-EGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNITQ42基本同源的序列。
本发明还提供了上述化合物的化学反应性衍生化合物，所述的衍生化合物可与细胞载体上的可利用的官能团反应，形成共价键，其中所述的细胞载体包括可移动的血液蛋白。
本发明还提供了一种治疗糖尿病、胰岛素耐受性和神经系统紊乱的方法，其特征在于，它包括给需要治疗的患者服用无毒的、治疗有效量的本发明所述的化合物。较佳地，一天一次、一天两次或一天三次，以口服、静脉注射、皮下注射或气雾剂的形式服用所述化合物。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有本发明所述的化合物和药学上可接受的载体。
本发明还提供了所述化合物的用途，它被用于制备治疗糖尿病、胰岛素耐受性和神经系统紊乱的药物。
具体实施方式
本发明的关键在于，用含CF3的连接单元取代GLP-1的氨基末端的Ala8中的酰胺键，该位置是DPP-
IV的识别位点。最近有报道称，在一类金属蛋白酶抑制剂的主肽骨架中，新型连接单元[-CH(CF3)NH-]可能可作为常规连接单元(NHCO)的模拟物(OrganicLetters，2，1827-1830，2000；TetrahedronLetters，42，3143-3144，2001)。基于同样的原理，经过[-CH(CF3)NH-]修饰的GLP-1类似物保留与促胰岛素物质相同的生物学活性并且是长效作用的。
从以确定的人GLP-1氨基酸序列中选出的肽部分(肽片段)构成了开发本发明的起点。可互换的术语“肽片段”和“肽部分”意味着包括衍生自天然存在的氨基酸序列的，合成的和天然的氨基酸序列。一些研究人员已经报道了GLP的氨基酸序列(Lopez，L.C.等人，Acad.Sci.，USA80，5485-5489，1983；Bell，G.I.等人，Nature302：716-718(1983)；Heinrich，G.等人，Endocrinol，115：2176-2181(1984)。前高血糖素原(preproglucagon)的mRNA及其相应的氨基酸序列的结构是众所周知的。前体基因产物(即高血糖素原)转变成胰高血糖素以及两个促胰岛素肽的蛋白质水解过程也已经被确定了。正如本文所用，GLP-1(1-37)的符号代表了具有从第1位(N端)到第37位(C端)所有氨基酸的GLP-1多肽。类似地，GLP-1(7-37)代表了具有从第7位(N端)到第37位(C端)所有氨基酸的GLP-1多肽。同样，GLP-1(7-36)代表的多肽是具有从第7位(N端)到第36位(C端)所有氨基酸的GLP-1多肽。
同样的实践可以应用于葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)，GIP是来自更大的有153个氨基酸的前体中的一个42个氨基酸的多肽(Takeda，J.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA84，7005-7008，1987)。和GLP-1一样，GIP在2位的丙氨酸处被广泛表达的氨基肽酶DPPIV切割，由此生成了截断的无活性的肽GIP(3-42)。一种具有下式的GIP类似物(4非对映异构体)对DPPIV有抗性并且可发挥长效的GIP作用。
本发明还提供药物组合物，它包括本发明的化合物和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
多肽的固相合成原理在技术上是众所周知的，也可能在这一领域的通用著作中被找到，例如：Dugas，H.andPenney，C.，BioorganicChemistry(1981)Springer-
Verlag，NewYork，page54-92；Merrifield，J.M.，Chem.Soc.，85，2149，1962，andStewartandYoung，SolidPhasePeptideSynthesis，page24-66，Freeman(SanFrancisco，1969)。
例如，此发明的多肽片段可通过固相方法，用AppliedBiosystems430肽合成仪(AppliedBiosystems，Inc.，850LincolnCentreDrive，FosterCity，CA94404)和AppliedBiosystems公司提供的合成循环装置来合成。受Boc保护的氨基酸和其它试剂可购自在AppliedBiosystems公司和其他化学产品供应商。用双偶联方案的连续BOC化学法可应用对-
甲基二苯甲胺树脂，从而产生C末端的羧酰胺(carboxamide)。为了制造C末端的酸，可以使用相应的PAM树脂。可使用预制的羟基苯并三唑酯使天冬氨酸、谷胺酰氨和精氨酸偶联。
所需的含有CF3的片段可以按以下的反应程序合成。受保护的谷氨酸1可以与CF3CHO中的甲基半缩醛反应生成2。2和乙酸盐阴离子反应生成3，3被去保护从而生成羧酸4。在Et3N存在下(在含叔丁醇的四氢呋喃中)，用(PhO)2PON3处理4，生成5。用钯炭Pd/C催化剂催化加氢，使5生成6的非对映异构体混合物。6经HPLC分离，可获得所有的纯净非对映异构体A，B，C，D。
用AppliedBiosystems430肽合成仪通过固相合成法将A，B，C，D连于结合在聚合体上的肽片段，然后去保护并添加R1，R1选自：L-组氨酸、D-组氨酸、脱氨基-
组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、α-氟甲基-组氨酸和α-
甲基组氨酸。去保护和从聚合物固相载体上切下，就获得了一类新的GLP类似物，这一类物质能抵抗DPPIV的水解作用，并有长期的促胰岛素作用。
本发明还包括GLP-1(胰高糖素样肽-1)类似物的盐形式。GLP-1类似物可以呈强酸性或强碱性，能和许多无机碱和无机酸发生反应生成盐。用来合成酸加成盐的无机酸通常是盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫磺酸、磷酸等等，有机酸是对甲苯磺酸、甲基磺酸、草酸、对溴苯磺酸、碳酸、丁二酸、柠檬酸、安息香酸、乙酸等等。盐的例子包括：硫酸盐、硫酸化物、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、庚酸盐、丙炔酸盐、草酸盐、丙二酸盐、丁二酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、延胡索酸盐、马来酸盐、丁炔-1，4-二酸盐、己炔-1，6-二甲基、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、磺酸盐、二甲苯磺酸盐、苯乙酸盐、苯丙酸盐、苯丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、3-羟基苯丁酸盐、羟乙酸盐、酒石酸盐、甲基磺酸盐、丙磺酸盐、1-磺酸萘盐、2-磺酸萘盐、扁桃酸盐等等。首选的酸加成盐是与无机酸形成的盐，例如盐酸、氢溴酸，尤其是盐酸。
碱加成盐可由无机碱生成，例如铵，碱金属或碱土金属的氢氧化物，碳酸盐，重碳酸盐等等。下述碱性物质常用来生成该产物的盐类形式，如氢氧化钠，氢氧化钾，氢氧化铵，碳酸钾等等。GLP-1类似物的盐形式是特别优选的。当然，如果要将本发明化合物用于治疗，这些化合物也可以是盐类，但必须是药学上可接受的盐。
经过改良的本发明GLP-1类似物可有多种用途，它们可以用来治疗糖尿病，可以用作镇静剂，可以治疗神经系统功能紊乱，可以作用于中枢神经系统产生抗焦虑作用，可以刺激中枢神经系统，可以用作术后治疗并且用来治疗胰岛素耐受性。
A.糖尿病治疗
经过修饰的本发明GLP-1类似物通常能通过葡萄糖依赖性机制使高血糖症恢复正常。因此，修饰的GLP-1类似物就可以用作治疗II型糖尿病的主导药物，也可以用作治疗I型糖尿病的辅佐药物。
使用有效剂量的修饰的GLP-1类似物来治疗糖尿病比未经修饰的GLP-1更有效。因为修饰的GLP-1类似物在体内更稳定，给予较小的剂量就可以达到有效的治疗效果。本发明尤其适合糖尿病患者的治疗，不管是I型还是II型，因为多肽的活动依赖于血中葡萄糖的浓度，因此相对当前使用的治疗方法，新法中低血糖症副作用的危险性大大降低了。
本发明也提供了在人体内治疗糖尿病的方法，其中该方法包括步骤：提供数量足以治疗糖尿病的经修饰的GLP-1类似物；其中组合物含有修饰的GLP-1类似物。
B.神经系统紊乱的治疗
本发明经修饰的GLP-1类似物也可以作为镇静剂来使用。一方面，对于一些因某种异常而导致中枢或外周神经系统的活性被增强的哺乳动物，使用足量的经修饰的GLP-1类似物，可以在这些哺乳动物身上产生一种诱人的或抗焦虑的影响，从而使其镇静。这种经修饰的GLP-1类似物可以经脑室内注射、口服、皮下注射、肌肉内注射或者静脉内注射。这种方法对于治疗或者改善焦虑、运动错乱、侵略性行为、精神错乱、抓狂、恐慌性袭击、歇斯底里以及失眠等神经系统症状是有效的。
在另一相关方面，此发明还包括一种提高哺乳动物的活动性的方法：给予对象足量经修饰的GLP-1类似物，使之在哺乳动物身上产生作用并激活对象的功效。此法更适用于中枢或周围神经系统活性降低的哺乳动物。对于治疗或改善抑郁症、情感性切割症、睡眠性呼吸暂停综合症、注意力分散症、失忆症、健忘症、嗜睡症等一系列症状尤其适用。在这些病症中，唤醒中枢神经系统可能是有利的。
在治疗或改善抑郁症、情感性切割症、睡眠性呼吸暂停综合症、注意力分散症、失忆症、健忘症、嗜睡症等病症中，本发明的经修饰的GLP-1类似物可以用来唤醒患者。GLP-1类似物的疗效可以通过会诊患者以评估他们的病症，通过心理上或神经学上的试验，或者通过与这些病症相关症状的改善来评定。举例来说，从对嗜睡症发作的掌控程度可以来评价对于嗜睡症的疗效。再举个例子，可用本领域技术人员熟知的各种不同诊断测试中的任一种，来评估经修饰的GLP-1类似物作用于患者后使之集中注意力，或者提高记忆力的效果。
C.术后治疗
本发明的经修饰的GLP-1类似物可以被用作术后治疗。无论是在术前1-16小时，或者手术过程中，或者术后5天以内，患者都可需要这种经修饰的GLP-1类似物。
从在手术开始之前的16小时至前1小时，给予患者经修饰的GLP-1类似物。给予患者本发明的化合物是为了减少分解代谢作用和胰岛素耐受性，而给药的时间长短取决于许多因素。这些因素是普通技能的医生所熟知的，包括：最重要的是手术准备阶段患者是否禁食或进行了葡萄糖输注或饮用了饮料或者其他形式的食物。其他重要因素包括患者的性别、体重、年龄、血糖失调的严重性，任何调节血糖无能的潜在诱因，手术预期创伤的严重性、给药途径以及生物药效率、个体的耐力、配方以及药效。给予本发明修饰的GLP-1类似物的首选的时间段从术前一小时到十小时不等。开始给药的最佳时间段是术前两小时至术前八小时。
特殊类型的手术后，例如选择性腹部手术后的胰岛素耐受性在术后第一天最为严重，至少持续五天，并且可能持续三周才恢复正常。因此，经历了手术创伤，术后一段时间患者需要给予本发明的经修饰的GLP-1类似物，药物给予时间的长短取决于患者术后是否禁食或进行了葡萄糖输注或饮用了饮料或者其他形式的食物。同时，患者的性别、体重、年龄、血糖失调的严重性，能引起血糖调节功能丧失的潜在诱因，手术创伤的实际严重性、给药途径以及生物药效率、个体的耐力、配方以及药效也都是影响因素。本发明中给予的药物的首选使用时间为不多于术后五天。
D.胰岛素耐受性的治疗
胰岛素耐受性的治疗，不同于其在术后治疗中的用法，修饰后的GLP-1类似物可用于治疗胰岛素耐受性。产生胰岛素耐受性的原因可能是细胞表面受体结合的胰岛素数量减少，或是细胞内代谢发生改变。第一种胰岛素耐受性的特点是胰岛素敏感性降低，典型治疗方法是增加胰岛素用量。第二种的特点是胰岛素反应性降低，大剂量胰岛素治疗无效。胰岛素耐受性引起的损伤可用与胰岛素耐受性程度成比例剂量的胰岛素治疗，因此很明显这种损伤是由胰岛素敏感性降低引起的。
使患者血糖水平正常的修饰GLP-1类似物的有效剂量受到以下因素的影响：GLP-1类似物的剂量、有无禁忌症、患者的性别、体重和年龄、血糖调节功能丧失的严重程度、能引起血糖调节功能丧失的潜在病因、是否同时给予葡萄糖或其他糖类、给药途径及生物利用度、患者耐受程度、配方和药效。
要检测GLP-1类似物刺激胰岛素分泌的能力，可以将GLP-1类似物注入人工培育的动物细胞中，如RIN-38型小鼠胰岛β细胞瘤细胞，然后监测释放入培养基中的免疫反应性胰岛素(IRI)的数量。另一种方法是将GLP-1类似物注入动物体内然后监测免疫反应性胰岛素(IRI)在血浆中的浓度。
免疫反应性胰岛素(IRI)是用针对胰岛素放射性免疫测定法检测的。任何能检测到IRI的放射性免疫化验方法都可使用；其中一种是由Albano，J.D.M.等人发明的方法的改良法，ActaEndocrinol.70：487-509(1972)。在这种改良法中用pH为7.4的磷酸盐/清蛋白缓冲液。向培养器中依次注入500μl磷酸盐缓冲液，50μl灌注液样本或含标准量小鼠胰岛素的灌注液，100μl抗胰岛素抗血清(WellcomeLaboratories：按1∶40,000稀释)，以及100μl[125I]胰岛素，总容量750μl，置于10×75mm的一次性玻璃试管中。在4℃下培育2-3天，利用活性炭将游离的胰岛素与抗体结合的胰岛素分开。该化验灵敏度为1-2uU/ml。为了测定释放到组织培养物中细胞生长培养基里的IRI数量，可以给胰岛素原加上放射性标记。尽管任何能标记多肽的放射性标记都可使用，但优选所用3H亮氨酸来获得标记的胰岛素原。
要测定GLP-1类似物是否有促胰岛功能也可通过胰腺灌注实验。小鼠胰腺原位灌注化验法是在Penhos，J，C.等人的方法基础上的改良方法(Diabetes，18：733-738(1969)。在体重350-600g不等的、禁食的雄性CharlesRiver种大鼠腹膜内注射异戊巴比妥(EliLillyandCo公司，160ng/kg)，将它们麻醉。结扎肾脏，肾上腺，胃及低位结肠的血管。除了大约4厘米的十二指肠和降结肠以及直肠，整段肠都失去功能。因此只有一小段肠受到灌注，从而最大程度地减少了胰高血糖素样肽与肠物质之间免疫反应所造成的影响。灌注液是改良后的Kreba-
Ringer碳酸氢盐缓冲液，含有4％的T70右旋糖苷和0.2％的牛血清白蛋白(片段V)，还用95％O2和5％CO2吹泡。使用了一台带4通道滚柱轴承泵的体外循环机(Buchlerpolystatic，BuchlerInstrumentsDivision，Nuclear-
ChicagoCorp)，还有一个控制灌注液流向的三通阀。该灌注法按照Weir，G.C.等人的方法进行操作，监测及分析(J.Clin.，Investigat.54：1403-1412(1974)，该文献在本文中引用作为参考)。
本发明还提供了药物组合物，它含有本发明的GLP-1类似物以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。药物组合物可采用传统制药工艺加工而成，可单独服用或与其他治疗药剂混合服用，尤其是通过经胃肠外途径给药。最适合的给药途径包括肌肉注射和皮下注射。
经胃肠外途径给药为一天一次，用量在1pg/kg到1000μg/kg之间，尽管用量可高于或低于此标准。具体用量取决于患者病情的严重程度以及患者的身高、体重、性别、年龄和病史。
在制造本发明的组合物时，包含至少一个蛋白质的活性成分通常需要与赋形剂混合或用赋形剂稀释。如果把赋形剂作为稀释剂使用，其形态可以是固态，半固态或液态，从而作为活性成分的载体或基质。
制备制剂时，如果活性蛋白质完全不可溶解，有必要先将活性混合物研磨至大小合适的颗粒以便和其他成分相结合。通常研磨至200目以下。如果活性混合物可完全溶于水，颗粒常常要调整为大致均一的大小，比如大约40目。
可用的赋形剂包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、硅酸钙、微晶纤维素、水、糖浆、和甲基纤维素。制剂中还可添加润滑剂(如滑石粉、镁和矿物油)、湿润剂、乳化和悬浮剂、防腐剂(如甲基羟基苯甲酸盐和丙基羟基苯甲酸盐)、甜味剂或增香剂。本发明的组合物可配制成使得活性成分能在本领域常规途径给药后迅速起效，也可配制成使其持续或缓释起效。
该组合物适宜制成单位剂量形式，每单位剂量通常包括大约50μg到100mg或是更常见的约1mg到10mg的活性成分。“单位剂量”是指适用于人体和其他哺乳动物的单一剂量单位，每单位包括预定数量的活性物质，混合以适量的可药用赋形剂，能产生所需的治疗效果。
为了能经肠胃外给药，本发明中包含蛋白质的成分最好与蒸馏水混合，并将pH调整至约6.0到9.0。
还可使用其他制药方法来控制反应持续时间。通过使用聚合体来复合或吸收本发明的组合物，可制得控释制剂。选择合适的高分子(例如聚酯、聚氨酸、聚乙烯吡咯烷酮、乙酸乙烯、甲基纤维素、羧甲基纤维素和鱼精蛋白)、其浓度、以及掺入方法来控制药物传输，同样可用于控制药物释放。
另外一种可行的控制持续作用时间的方法是将本发明蛋白质掺入聚合物颗粒(例如聚酯、聚胺酸、水凝胶、聚乙烯(乳酸)、或乙烯基乙腈共聚体)。
除了将化合物掺入聚合物颗粒之外，还可以利用凝聚技术或界面聚合技术将混合物包裹于微囊体中，例如羟甲基纤维素或凝胶微囊体，或者包裹于胶状药物传输系统，例如形成脂质体，清蛋白微球体，微乳颗粒，极微颗粒，极微胶粒，或者掺入宏观乳剂(macroemulation)中，有关内容公开于Remington＇sPharmaceuticalSciences(1980)一书。
同样，本发明提供了给需要治疗的哺乳动物(尤其是人类)治疗糖尿病或高糖血症的方法，包括步骤将有效量的本发明GLP-1类似物或组合物施用于该哺乳动物。
通过说明，提供以下实施例来帮助描述实施和实践本发明的实施方式。这些实施例不以如何方式构成对本发明的范围的限制。
实施例
综述
通过固相肽化学法，在AppliedBiosystems(ABI)460A肽合成仪上，用MBHA树脂(AppliedBiosystemsInc.，lot#A1A023，0.77mmol/g)，产生结合于甲基二苯甲胺(MBHA)树脂中间体肽片段。所有氨基酸都通过叔-
叔丁氧羰基(t-Boc)来保护它们的α-
氨基。具有活性侧链氨基酸如下进行保护：精氨酸(Tos)；赖氨酸(Cl-Z)；色氨酸(CHO)；谷氨酸(CHex)；酪氨酸(Br-Z)；丝氨酸(Bzl)；天冬氨酸(OBzl)；苏氨酸(Bzl)。
用二氯甲烷(DCM)使受保护的氨基酸活化，并对每当量氨基酸用半当量的二环己基碳二亚胺(DCC)来形成对称的氨基酸酸酐。但精氨酸、谷氨酰胺和甘氨酸残基则要通过形成各自的1-羟基苯并三氮唑(HOBt)酯类来活化(氨基酸、HOBt和DCC按1∶1∶1溶于二甲基甲酰胺中)。
通过一系列的偶联及去保护循环反应，反应残基从C端逐渐移至N端。偶联是指活化的氨基酸和预先偶联的氨基酸中的第一位游离胺发生亲核取代反应。去保护是指','2018-10-07
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