北京知识产权法院行 政 判 决 书（2018）京73行初4665号原告北京大学，住所地北京市海淀区颐和园路**。法定代表人郝平，校长。委托诉讼代理人唐晓峰，男，1966年1月24日出生，北京骥驰知识产权代理有限公司专利代理师，住北京市海淀区。委托诉讼代理人张传领，男，1982年12月26日出生，北京大学员工，住北京市海淀区。被告国家知识产权局，住所地北京市海淀区蓟门桥西土城路**。法定代表人申长雨，局长。委托诉讼代理人邢维玲，国家知识产权局审查员。委托诉讼代理人刘新蕾，国家知识产权局审查员。原告北京大学因发明专利申请驳回复审行政纠纷一案，不服原国家知识产权局专利复审委员会（简称专利复审委员会）于2018年2月9日作出的第139369号复审请求审查决定（简称被诉决定），于法定期限内向本院提起行政诉讼。本院受理后，依法组成合议庭，公开开庭进行了审理。原告北京大学的委托诉讼代理人唐晓峰，被告国家知识产权局的委托诉讼代理人邢维玲、刘新蕾到庭参加了诉讼。本案现已审理终结。被诉决定系专利复审委员会针对北京大学关于申请号为201310128367.7、名称为“非天然氨基酸标记的目的蛋白或肽的制备”的发明专利申请（简称本申请）提出的复审请求而作出的。该决定认定：1.审查文本的认定北京大学在答复复审通知书时提交了权利要求书的全文修改替换页（共5页20项）。经审查，所作修改符合专利法第三十三条和专利法实施细则第六十一条第一款的规定。被诉决定依据的审查文本是：申请日2013年4月12日提交的说明书摘要、摘要附图、说明书第1-14、16-24页（第0001-0099、0110-0172段）、说明书附图第1-7页、说明书核苷酸和氨基酸序列表第1-12页，2013年7月25日提交的说明书第15页（第0100-0109段），以及2017年10月8日提交的权利要求第1-20项。2.关于创造性专利法第二十二条第三款规定，创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步。根据该款规定，在创造性的判断中，判断发明是否具有突出的实质性特点，就是要判断对于本领域的技术人员来说，要求保护的发明相对于现有技术是否显而易见。如果要求保护的发明相对于现有技术是显而易见的，则其不具有突出的实质性特点。权利要求1请求保护表达突变的tRNAPyl/PylRS的质粒，其是从保藏日为2013年4月8日、保藏号为CGMCCNo：7432的大肠埃希氏菌pSUPAR-YAV-tRNAPyl/PylRS中获取的pSUPAR-YAV-tRNAPyl/PylRS质粒；其中，所述质粒可以表达特异识别非天然氨基酸Lys-azido的tRNA和tRNA合成酶。对比文件1公开了一种定点突变和定点修饰的生长激素、其制备方法及应用，并具体公开了一种表达突变的甲烷球菌的tRNA（tRNAPyl）和吡咯赖氨酸酰-tRNA合成酶（PylRS）的质粒pACYC-tRNA/PylRS：从保藏日为2011年06月14日、保藏号为CGMCCNo：4951的大肠埃希氏菌pACYC-tRNA/PylRS中获得，该质粒可以表达特异识别非天然氨基酸Lys-diazirine和Lys-azido的tRNA和tRNA合成酶（参见对比文件1说明书第0019、0110段，权利要求1、9、11）。可见，权利要求1与对比文件1相比，其区别特征在于：（1）权利要求1插入tRNAPyl/PylRS的质粒为pSUPAR-YAV，对比文件1为pACYC，该质粒来源的大肠杆菌的保藏号不同；（2）权利要求1质粒中的tRNA和tRNA合成酶特异识别非天然氨基酸Lys-azido，对比文件1质粒中的tRNA和tRNA合成酶特异识别非天然氨基酸Lys-diazirine和Lys-azido。基于上述区别技术特征，可以确定权利要求1实际解决的技术问题是如何提高tRNAPyl/PylRS表达效率。对于区别技术特征（1），对比文件2公开了一个在大肠埃希氏菌中进行单个或多个非天然氨基酸突变的tRNA/aaRS系统，并具体公开了为了改进这个系统的抑制效率，第二代抑制质粒pSup带有增强glnS′启动子，以提高tRNA合成酶的表达水平，其同时带有proK启动子控制的6个tRNA表达盒，pSUPAR质粒是pSup质粒的一个衍生质粒，其还额外带有araBAD驱动的aaRS表达盒以及proK启动子控制的3个tRNA表达盒（参见对比文件2第1828页左边栏第24-26行、右边栏第1-6行）。可见，对比文件2给出了使用pSUPAR质粒可以提高tRNA/aaRS表达水平的技术启示，在此启示下，本领域技术人员有动机构建pSUPAR-YAV-tRNAPyl/PylRS质粒用以提高tRNAPyl/PylRS的表达水平。将导入有该质粒的大肠杆菌进行保藏则是本领域的常规操作。对于区别技术特征（2），对比文件1公开了pACYC-tRNA/PylRS质粒可以表达特异识别非天然氨基酸Lys-diazirine和Lys-azido的tRNA和PylRS（参见对比文件1说明书第0110段）。可见在本申请日前，本领域技术人员已经能够获得能够特异识别特定类型酰化赖氨酸的tRNA/PylRS系统，如北京大学所述的本领域常用的正负筛选技术。因此，进一步地获得能够特异识别Lys-azido的tRNA/PylRS系统对于本领域技术人员来说也是容易的。而且，虽然对比文件1公开的tRNA/PylRS系统特异识别非天然氨基酸Lys-diazirine和Lys-azido，但对比文件1在获得含有Lys-azido的生长激素时，仍然是将宿主细胞在含有Lys-azido的培养基中培养，其同样能够达到本申请tRNA/PylRS特异性识别Lys-azido的效果。因此，在对比文件1的基础上结合对比文件2给出的技术启示以及本领域的常规技术手段得到权利要求1请求保护的质粒对于本领域技术人员而言是显而易见的，权利要求1不具备突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第二十二条第三款规定的创造性。权利要求2请求保护一种含有权利要求1所述质粒的微生物。如上所述，权利要求1请求保护的质粒是本领域技术人员容易得到的，将上述质粒转入合适的微生物是本领域的常规技术手段。因此，权利要求2不具备突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第二十二条第三款规定的创造性。权利要求3进一步限定微生物是大肠杆菌。以大肠杆菌作为宿主微生物是本领域的常规选择。因此，在其引用的权利要求2不具备创造性的基础上，权利要求3不具备创造性，不符合专利法第二十二条第三款的规定。权利要求4请求保护制备含有非天然氨基酸的目的蛋白的方法，其中所述目的蛋白为干扰素。对比文件1公开了定点改良生长激素的方法，包括步骤：（1）选择步骤：在生长激素的氨基酸序列中选择期望突变的一个或多个特定氨基酸位点；（2）基因突变：将编码对应于（1）中选择的位点的生长激素的氨基酸的密码子用基因工程方法突变为密码子TAG（相应于权利要求4步骤（2）的琥珀密码子）；（3）表达载体构建：将（2）基因突变步骤得到的突变的生长激素的编码序列与合适的载体可操作地连接，得到突变序列表达载体；（4）获得pACYC-tRNA/PylRS质粒：从保藏日为2011年6月14日、保藏号为CGMCCNo：4951的大肠埃希氏菌pACYC-tRNA/PylRS中获取质粒pACYC-tRNA/PylRS质粒；（5）表达：将（3）得到的突变序列表达载体与（4）的pACYC-tRNA/PylRS质粒共同转染相同的宿主细胞，将转染成功后的宿主细胞在含有Lys-azido的培养基中培养，并在合适的条件下诱导表达；（6）对于能够表达突变蛋白的宿主，对表达产物进行生长激素活性检测，保留野生型生长激素80％以上活性的突变体设定为定点改良候选物；（7）表达定点改良候选物，并对产物进行纯化；（8）对非天然氨基酸进行特异性化学修饰，所示修饰包括聚乙二醇化、糖基化或酰基化；（9）对（8）中经修饰的生长激素进行稳定性或活性检测，相比野生型得到提高的生长激素为改良的生长激素（参见对比文件1权利要求11、12）。由此可见，对比文件1已经公开了一种制备含有非天然氨基酸的目的蛋白（生长激素）的方法。权利要求4与对比文件1的区别在于，（1）tRNAPyl/PylRS质粒不同；（2）目的蛋白为干扰素，对比文件1为生长激素；（3）权利要求1限定与突变干扰素核酸序列连接的载体为pET21a，宿主细胞为OrigamiB，对比文件1的优选载体为pMAL-c5X质粒，宿主细胞为Ecoli.BL21（DE3）。对于区别特征（1），在本领域技术人员容易获得权利要求1所述质粒的情况下（参见权利要求1的评述），将其替换对比文件1的质粒表达tRNA/PylRS，用于将Lys-azido引入目的蛋白对于本领域技术人员来说也是显而易见的。对于区别特征（2），本领域技术人员公知，干扰素与生长激素一样均存在半衰期短等药代动力学问题，需要PEG修饰，以及PEG修饰存在不均匀的问题。在对比文件1公开了所述方法能够在人生长激素中定点引入非天然氨基酸，为后续定点修饰的特异性提供保证的情况下，本领域技术人员容易想到将所述方法用于干扰素。此外，对比文件3开了一种制备含有非天然氨基酸的干扰素的方法：包括正交tRNA（O-tRNA）和正交氨基酰基tRNA合成酶（O-RS）的经引入翻译系统用于表达含有非天然编码氨基酸的hIFN。O-RS优先使具有非天然编码氨基酸的O-tRNA氨基酰基化。翻译系统转而回应经编码选择密码子而将非天然氨基酸插入hIFN中。（对应于权利要求4中的第“（4）”步）。用含有经修饰hIFN基因和正交氨基酰基tRNA合成酶/tRNA对（对所需非天然编码氨基酸具有特异性）的质粒转化大肠杆菌允许将非天然氨编码氨基酸位点特异性地并入hIFN多肽中。所述非天然氨基酸包括叠氮基（参见权利要求24、31）。也进一步公开了非天然编码氨基酸与水溶性聚合物，如聚乙二醇偶合的技术方案（参见权利要求56-65、75-80）。由此可见，对比文件3给出了对干扰素中引入包括叠氮基的非天然氨基酸，以及在非天然氨基酸上进一步进行修饰的技术启示。基于本领域技术人员的常识以及对比文件3的启示，本领域技术人员容易想到将对比文件1公开的方法用于干扰素上。对于区别特征（3），表达载体pET21a和宿主细胞OrigamiB（DE3）是本领域常用于表达目的蛋白的载体和宿主，根据蛋白可溶性表达情况，从本领域常规选用的载体、宿主中，选择适合的载体、宿主对于本领域技术人员来说是常规技术手段，并不需要付出创造性劳动。因此，权利要求4不具备突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第二十二条第三款规定的创造性。基于与权利要求4相同的审查意见，权利要求5也不具备专利法第二十二条第三款规定的创造性。权利要求6请求保护根据权利要求4或5的方法获得的蛋白质。如上所述，权利要求4或5请求保护的制备含有非天然氨基酸的干扰素的方法是本领域技术人员容易想到的，进一步的，利用所述方法得到权利要求6请求保护的蛋白质是本领域技术人员容易做到的。因此，权利要求6不具备突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第二十二条第三款规定的创造性。基于权利要求4-6的评述，在本领域技术人员容易想到将对比文件1公开的方法用于干扰素的情况下，对比文件1进一步公开了Lys-azido的结构以及如权利要求8所述的定点突变蛋白的结构特征（参见对比文件1权利要求3）。对于权利要求7、8所限定的干扰素突变位点，对比文件3公开了含有非天然氨基酸的人类干扰素分子的突变位点为来自SEQIDNO：2（即权利要求7限定的SEQIDNO：1）的以下各残基组成的群组的位置处经取代：其中就包括位点4、7、8、31、34、51、74、102、106、107、129、133、134、137或159和其任何组合（参见对比文件3权利要求10-18）。即相应于权利要求7、8所述的干扰素突变位点。因此，在对比文件1和3的基础上，结合本领域技术人员的常识，得到权利要求7、8请求保护的技术方案对于本领域技术人员而言是显而易见的，权利要求7、8不具备突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第二十二条第三款规定的创造性。基于权利要求4-6的评述，在本领域技术人员容易想到将对比文件1公开的方法用于干扰素的情况下，对比文件1进一步公开了Lys-azido插入目的蛋白后的定点偶联分子式（IV）以及R7（相应于权利要求9、10的R3）上连接不同分子量PEG，环糊精，糖，核酸，氨基酸，多肽或羧基端修饰基团（参见对比文件1权利要求4、5）。因此，在对比文件1和3的基础上，结合本领域技术人员的常规技术手段，得到权利要求9、10请求保护的技术方案对于本领域技术人员而言是显而易见的，权利要求9、10不具备突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第二十二条第三款规定的创造性。权利要求11请求保护编码权利要求6-10中任一项的突变的目的蛋白（例如干扰素）的核酸分子。首先，如上所述，权利要求6-10中任一项的突变的目的蛋白或肽是本领域技术人员容易得到的，相应的，编码所述蛋白的核酸序列是本领域技术人员容易得到的。因此，权利要求11不具备突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第二十二条第三款规定的创造性。权利要求12请求保护一种核酸载体，其可操作地连接有权利要求11的核酸分子。如上所述，权利要求11请求保护的核酸是本领域技术人员容易得到的，将其插入到合适的表达载体中是本领域的常规技术手段，可见，权利要求12请求保护的核酸载体是本领域技术人员容易得到的。因此，权利要求12不具备突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第二十二条第三款规定的创造性。权利要求13、14请求保护一种宿主细胞。如前所述，权利要求12请求保护的核酸载体和权利要求1的质粒是本领域技术人员容易得到的，将所述载体及质粒转入合适的细胞中进行表达是本领域的常规技术手段。因此，权利要求13、14不具备突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第二十二条第三款规定的创造性。权利要求15请求保护一种制备定点PEG化的干扰素的方法。对比文件1进一步公开了Lys-azido定点突变蛋白的定点PEG偶联：包括利用聚乙二醇单甲醚乙烯醚制备聚乙二醇单甲醚炔丙基醚（mPEG-炔），在BTTES的催化下与插入Lys-azido的目的蛋白反应，得到聚乙二醇修饰的目的蛋白。（参见对比文件1权利要求13-15，说明书第0192-0201段）。此外，对于将PEG与环辛炔进行偶联，进一步和叠氮产生的无铜点击化学对干扰素进行定点化学修饰的技术方案而言，无铜催化的环辛炔与叠氮环加成反应，已经被用于蛋白质定点标记和定点修饰中，在对比文件1已经公开了Lys-azido定点突变蛋白与mPEG-炔，在Cu2+催化下反应，对蛋白进行定点PEG修饰的情况下，由于本领域技术人员也已经知晓Cu2+的细胞毒性，因此，容易想到使用已经被用于蛋白质定点标记和定点修饰的无铜催化的环辛炔与叠氮环加成反应进行PEG的定点修饰。因此，基于权利要求6-10的评述，权利要求6-10不具备创造性的情况下，权利要求15不具备突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第二十二条第三款规定的创造性。从属权利要求16进一步限定活性PEG前体的结构式和分子量作了进一步限定。对比文件1公开了聚乙二醇单甲醚乙烯醚的分子式为CH3O-(CH2CH2O)nCH2CH2O-CH＝CH2，分子量范围2kD-100kD，n为1-60的整数（参见对比文件1权利要求14）。甲氧基聚乙二醇胺的分子式为CH3O-(CH2CH2O)nCH2CH2NH2，是本领域已知的，其分子量范围2kD-100kD，n为1-60的整数也是甲氧基聚乙二醇胺的常用化合物形式。因此，在其引用的权利要求15不具备创造性的基础上，权利要求16不具备创造性，不符合专利法第二十二条第三款的规定。权利要求17请求保护一种定点改良的干扰素。对比文件1公开了修饰的PEG的分子量范围为2kD-100kD（参见对比文件1权利要求16、17）。因此，基于权利要求6-10的评述，权利要求17不具备突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第二十二条第三款规定的创造性。权利要求18请求保护一种组合物，权利要求19请求保护一种药物组合物，权利要求20请求保护权利要求6-10中任一项的干扰素，或者权利要求17的定点改良的干扰素的医药用途。由于干扰素本身所具有的医药用途，将定点突变的干扰素以及PEG修饰的干扰素制成（药物）组合物，并用于抗病毒,治疗多种恶性肿瘤,免疫调节中，也是本领域技术人员容易想到的。因此，结合权利要求6-10、17的评述，权利要求18-20也不具备突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第二十二条第三款规定的创造性。对于北京大学的意见陈述，专利复审委员会认为，（1）表达载体pET21a和宿主细胞OrigamiB（DE3）是本领域常用于表达目的蛋白的载体和宿主，可溶性蛋白的表达是本领域普遍追求的目标，选取适合的载体和宿主利于外源目的蛋白的可溶性表达也是本领域的常规技术手段，因此，从本领域常规选用的载体、宿主中，根据可溶性表达情况，选择适合的载体、宿主对于本领域技术人员来说是常规技术手段，并不需要付出创造性劳动。因此，仅就为了获得可溶性表达的干扰素而言，选取pET21a和OrigamiB对于本领域技术人员来说足以不具备创造性，事实上，本申请也仅基于不同感受态细胞对蛋白的可溶性分析，选取了宿主OrigamiB（DE3）。北京大学提出的包涵体的形成会降低干扰素α2b中Lys-azido非天然氨基酸的插入效率，尚无实验证据予以支持。（2）首先，对比文件1已经公开了获得的可特异识别Lys-diazirine和Lys-azidot的突变型RNAPyl/PylRS。可见在本申请日前，本领域技术人员已经能够获得能够特异识别特定类型酰化赖氨酸的tRNA/PylRS系统（例如北京大学所述的本领域常用的正负筛选技术）。在复审通知书所提供的参考文献1（李劼等，基于非天然氨基酸的蛋白质生物正交标记，化学学报，第70卷,第1439-1445页，2012年12月31日）中也公开了“在大肠杆菌和酵母中通过定向进化的方法改进外源aaRS对于非天然氨基酸的识别特性,已经得到了约70种具有不同生理功能的非天然氨基酸”。可见，获得能够特异识别Lys-azido的tRNA/PylRS系统对于本领域技术人员来说是容易的。而且就北京大学提及的“干扰素的非天然氨基酸插入效率可以达到40-60mg/L”而言并未记载在原始申请文件中，也不能使本申请具备突出的实质性特点和显著的进步。其次，就对比文件2而言，其公开了一个在大肠埃希氏菌中进行单个或多个非天然氨基酸突变的tRNA/aaRS系统，并具体公开了为了改进这个系统的抑制效率，第二代抑制质粒pSup带有增强glnS′启动子，以提高tRNA合成酶的表达水平，其同时带有proK启动子控制的6个tRNA表达盒，pSUPAR质粒是pSup质粒的一个衍生质粒，其还额外带有araBAD驱动的aaRS表达盒以及proK启动子控制的3个tRNA表达盒。可见，对比文件2给出了使用pSUPAR质粒可以提高tRNA/aaRS表达水平的技术启示，而pACYC质粒仅含有一个lactosepromoter，在此启示下，本领域技术人员有动机构建pSUPAR-YAV-tRNAPyl/PylRS质粒用以提高tRNAPyl/PylRS的表达水平。虽然，对比文件2进一步给出了其他提高抑制效率的质粒，但这并不意味着，本领域技术人员仅能选用后续质粒，而忽视pSUPAR质粒对于提高tRNA/aaRS表达水平的有益效果，而放弃使用pSUPAR质粒。（3）无铜催化的环张力型的炔与叠氮环加成反应，已经被用于蛋白质定点标记和定点修饰中（如李劼等参考文献1第1440页左栏第2节），在对比文件1已经公开了Lys-azido定点突变蛋白与mPEG-炔，在Cu2+催化下反应，对蛋白进行定点PEG修饰的情况下，由于本领域技术人员也已经知晓Cu2+的细胞毒性，因此，容易想到使用已经被用于蛋白质定点标记和定点修饰的无铜催化的环辛炔与叠氮环加成反应进行PEG的定点修饰。当然，环辛炔也确实如北京大学所述能够在细胞中非特异性地和硫醇(巯基)或者是蛋白质上的半胱氨酸反应,影响在细胞内进行的特异性修饰。这是本领域技术人员在使用了该方法后已知存在的问题，本申请使用该方法也同样会带来此类问题，也不会因对可溶性表达的干扰素进行修饰就能避免。不存在本申请因使用了该方法而克服了技术偏见等预料不到的技术效果。同时该方法也存在不会因铜离子的使用所带来的细胞毒性问题，使得本领域技术人员仍会存在使用该方法的动机。综上，北京大学的意见陈述不具有说服力。基于此，专利复审委员会作出被诉决定：维持国家知识产权局于2016年12月30日对本申请作出的驳回决定。北京大学不服被诉决定，于法定期限内向本院提起行政诉讼，其诉称：一、从对比文件1的目的、主题、技术方案、技术效果和可能改进点来看，技术人员根本没有动机改进对比文件1中一种作为原料使用的质粒，本申请权利要求1是非显而易见的。生长激素和干扰素生理作用完全相反，属于不同的医疗技术领域；在本申请之前，技术人员在对比文件1的基础上不会想到干扰素的问题；对比文件1不涉及质粒主题及其技术方案，没有动机专门研究所述质粒；假设研究质粒，被诉决定遗漏了一项区别技术特征，即“所述质粒可以表达特异识别非天然氨基酸Lys-azido的rRNA和tRNA合成酶”。该区别技术特征意味着tRNA合成酶序列结构不同。技术人员基于对比文件1没有动机改变质粒骨架并筛选tRNA合成酶序列。二、权利要求4是非显而易见的，对比文件1、2、3属于三个不同技术领域的文件，缺乏结合的技术启示，第三个区别技术特征应分为载体和宿主细胞两个区别技术特征，并且遗漏了一个区别技术特征，即“对比文件1中为含有Lys-diazirine或者Lys-azido的培养基，而本申请中为含有Lys-azido的培养基”。五个区别技术特征相互协同作用，从而实现在干扰素任意位点引入非天然氨基酸Lys-azido，然后利用非天然氨基酸Lys-azido上特有的活性基团azido，达到高效、特异性修饰的技术效果。三、PEG和环形炔偶联，没有被现有技术公开，本申请温和、高效、定点、定量的干扰素修饰方法，是现有技术不可预期的结果，本申请权利要求15具备创造性。综上，请求法院依法撤销被诉决定，并判令国家知识产权局重新作出决定。国家知识产权局辩称：坚持被诉决定中的认定意见，被诉决定认定事实清楚，适用法律正确，作出程序合法，北京大学的诉讼请求和理由不能成立，请求法院依法维持被诉决定。本院经审理查明：本申请系名称为“非天然氨基酸标记的目的蛋白或肽的制备”的第201310128367.7号发明专利申请，申请人为北京大学，申请日为2013年4月12日，公开日为2014年10月15日。经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2016年12月30日以权利要求1-20不符合专利法第二十二条第三款有关创造性的规定为由驳回了本申请。驳回决定所依据的文本为申请日2013年4月12日提交的说明书摘要、摘要附图、权利要求第1-20项、说明书附图第1-7页、说明书核苷酸和氨基酸序列表第1-12页以及说明书第1-107、109-172段，2013年07月25日提交的说明书第108段。驳回决定中引用的对比文件如下：对比文件1：CN102838671A，2012年12月26日；对比文件2：“AVersatilePlatformforSingle-andMultiple-UnnaturalAminoAcidMutagenesisinEscherichiacoli”，AbhishekChatterjee等，《Biochemistry》，第52卷第10期，第1828-1837页，2013年2月28日；对比文件3：CN101247821A，2008年8月20日；对比文件4：“GeneticEncodingandLabelingofAliphaticAzidesandAlkynesinRecombinantProteinsviaaPyrrolysyl-tRNASynthetase/tRNACUAPairandClickChemistry”，DuyP.Nguyen等，《JACS》，第131卷第25期，第8720-8721页，2009年10月6日。驳回决定针对的权利要求书如下：“1.表达突变的tRNAPyl/PylRS的质粒，其是从保藏日为2013年4月8日、保藏号为CGMCCNo：7432的大肠埃希氏菌pSUPAR-YAV-tRNAPyl/PylRS中获取的pSUPAR-YAV-tRNAPyl/PylRS质粒。2.微生物，其含有权利要求1所述的质粒。3.根据权利要求2所述的微生物，其是大肠杆菌。4.制备含有非天然氨基酸的目的蛋白（例如干扰素）的方法，包括步骤：(1)选择步骤：在目的蛋白的氨基酸序列中选择期望突变的一个或多个特定氨基酸位点；(2)基因突变：将编码对应于（1）中选择的位点的目的蛋白的氨基酸的密码子用基因工程方法突变为琥珀密码子；(3)表达载体构建：将（2）基因突变步骤得到的突变的目的蛋白的编码序列与合适的载体可操作地连接，得到突变序列表达载体；(4)获得权利要求1的质粒；(5)表达：将（3）得到的突变序列表达载体与（4）的质粒共同转染相同的宿主细胞，将转染成功后的宿主细胞在含有Lys-azido的培养基中培养，并在合适的条件下诱导表达；(6)纯化含有非天然氨基酸的干扰素；和(7)任选的，对表达产物进行活性检测。5.权利要求4的制备含有非天然氨基酸的目的蛋白的方法，其中在步骤（7）之后还进一步包括：（i）对目的蛋白中的非天然氨基酸进行特异性化学修饰，示例性地，所示修饰包括聚乙二醇化、糖基化或酰基化；和（ii）任选地，对（i）中经修饰的干扰素进行稳定性或活性检测，相比野生型得到提高的目的蛋白（例如干扰素）为改良的目的蛋白（例如干扰素）。6.蛋白质，其是根据权利要求4或5的方法获得的。7.定点突变的蛋白或肽，例如人干扰素，其至少1个位点上的氨基酸被突变为非天然氨基酸，所述非天然氨基酸为：所示的Lys-azido。示例性地，所述突变位点可为SEQIDNO：1中任意位点上一个或多个的氨基酸。优选地，所述突变位点选自：示于SEQIDNO：1的序列的第P4位,H7位,S8位，K31位，H34位，E51位，A74位，G102位，T106位,E107位,M111位,Y129位,K133位,K134位,P137位,E159位或其他对活性影响较小的位点。8.定点突变的目的蛋白（例如干扰素），其与示于突变前目的蛋白的氨基酸（例如SEQIDNO：1）的序列的区别在于：在突变前目的蛋白的氨基酸序列（例如SEQIDNO：1）所示的序列的第N位的氨基酸被突变为Lys-azido，所述突变氨基酸与突变前目的蛋白氨基酸序列（例如SEQIDNO：1）所示的序列的连接方式如下式所示：由R1到R2的方向为氨基酸序列的N末端到C末端方向，R1为突变前目的蛋白（例如SEQIDNO：1）所示序列的第1至第N-1位氨基酸残基，R2为突变前目的蛋白（例如SEQIDNO：1）所示序列的第N＋1位至C末端的氨基酸残基，R4为。示例性地，所述第N位氨基酸可为SEQIDNO：1中任意位点上的一个或多个氨基酸。优选地，所述第N位的氨基酸选自第P4位,H7位,S8位，K31位，H34位，E51位，A74位，G102位，T106位,E107位,M111位,Y129位,K133位,K134位,P137位,E159位或其他对活性影响较小的位点的中一个或多个。9.经过修饰的定点突变的目的蛋白（例如干扰素），其结构如下式所示：式(I):或式(II)其中，R1为突变前目的蛋白（例如SEQIDNO：1）所示序列的第1至第N-1位氨基酸残基，R2为突变前目的蛋白（例如SEQIDNO：1）所示序列的第N＋1位至C末端的氨基酸残基，R3为相同或不同分子量PEG，环糊精，糖，核酸，氨基酸，多肽或羧基端修饰基团。10.根据权利要求9的经修饰的定点突变的目的蛋白，所述修饰为在R3上连接不同分子量的PEG，环糊精，糖，核酸，氨基酸，多肽或羧基端修饰基团。11.编码权利要求6－10中任一项的突变的目的蛋白（例如干扰素）的核酸分子。示例性地，所述核酸分子与编码SEQIDNO：1的核酸分子SEQIDNO：2的区别在于，编码SEQIDＮO：1的第P4位,H7位,S8位，K31位，H34位，E51位，A74位，G102位，T106位,E107位,M111位,Y129位,K133位,K134位,P137位,E159位或其他对活性影响较小的位点的一个氨基酸的密码子被突变为琥珀密码子。12.核酸载体，其可操作地连接有权利要求11的核酸分子。13.宿主细胞，其中含有权利要求12的核酸载体。14.根据权利要求13的宿主细胞，其中还含有权利要求1的质粒。15.制备定点PEG化的目的蛋白（例如干扰素）的方法，包括：（1）获取甲氧基聚乙二醇胺及聚乙二醇单甲醚乙烯醚；（2）合成催化剂BTTES,或环辛炔；（3）将PEG与环辛炔进行偶联,得到无需铜离子催化的活性PEG；及将聚乙二醇单甲醚乙烯醚经过化学反应得到末端含炔基的PEG；和（4）将权利要求6－10中任一项的蛋白（例如干扰素）与（3）的活性PEG反应，得到用聚乙二醇定点修饰的突变的目的蛋白（例如干扰素）。16.根据权利要求15的方法，其中甲氧基聚乙二醇胺的分子式为CH3O-(CH2CH2O)nCH2CH2NH2，分子量范围2kD-100kD，n为1－60的整数；聚乙二醇单甲醚乙烯醚的分子式为CH3O-(CH2CH2O)nCH2CH2O-CH=CH2，分子量范围2kD-100kD，n为1－60的整数。17.定点改良的目的蛋白（例如干扰素），其在权利要求6－10中任一项的蛋白（例如干扰素）的非天然氨基酸位置定点引入修饰，例如PEG修饰，优选所述PEG的分子量范围为2kD-100kD。18.组合物，其中含有有效量的权利要求6－10中任一项的蛋白（例如干扰素）或者权利要求17的定点改良的目的蛋白。19.药物组合物，其中含有有效量的权利要求6－10中任一项的蛋白（例如干扰素）或者权利要求17的定点改良的目的蛋白，以及药学上可以接受的载体。20.权利要求6－10中任一项的目的蛋白，或者权利要求17的定点改良的目的蛋白在制备长效、稳定性目的蛋白,用于抗病毒,治疗多种恶性肿瘤,免疫调节的药物中的用途。”驳回决定认为:（1）对比文件1公开了一种定点突变和定点修饰的生长激素，其制备方法及应用。权利要求1与对比文件1的区别在于：权利要求1表达tRNAPyl/PylRS的质粒为pSUPAR-YAV而非pACYC，该质粒来源的大肠杆菌的保藏号不同。对于上述区别特征，对比文件2公开了一个在大肠埃希氏菌中进行单个或多个非天然氨基酸突变的tRNA/aaRS系统，并公开了为了改进这个系统的抑制效率，第二代抑制质粒pSup可以提高tRNA合成酶的表达水平，在此启示下，本领域技术人员有动机构建pSUPAR-YAV-tRNAPyl/PylRS质粒用以改进tRNA/PylRS的表达效率；至于将导入有该质粒的大肠杆菌进行保藏则是本领域的常规操作。因此，权利要求1不具备创造性。将上述质粒转入合适的微生物中是本领域的常规技术，以大肠杆菌作为宿主微生物是本领域的常规选择。因此，权利要求2、3不具备创造性。（2）对比文件3公开了一种制备含有非天然氨基酸的干扰素的方法。权利要求4与对比文件3的区别在于：含叠氮的非天然氨基酸为利用权利要求1所述质粒引入的Lys-azido，权利要求3还限定了基因突变步骤。对于上述区别特征，对比文件4公开了一种利用PylRS/tRNACUA体系在重组蛋白中插入含叠氮和炔烃的非天然氨基酸的方法，给出了含叠氮的非天然氨基酸具体选择Lys-azido以提高hIFN中非天然氨基酸的插入效率的启示，而利用权利要求1所述的质粒引入Lys-azido是本领域技术人员容易想到的，至于将目的蛋白上的非天然氨基酸密码子用基因工程方法突变为琥珀密码子是本领域的常规操作。因此，在对比文件3的基础上结合对比文件4和对比文件1-2以及本领域常规技术手段得到权利要求4的技术方案对于本领域技术人员而言是显而易见的，权利要求4不具备创造性。对比文件3已经公开了权利要求5的附加技术特征，在方法不具备创造性的条件下，利用所述方法得到权利要求6请求保护的蛋白质是本领域技术人员容易做到的。权利要求5、6不具备创造性。（3）权利要求7、9与对比文件3的区别在于干扰素中插入的含叠氮的非天然氨基酸为Lys-azido。对于上述区别特征，对比文件4给出了含叠氮的非天然氨基酸具体选择Lys-azido以提高hIFH中非天然氨基酸的插入效率的启示，因此，权利要求7、9相对于对比文件3和对比文件4的结合不具备创造性。得到权利要求8所述连接方式的目的蛋白（例如干扰素）对本领域技术人员而言是显而易见的，权利要求8不具备创造性。对比文件3已经实质上公开了修饰集团包括PEG、环糊精、糖、核酸、氨基酸、多肽或羧基端修饰基团。因此，在权利要求9不具备创造性的基础上，权利要求10也不具备创造性，（4）权利要求6-10中任一项的突变的目的蛋白或肽是本领域技术人员容易得到的，编码所述蛋白的核酸序列是本领域技术人员容易得到的。因此，权利要求11不具备创造性。核酸载体、宿主细胞是本领域技术人员容易得到的。权利要求12-14不具备创造性。（5）对比文件3已经给出了制备定点PEG化的干扰素的教导，此外，活性PEG和末端含炔基的PEG的制备方法是本领域的常规技术手段，权利要求6-10中任一项的突变的目的蛋白或肽是本领域技术人员容易得到的，因此，将权利要求6-10中任一项的突变的目的蛋白（例如干扰素）与所述活性PEG反应得到用聚乙二醇定点修饰的突变的目的蛋白（例如干扰素）是本领域技术人员容易想到的，在活性PEG的末端引入了环辛炔是本领域技术人员容易想到的。因此，权利要求15不具备创造性。权利要求16是本领域技术人员经过常规技术手段容易获得的，权利要求16不具备创造性。对比文件3公开了对非天然氨基酸突变的干扰素进行PEG的修饰，并规定了PEG部分具有介于约0.1kDa与约100kDa之间的平均分子量，基于权利要求6-10不具备创造性，权利要求17也不具备创造性。对比文件3公开了一种组合物，其包括权利要求1的hIFN多肽和医药学上可接受的载剂。可见，对比文件3给出了将不同位点突变的和/或不同修饰基团修饰的干扰素组合的教导，因此，权利要求18不具备创造性。对比文件3公开了一种组合物，其包括权利要求1的hIFN多肽和医药学上可接受的载剂，可见，对比文件3给出了在蛋白组合物中加入药物上可以接受的载体的教导，因此，权利要求19不具备创造性。对比文件3给出了所述蛋白在制备长效、稳定性目的蛋白，用于抗病毒，治疗多种恶性肿瘤，免疫调节的药物中的用途的教导，因此，权利要求20不具备创造性。北京大学对上述驳回决定不服，于2017年4月7日向专利复审委员会提出了复审请求，同时提交了权利要求书的全文修改替换页（共5页20项）。相对于驳回决定的权利要求书而言，所作修改是在原权利要求1中进一步限定“其中，所述质粒可以表达特异识别非天然氨基酸Lys-azido的tRNA和tRNA合成酶”。北京大学认为：（1）对比文件1中的tRNA合成酶是野生型的，特异性低。权利要求1的质粒是表达突变的tRNA/PylRS的质粒，其可以表达特异识别Lys-azido的tRNA和tRNA合成酶，具备专一性和高效性。本申请在tRNA合成酶的关键位置，建库进行了正负两轮筛选（由于正负筛选操作流程是本领域常用技术，所以未提及具体操作步骤及流程）。这种筛选并非总能筛选到高效的tRNA合成酶序列，专一且高效识别特定氨基酸的“tRNA和tRNA合成酶对”。权利要求1所请求保护的表达突变的tRNA/PylRS的质粒对于干扰素的插入效率可以达到40-60mg/L，产生了意想不到的技术效果。同时，北京大学还提供了对比文件1以及本申请tRNA合成酶的序列结构，以证实二者的不同。本申请是通过筛选tRNA合成酶序列得到基础插入效率的提高。对比文件2仅公开了pSUPAR质粒的效果比早期版本质粒（使用lpp启动子和glnS启动子）的效果好，没有给出启示pSUPAR质粒的效果要比对比文件1中的pACYC质粒效果好。但对比文件2又提供了pEVOL以及pUltra质粒，具有增强的抑制效率。为了改进tRNAPyl/PylRS的表达效率，本领域技术人员也只会选择更加高效的pEVOL或pUltra质粒，没有动机选择pSUPAR质粒。（2）权利要求7与对比文件3相比，区别在于干扰素的所示位点中插入的非天然氨基酸是Lys-azido，而对比文件3中的非天然氨基酸为pAF。权利要求7所要解决的技术问题在干扰素特定位点引入了Lys-azido，进一步特异性修饰，实现改善的药代动力学。而对比文件4要解决的问题是将用于蛋白标记的脂肪族氨基酸进行位点特异性插入蛋白的方法（参见第8720页左边栏第2段），未记载叠氮赖氨酸在所插入蛋白中所起的作用，二者所属的技术领域、要解决的技术问题完全不同，本领域技术人员在对比文件3的基础上，考虑权利要求7改善干扰素药代动力学的技术问题时，不会想到对比文件4，也没有动机将对比文件4与对比文件3结合。而本申请通过高效的筛选后的pSUPAR-YAV质粒系统，优化过的干扰素序列（其N端4个稀有密码子被替换），以及优化的表达条件（大肠杆菌，表达质粒的组合，以及诱导条件），在特定位点上，干扰素的非天然氨基酸插入效率可以达到40-60mg/L，远远高于对比文件4中的插入效率。而此效果并不可从对比文件3或4中进行预期，是预料不到的技术效果。本申请中使用的OrigamiB感受态配合pET21载体使干扰素实现了大量的可溶性表达。（3）尽管环辛炔与叠氮的环加成反应在研究应用中已经较为普遍，但本申请是结合非天然氨基酸上的特殊叠氮基团。由于环辛炔结构的亲脂性，其也容易和蛋白质中的疏水部分发生黏链，进而造成修饰的不均一性（如“ClickChemistryforDrugDevelopmentandDiverseChemicalBiologyApplications”，PrakasamThirumurugan等，CHEMICALREVIEWS，第113卷，第4905-4979页，2013年3月27日）。因此本领域技术人员在已知环辛炔易与蛋白非特异性偶联或发生黏联的情况下，尽管其已经作为很好的细胞标记、偶联试剂，也不会想到将其应用到蛋白质药物的均一性化学修饰中。复审请求时新修改的权利要求1如下：“1.表达突变的tRNAPyl/PylRS的质粒，其是从保藏日为2013年4月8日、保藏号为CGMCCNo：7432的大肠埃希氏菌pSUPAR-YAV-tRNAPyl/PylRS中获取的pSUPAR-YAV-tRNAPyl/PylRS质粒；其中，所述质粒可以表达特异识别非天然氨基酸Lys-azido的tRNA和tRNA合成酶。”经形式审查合格，专利复审委员会于2017年4月28日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。原审查部门在前置审查意见书中认为，在非天然氨基酸上带有叠氮基团已经被对比文件3公开，其药代动力学方面的技术效果可合理预期。对于本申请采用Lys-azido而非pAF-azido，对比文件4明确给出了Lys-azido合成简单（2步即可合成）、产量高（80%）、可以高效率的定点插入到蛋白中的技术启示，在此启示下，本领域技术人员有动机将对本文件4中的Lys-azido用于对比文件3中去以提高hIFN中非天然氨基酸的插入效率，这并不存在任何技术障碍。此外，对比文件1中也已经公开了使用非天然氨基酸Lys-azido定点插入到hGH中的技术内容，这进一步佐证了选择非天然氨基酸Lys-azido定点插入到蛋白质中是本领域技术人员容易想到的，并不存在任何技术障碍，其技术效果可预期。（2）权利要求1中PylRS与对比文件1中公开的PylRS都是吡咯赖氨酸酰-tRNA合成酶。对比文件1中的pACYC-tRNA/PylRS上的tRNA合成酶并非野生型的tRNA合成酶，对比文件1明确公开了一种表达突变的tRNA/PylRS的质粒。与本申请的质粒相比，二者都能特异性的识别非天然氨基酸Lys-azido，把Lys-azido特异性的酰化到正交的tRNAlys上。本申请说明书中并未提及所述tRNA/PylRS不能识别Lys-diazirine，本领域技术人员无法得知tRNA/PylRS是否也能特异性识别Lys-diazirine，因此也无法判断何种质粒的插入效率更高。（3）权利要求1质粒的tRNA合成酶序列在原始申请文件中并未给出，无法对该序列的准确性和新创性进行判断。对于新提交的对比文件1质粒和本申请质粒的非天然氨基酸插入效率对比的补充实验数据，一方面在原始申请文件中也没有记载，另一方面这种效果差异可能是质粒骨架的不同带来的。而且从现有技术整体来看，使用识别非天然氨基酸Lys-azido的tRNA/RS，并将Lys-azido高效率的插入到目的蛋白中是本领域常用的技术，并不存在任何技术障碍。（4）对比文件2公开了为了改进这个系统的抑制效率，第二代抑制质粒pSup可以提高tRNA合成酶的表达水平，其带有增强glnS′启动子，同时带有6个proK启动子控制的RNA表达组件，pSUPAR质粒就是pSup质粒的一个衍生质粒。而pACYC质粒仅含有一个lactosepromoter，不含有上述提高tRNA合成酶的表达水平的质粒元件，本领域技术人员据此有动机用pSUPAR代替pACYC从而提高tRNA合成酶的表达水平以改进tRNA/PylRS的表达效率。因而坚持原驳回决定。随后，专利复审委员会成立合议组对本案进行审理。专利复审委员会于2017年8月28日向北京大学发出复审通知书，指出：权利要求1-20不具备专利法第二十二条第三款规定的创造性。（1）对比文件1公开了一种定点突变和定点修饰的生长激素、其制备方法及应用，并具体公开了一种表达突变的甲烷球菌的tRNA（tRNAPyl）和吡咯赖氨酸酰-tRNA合成酶（PylRS）的质粒pACYC-tRNA/PylRS：从保藏日为2011年6月14日、保藏号为CGMCCNo：4951的大肠埃希氏菌pACYC-tRNA/PylRS中获得，该质粒可以表达特异识别非天然氨基酸Lys-diazirine和Lys-azido的tRNA和tRNA合成酶。权利要求1与对比文件1相比，其区别特征在于：（1）权利要求1插入tRNAPyl/PylRS的质粒为pSUPAR-YAV，对比文件1为pACYC，该质粒来源的大肠杆菌的保藏号不同；（2）权利要求1质粒中的tRNA和tRNA合成酶特异识别非天然氨基酸Lys-azido，对比文件1质粒中的tRNA和tRNA合成酶特异识别非天然氨基酸Lys-diazirine和Lys-azido。对于区别技术特征（1），对比文件2给出了使用pSUPAR质粒可以提高tRNA/aaRS表达水平的技术启示，在此启示下，本领域技术人员有动机构建pSUPAR-YAV-tRNAPyl/PylRS质粒用以提高tRNAPyl/PylRS的表达水平。将导入有该质粒的大肠杆菌进行保藏则是本领域的常规操作。对于区别技术特征（2），在本申请日前，获得能够特异识别Lys-azido的tRNA/PylRS系统对于本领域技术人员来说也是容易的。因此，在对比文件1的基础上结合对比文件2给出的技术启示以及本领域的常规技术手段得到权利要求1请求保护的质粒对于本领域技术人员而言是显而易见的，权利要求1不具备专利法第二十二条第三款规定的创造性。获得转入质粒的大肠杆菌是本领域的常规技术手段。因此，权利要求2、3也不具备创造性。（2）对比文件1已经公开了一种制备含有非天然氨基酸的目的蛋白（生长激素）的方法。权利要求4与对比文件1的区别在于所选用的插入tRNA/PylRS的质粒不同。在本领域技术人员容易获得权利要求1所述质粒的情况下（参见权利要求1的评述），将其替换对比文件1的质粒表达tRNA/PylRS，用于将Lys-azido引入目的蛋白对于本领域技术人员来说也是显而易见的。对于权利要求4所述制备含有非天然氨基酸的干扰素的方法而言，权利要求4与对比文件1的区别还在于目的蛋白为干扰素，对比文件1为生长激素。本领域技术人员公知，干扰素与生长激素一样均存在半衰期短等药代动力学问题，需要PEG修饰，以及PEG修饰存在不均匀的问题。在对比文件1公开了所述方法能够在人生长激素中定点引入非天然氨基酸，为后续定点修饰的特异性提供保证的情况下，本领域技术人员容易想到将所述方法用于干扰素。此外，对比文件3给出了对干扰素中引入包括叠氮基的非天然氨基酸，以及在非天然氨基酸上进一步进行修饰的技术启示。因此，基于本领域技术人员的常识以及对比文件3的启示，本领域技术人员容易想到将对比文件1公开的方法用于干扰素上。因此，权利要求4、5也不具备创造性。利用所述方法得到权利要求6请求保护的蛋白质是本领域技术人员容易做到的。因此，权利要求6不具备创造性。对比文件1进一步公开了Lys-azido的结构以及如权利要求8所述的定点突变蛋白的结构特征，对比文件3公开了相应于权利要求7、8所述的干扰素突变位点。因此，权利要求7、8不具备创造性。对比文件1进一步公开了Lys-azido插入目的蛋白后的定点偶联分子式（IV）以及R7（相应于权利要求9、10的R3）上连接不同分子量PEG、环糊精、糖、核酸、氨基酸、多肽或羧基端修饰基团。因此，在对比文件1和3的基础上，结合本领域技术人员的常规技术手段，权利要求9、10不具备创造性。编码所述蛋白的核酸序列是本领域技术人员容易得到的，将其插入到合适的表达载体中是本领域的常规技术手段，将所述载体及质粒转入合适的细胞中进行表达是本领域的常规技术手段。因此，权利要求11-14不具备创造性。（3）本领域技术人员容易想到使用已经被用于蛋白质定点标记和定点修饰的无铜催化的环辛炔与叠氮环加成反应进行PEG的定点修饰。权利要求6-10不具备创造性的情况下，权利要求15不具备创造性。从属权利要求16的附加技术特征已经被对比文件1公开了或是本领域已知的，权利要求16不具备创造性。对比文件1公开了修饰的PEG的分子量范围为2kD-100kD。因此，基于权利要求6-10的审查意见，权利要求17不具备创造性。由于干扰素本身所具有的医药用途，将定点突变的干扰素以及PEG修饰的干扰素制成（药物）组合物，并用于抗病毒，治疗多种恶性肿瘤，免疫调节中，也是本领域技术人员容易想到的。因此，结合权利要求6-10、17的审查意见，权利要求18-20也不具备创造性。北京大学于2017年10月8日提交了意见陈述书和权利要求书的全文修改替换页（共5页20项）。相对于驳回决定的权利要求书而言，所作修改在于：（1）在原权利要求1中进一步限定“其中，所述质粒可以表达特异识别非天然氨基酸Lys-azido的tRNA和tRNA合成酶”；（2）将原权利要求4、7-9、15、17-20中的蛋白直接限定为干扰素，将原权利要求7的主题修改为“根据权利要求4或5的方法获得的定点突变的人干扰素”，将原权利要求8、9由独立权利要求修改为引用权利要求7的从属权利要求；（3）将原权利要求4中的载体限定为pET21a，将所述宿主细胞限定为OrigamiB。北京大学认为：（1）对比文件1和3均未公开或教导使用表达载体pET21a和宿主细胞OrigamiB的技术特征。包涵体的形成会降低干扰素α2b中Lys-azido非天然氨基酸的插入效率。使用BL21（DE3）表达干扰素大多处于包涵体，不能有效进行Lys-azido非天然氨基酸的插入。OrigamiB宿主细胞配合pET21a载体，实现了干扰素α2b高效可溶表达方式，从而可以实现在干扰素中进行Lys-azido的不同位点高效插入，具有实质性的进步。权利要求4具备创造性。相应地，权利要求5-20也具有创造性。（2）虽然正负筛选技术是常用技术，但是这种筛选并非总能筛选到高效的tRNA合成酶，本申请筛选获得了表达突变的tRNA／pylRS的质粒，该tRNA合成酶能够高效且特异性识别Lys-azido，其对于干扰素的插入效率可以达到40-60mg/L，产生了意想不到的技术效果。对比文件2仅公开了pSUPAR质粒的效果比早期版本质粒的效果好，没有给出启示pSUPAR质粒的效果要比对比文件1中的pACYC质粒效果好。对比文件2又提供了pEVOL以及pUltra质粒，具有增强的抑制效率。为了改进tRNAPyl/PylRS的表达效率，本领域技术人员也只会选择更加高效的pEVOL或pUltra质粒，而没有动机选择pSUPAR质粒。因此，权利要求1具备创造性。相应地，权利要求2-3也具有创造性。（3）由于环辛炔容易和蛋白质中的半胱氨酸，赖氨酸等残基进行非特异性偶联。其亲脂性结构也容易和蛋白质中的疏水部分发生黏链，进而造成修饰的不均一性。而干扰素α2b中存在4个半胱氨酸，形成两对二硫键，极易造成修饰的不均一，本申请在不经变性复性，直接进行可溶性表达的情况下，借助非天然氨基酸和无铜点击化学，对干扰素α2b进行单一位点的特异性修饰，优于已有的修饰方法，权利要求15具有创造性。答复复审通知书时提交的权利要求1、4、7-9、15、17-20如下：“1.表达突变的tRNAPyl/PylRS的质粒，其是从保藏日为2013年4月8日、保藏号为CGMCCNo：7432的大肠埃希氏菌pSUPAR-YAV-tRNAPyl/PylRS中获取的pSUPAR-YAV-tRNAPyl/PylRS质粒；其中，所述质粒可以表达特异识别非天然氨基酸Lys-azido的tRNA和tRNA合成酶。”“4.制备含有非天然氨基酸的目的蛋白的方法，其中所述目的蛋白为干扰素，包括步骤：(1)选择步骤：在干扰素的氨基酸序列中选择期望突变的一个或多个特定氨基酸位点；(2)基因突变：将编码对应于（1）中选择的位点的干扰素的氨基酸的密码子用基因工程方法突变为琥珀密码子；(3)表达载体构建：将（2）基因突变步骤得到的突变的干扰素的编码序列与载体pET21a可操作地连接，得到突变序列表达载体；(4)获得权利要求1的质粒；(5)表达：将（3）得到的突变序列表达载体与（4）的质粒共同转染相同的宿主细胞OrigamiB，将转染成功后的宿主细胞在含有Lys-azido的培养基中培养，并在合适的条件下诱导表达；(6)纯化含有非天然氨基酸的干扰素；和(7)任选的，对表达产物进行活性检测。”“7.根据权利要求4或5的方法获得的定点突变的人干扰素，其至少1个位点上的氨基酸被突变为非天然氨基酸，所述非天然氨基酸为：所示的Lys-azido。示例性地，所述突变位点可为SEQIDNO：1中任意位点上一个或多个的氨基酸。优选地，所述突变位点选自：示于SEQIDNO：1的序列的第P4位,H7位,S8位，K31位，H34位，E51位，A74位，G102位，T106位,E107位,M111位,Y129位,K133位,K134位,P137位,E159位或其他对活性影响较小的位点。8.根据权利要求7所述的定点突变的干扰素，其与示于突变前目的蛋白的氨基酸（例如SEQIDNO：1）的序列的区别在于：在突变前目的蛋白的氨基酸序列（例如SEQIDNO：1）所示的序列的第N位的氨基酸被突变为Lys-azido，所述突变氨基酸与突变前目的蛋白氨基酸序列（例如SEQIDNO：1）所示的序列的连接方式如下式所示：由R1到R2的方向为氨基酸序列的N末端到C末端方向，R1为突变前目的蛋白（例如SEQIDNO：1）所示序列的第1至第N-1位氨基酸残基，R2为突变前目的蛋白（例如SEQIDNO：1）所示序列的第N＋1位至C末端的氨基酸残基，R4为示例性地，所述第N位氨基酸可为SEQIDNO：1中任意位点上的一个或多个氨基酸。优选地，所述第N位的氨基酸选自第P4位,H7位,S8位，K31位，H34位，E51位，A74位，G102位，T106位,E107位,M111位,Y129位,K133位,K134位,P137位,E159位或其他对活性影响较小的位点的中一个或多个。9.根据权利要求7所述的定点突变的干扰素，其结构如下式所示：式(I):或式(II)其中，R1为突变前目的蛋白（例如SEQIDNO：1）所示序列的第1至第N-1位氨基酸残基，R2为突变前目的蛋白（例如SEQIDNO：1）所示序列的第N＋1位至C末端的氨基酸残基，R3为相同或不同分子量PEG，环糊精，糖，核酸，氨基酸，多肽或羧基端修饰基团。”“15.制备定点PEG化的干扰素的方法，包括：（1）获取甲氧基聚乙二醇胺及聚乙二醇单甲醚乙烯醚；（2）合成催化剂BTTES,或环辛炔；（3）将PEG与环辛炔进行偶联,得到无需铜离子催化的活性PEG；及将聚乙二醇单甲醚乙烯醚经过化学反应得到末端含炔基的PEG；和（4）将权利要求6-10中任一项的干扰素与（3）的活性PEG反应，得到用聚乙二醇定点修饰的突变的目的蛋白（例如干扰素）。”“17.定点改良的干扰素，其在权利要求6-10中任一项的干扰素的非天然氨基酸位置定点引入修饰，例如PEG修饰，优选所述PEG的分子量范围为2kD-100kD。18.组合物，其中含有有效量的权利要求6-10中任一项的干扰素或者权利要求17的定点改良的干扰素。19.药物组合物，其中含有有效量的权利要求6-10中任一项的干扰素或者权利要求17的定点改良的干扰素，以及药学上可以接受的载体。20.权利要求6-10中任一项的干扰素，或者权利要求17的定点改良的干扰素在制备长效、稳定性目的蛋白,用于抗病毒,治疗多种恶性肿瘤,免疫调节的药物中的用途。”在上述程序的基础上，专利复审委员会认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定，于2018年2月9日作出被诉决定。本院庭审中，北京大学确认对被诉决定的案由部分、决定的理由中的审查文本的认定部分无异议，并表示若本申请权利要求1、4、15不具备创造性，则其不再坚持权利要求2、3、5-14、16-20具备创造性的主张。另查，根据中央机构改革部署，专利复审委员会的相关职责由国家知识产权局统一行使。上述事实，有被诉决定、当事人提交的证据以及当事人陈述等证据在案佐证。本院认为：根据本案已查明的事实，结合当事人的诉辩称可知，本案当事人争议焦点在于：本申请权利要求1-20是否具备专利法第二十二条第三款规定的创造性。专利法第二十二条第三款规定：“创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步，该实用新型具有实质性特点和进步。”所谓发明具有突出的实质性特点，是指对本领域的技术人员来说，该发明或者实用新型相对于现有技术是非显而易见的；所谓发明具有显著的进步，是指该发明或者实用新型与现有技术相比能够产生有益的技术效果。判断发明或实用新型对本领域的技术人员来说是否显而易见，要确定的是现有技术整体上是否存在某种技术启示，即现有技术中是否给出将该发明或者实用新型的区别技术特征应用到最接近的现有技术以解决其存在的技术问题的启示，这种启示会使本领域的技术人员在面对相应的技术问题时，有动机改进最接近的现有技术并获得该发明或者实用新型专利技术。当上述区别技术特征为公知常识或为与最接近的现有技术相关的技术手段，或者为另一份对比文件披露的相关技术手段，且该技术手段在该对比文件中所起的作用与该区别技术特征在要求保护的发明或者实用新型中为解决相关技术问题所起的作用相同，通常可以认定现有技术中存在相应的技术启示。一、关于本申请权利要求1是否具备专利法第二十二条第三款规定的创造性。被诉决定认定本申请权利要求1所要求保护的技术方案与对比文件1的区别技术特征为：（1）权利要求1插入tRNAPyl/PylRS的质粒为pSUPAR-YAV，对比文件1为pACYC，该质粒来源的大肠杆菌的保藏号不同；（2）权利要求1质粒中的tRNA和tRNA合成酶特异识别非天然氨基酸Lys-azido，对比文件1质粒中的tRNA和tRNA合成酶特异识别非天然氨基酸Lys-diazirine和Lys-azido。北京大学认可被诉决定已归纳的上述区别技术特征，但对上述区别技术特征的评述意见不予认可，并主张被诉决定遗漏了“所述质粒可以表达特异识别非天然氨基酸Lys-azido的tRNA和tRNA合成酶”这一区别技术特征。首先，关于遗漏区别技术特征的问题。本院认为，区别技术特征（2）包含了北京大学认为遗漏的区别技术特征，被诉决定对区别技术特征的认定并无不当，本院予以确认。基于上述区别技术特征，可以确定权利要求1实际解决的技术问题是如何提高tRNAPyl/PylRS表达效率。其次，关于被诉决定对上述区别技术特征的评述。本院认为，对于区别技术特征（1），对比文件2公开了一个在大肠埃希氏菌中进行单个或多个非天然氨基酸突变的tRNA/aaRS系统，并具体公开了为了改进这个系统的抑制效率，第二代抑制质粒pSup可以提高tRNA合成酶的表达水平，对比文件2给出了使用pSUPAR质粒可以提高tRNA/aaRS表达水平的技术启示，在此启示下，本领域技术人员有动机构建pSUPAR-YAV-tRNAPyl/PylRS质粒用以提高tRNAPyl/PylRS的表达水平。对于区别技术特征（2），对比文件1说明书第[0019]段记载了“突变型的tRNAPyl，PylRS满足下列关系……获得的正交赖氨酰tRNA合酶/tRNA系统，使非20种常见氨基酸的Lys-diazirine和Lys-azido等与琥珀密码子TAG相对应，从而将非天然氨基酸定点引入到人生长激素中”，第[0110]段记载了“pACYC-tRNA/PylRS质粒可以表达特异识别非天然氨基酸Lys-diazirine和Lys-azido的tRNA和tRNA合成酶”，因此获得能够特异识别Lys-azido的tRNA/PylRS系统对于本领域的技术人员来说也是容易的。因此，在对比文件1的基础上结合对比文件2给出的技术启示以及本领域的常规技术手段得到权利要求1请求保护的质粒对于本领域技术人员而言是显而易见的，权利要求1不具备突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第二十二条第三款规定的创造性。二、关于本申请权利要求4是否具备专利法第二十二条第三款规定的创造性。对于权利要求4，北京大学认可被诉决定已归纳的区别技术特征（1）和（2），主张区别技术特征（3）应分为“载体”和“宿主细胞”两个区别技术特征，对上述区别技术特征的评述意见不予认可，并主张对比文件1中在含有Lys-diazirine或者Lys-azido的培养基中培养，而本申请中“在含有Lys-azido的培养基中培养”，被诉决定遗漏了这一区别技术特征。首先，关于区别技术特征的认定问题。对于区别技术特征（3），本院认为，表达载体pET21a和宿主细胞OrigamiB（DE3）是本领域常用于表达目的蛋白的载体和宿主，根据蛋白可溶性表达情况，从本领域常规选用的载体、宿主中，选择适合的载体、宿主对于本领域技术人员来说是常规技术手段，被诉决定对区别技术特征（3）的认定和评述并无不当，本院予以确认。对于遗漏区别技术特征的主张，对比文件1说明书第[0020]段、第[0060]段分别公开了“在发酵液（即培养基）中添加非天然氨基酸例如Lys-diazirine或Lys-azido”，“含有Lys-diazirine或者Lys-azido的培养基”。其中，Lys-diazirine、Lys-azido之间采用“或”进行连接，属于两个并列可选的技术特征。因此，对比文件1实际公开了含有Lys-azido的培养基，并不存在区别技术特征的遗漏。其次，关于被诉决定对上述区别技术特征的评述。本院认为，对于区别技术特征（1），在权利要求1所述质粒容易获得的情况下，本领域工作人员容易想到使用该质粒将Lys-azido引入目的蛋白。对于区别技术特征（2），作为在生物制药领域的常识，干扰素与生长激素都存在半衰期短、用药周期长，需要PEG修饰但修饰不均的问题。对比文件1公开了定点改良生长激素的方法，对比文件3给出了对干扰素中引入包括叠氮基的非天然氨基酸及进一步进行修饰的技术启示，本领域技术人员因此容易想到将上述方法用于干扰素，并不需要付出创造性劳动。因此，权利要求4不具备突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第二十二条第三款规定的创造性。三、关于本申请权利要求15是否具备专利法第二十二条第三款规定的创造性。权利要求15请求保护一种制备定点PEG化的干扰素的方法。参考文献作为早于本申请的公开出版物，公开了无铜催化的环张力型的炔与叠氮环加成反应已经被用于蛋白质定点标记和定点修饰，对比文件1说明书第[0192]段具体公开了Lys-azido定点突变蛋白与mPEG-炔在Cu2+催化下反应，对蛋白进行定点PEG修饰的方案，基于前述启示，本领域技术人员为了避免Cu2+细胞毒性的影响，容易想到使用已经被用于蛋白质定点标记和定点修饰的无铜催化的环辛炔与叠氮环加成反应进行PEG的定点修饰。至于已知的使用环辛炔所带来的问题，并未因本申请的方法而得到克服。因此，北京大学主张本申请取得了不可预期的技术效果缺乏事实依据，本院不予支持，权利要求15不具备突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第二十二条第三款规定的创造性。鉴于北京大学明确表示若权利要求1、4、15不具备创造性，则其不再坚持权利要求2、3、5-14、16-20具备创造性的主张。故在本申请的权利要求1、4、15不具备创造性的基础上，权利要求2、3、5-14、16-20亦不具备创造性。综上，被诉决定认定事实清楚，适用法律正确，作出程序合法，本院应予维持。北京大学的诉讼请求缺乏事实及法律依据，本院不予支持。据此，依照《中华人民共和国行政诉讼法》第六十九条之规定，本院判决如下：驳回原告北京大学的诉讼请求。案件受理费一百元，由原告北京大学负担（已交纳）。如不服本判决，各方当事人可于本判决书送达之日起十五日内，向本院提交上诉状及其副本，并交纳上诉案件受理费一百元，上诉于中华人民共和国最高人民法院。审 判 长  李志峰人民陪审员  徐桂红人民陪审员  张艳萍二〇二〇年九月二十七日法官 助理  刘 琳技术调查官张鑫蕊书记员项童