中华人民共和国北京知识产权法院行 政 判 决 书（2018）京73行初8813号原告EPI基因组股份公司，住所地德意志联邦共和国柏林市见奈斯特路大街**。法定代表人阿尔伯特·韦伯，财务执行副总裁。法定代表人约恩·勒温，德国高级研究经理/知识产权和管理主管。委托代理人张英，北京康信知识产权代理有限责任公司专利代理师。委托代理人郑希元，北京康瑞律师事务所律师。被告中华人民共和国国家知识产权局，住所地中华人民共和国北京市海淀区蓟门桥西土城路**。法定代表人申长雨，局长。委托代理人邹凯，中华人民共和国国家知识产权局审查员。委托代理人刘新蕾，中华人民共和国国家知识产权局审查员。第三人江苏为真生物医药技术股份有限公司，住所地中华人民共和国江苏省苏州市苏州工业园区星湖街**生物纳米园****。法定代表人王弢，董事长。委托代理人齐宏涛，北京华朗律师事务所律师。委托代理人宁菁，北京汉迪律师事务所专利代理师。原告EPI基因组股份公司（简称EPI公司）因发明专利权无效行政纠纷一案，不服被告原中华人民共和国国家知识产权局专利复审委员会（简称专利复审委员会）作出的第36018号无效宣告请求审查决定（简称被诉决定），于法定期限内向本院提起诉讼。本院受理后，依法组成合议庭，并通知江苏为真生物医药技术股份有限公司（简称为真公司）作为本案的第三人参加诉讼。2020年9月11日，本院依法公开开庭审理了本案。原告EPI公司的委托代理人张英、郑希元，被告中华人民共和国国家知识产权局（简称国家知识产权局）的委托代理人刘新蕾，第三人为真公司的委托代理人齐宏涛、宁菁到庭参加了诉讼。本案现已审理终结。被诉决定系专利复审委员会针对为真公司就EPI公司拥有的专利号为02805507.1，名称为“探测胞嘧啶甲基化模式的高灵敏度方法”的发明专利（简称本专利）所提无效请求作出的。专利复审委员会在该决定中认定：权利要求1与证据1的区别技术特征在于：权利要求1所述的PCR扩增中还使用了至少一种额外的寡核苷酸，所述额外的寡核苷酸优先结合背景DNA并对其扩增产生不利影响，其结合背景DNA的位点与引物在背景DNA上的结合位点重叠，因而能够阻碍至少一种引物寡核苷酸与背景DNA的结合，其具体结合5’-CG-3’二核苷酸或5’-TG-3’二核苷酸或5’-CA-3’二核苷酸。基于上述区别技术特征所实现的技术效果可以确定，权利要求1实际解决的技术问题是使用另外一种阻断技术最终通过PCR方法来实现甲基化DNA的扩增和检测。证据2给出了采用不能延伸的寡核苷酸作为阻断剂优先与背景DNA结合，以对背景DNA模板的扩增产生不利影响，从而进一步实现优先扩增研究DNA模板的技术启示。虽然证据2中具体采用的不能延伸的作为阻断剂的寡核苷酸结合背景DNA模板上位于两个引物区域之间的DNA区域，但证据2明确指出也可以使用使寡核苷酸不能延伸的其他方法（参见证据2译文第8页第3段）。证据4已经公开了在PCR过程中加入与引物竞争结合目标序列的PNA寡聚体作为阻断剂的内容，并且所起的作用与权利要求1中寡核苷酸阻断剂的作用相同。因此，证据4给出了在PCR过程中加入与引物结合位点产生竞争结合的阻断剂以“特异性地对背景DNA的PCR扩增产生不利影响，从而选择性地扩增所研究的DNA”的技术启示。结合证据2公开的内容，本领域技术人员容易想到采用寡核苷酸作为阻断剂，在具体设计作为阻断剂的寡核苷酸时，结合证据4中给出的采用与引物结合位点产生竞争结合的阻断剂PNA的技术启示，以及本领域技术人员公知的PNA（肽核酸）和普通的寡核苷酸作为阻断剂时所具有的相似作用原理，容易想到将寡核苷酸设计成与引物结合位点产生竞争结合的形式，以在抑制背景DNA扩增的同时促进目标DNA的扩增。具体阻断剂所结合的靶序列的组成是基于阻断剂最终所要阻断并实现差异化扩增的序列之间的异同容易确定的，当在证据1的方法中采用阻断剂时，基于亚硫酸氢盐处理后背景DNA和目标DNA的序列差异，以及最终为了实现两者差异化扩增的目的，本领域技术人员容易想到将背景DNA和目标DNA之间存在差异化的部分，例如一种存在甲基化，另外一种未甲基化的部分作为扩增区域的一部分并将阻断剂靶向该区域以使两者的PCR扩增结果差异化，即当在证据1的方法中想到采用寡核苷酸作为阻断剂时，本领域技术人员基于基本的碱基配对原理和亚硫酸氢盐处理后背景DNA和目标DNA的序列差异容易想到采用具体结合5’-CG-3’二核苷酸或5’-TG-3’二核苷酸或5’-CA-3’二核苷酸的寡核苷酸作为阻断剂。因此，权利要求1相对于证据1、2、4和本领域公知常识的结合不具备《中华人民共和国专利法》（简称专利法）第二十二条第三款规定的创造性。权利要求2、3的附加技术特征对样品来源进行了进一步的限定，证据1中公开了DNA来源为细胞系、原发肿瘤或正常组织的内容（参见证据1译文第4页第2段）。证据6公开了一种GST-PiJ基因的甲基化检测方法，其中公开了用于甲基化测定的样品DNA可分离自任何合适的人体样品，如组织、血液、精液、尿液、淋巴液或者骨髓的细胞等内容（参见证据6译文第5页-第6页）；证据9涉及PCR技术操作和应用，其中公开了一般的PCR方法及应用，具体公开了从血液或其他体液、以及包埋于石蜡中的多种组织中获得样品DNA用于PCR反应的内容（参见证据9下标第7页“PCR条件的优化”部分），该内容也表明从不同来源的体液和组织获取样品DNA用于PCR也是本领域的常规选择，因此，在权利要求1不具备创造性的基础上，权利要求2、3也不具备专利法第二十二条第三款规定的创造性。权利要求4的附加技术特征为“化学处理是在将DNA包埋于琼脂糖中之后进行的”，权利要求5的附加技术特征为“使DNA双链体变性的试剂和/或自由基阱存在于化学处理中”。证据5公开了一种复杂DNA甲基化指纹的制备方法，其与证据1均属于DNA甲基化检测这一相同领域，其中具体公开了将DNA包埋于琼脂糖中用于DNA的固定以对其进行化学处理的内容（参见证据5说明书第14页最后1段），此外证据1也公开了采用0.2M氢氧化钠溶液在37℃下处理10分钟进行DNA变性，之后再加入亚硫酸氢钠溶液进行化学处理的内容，还公开了对于纳克级的DNA样品采用对苯二酚和亚硫酸氢钠同时进行处理的内容（参见证据1译文第4页第3段），而且采用自由基阱对DNA进行变性也是本领域技术人员的常规技术手段。因此，在权利要求1-3不具备创造性的基础上，权利要求4、5也不具备专利法第二十二条第三款规定的创造性。权利要求6的附加技术特征限定使用至少两个额外的寡核苷酸，其中它们的结合位点再次分别与引物在背景DNA上的结合位点重叠，且所述额外的寡核苷酸阻碍了这两个引物寡核苷酸与背景DNA的结合。权利要求7引用权利要求6时进一步限定额外的寡核苷酸之一阻碍了正向引物的结合，而另一个阻碍了反向引物的结合。如上所述，证据4公开了利用PNA寡聚体与PCR引物之间对于公共靶序列位点的竞争性结合来增强PCR特异性的原理。基于此，在采用寡核苷酸作为阻断剂时，为了相对彻底地防止引物与背景DNA结合从而有效阻断背景DNA的扩增，采用分别与引物对中的一个引物具有相重叠的结合位点的两个额外的寡核苷酸使得额外的寡核苷酸之一阻碍正向引物的结合，而另一个阻碍反向引物的结合优先结合背景DNA，从而使得引物与背景DNA相互排斥，是本领域技术人员通过简单的逻辑推理即可想到的。因此，在权利要求1不具备创造性的基础上，权利要求6、7也不具备专利法第二十二条第三款规定的创造性。权利要求8的附加技术特征限定所述额外的寡核苷酸至少以相对于引物寡核苷酸5倍的浓度存在。由于背景DNA存在的数量相对于研究DNA更为巨大，为了优化寡核苷酸阻断背景DNA扩增的效果，提高额外的寡核苷酸的浓度进而提高其对背景DNA的阻断概率，采用所述额外的寡核苷酸至少以相对于引物寡核苷酸5倍的浓度存在是本领域技术人员的常规选择。另外，证据4还公开了在设计PCR反应体系时，需要测试不同PNA浓度对PCR反应的抑制程度的影响，即证据4给出了利用常规实验手段调整PCR反应体系中阻断剂浓度范围的技术启示（参见证据4译文第4页倒数第1和第2段）。可见，本领域技术人员可以根据实际需要利用常规实验手段得到适合的寡核苷酸的浓度范围。因此，在权利要求5-7不具备创造性的基础上，权利要求8也不具备专利法第二十二条第三款规定的创造性。权利要求9进一步限定寡核苷酸结合背景DNA并因而阻碍了引物寡核苷酸在聚合酶反应中的完全延伸。如上所述，在证据2和4的基础上本领域技术人员容易想到采用与引物竞争结合相同位点的寡核苷酸作为阻断剂，使用这种阻断剂时，寡核苷酸阻断了引物与背景DNA的结合最终必然会产生阻碍引物寡核苷酸在聚合酶反应中完全延伸的效果。因此，在权利要求5不具备创造性的基础上，权利要求9也不具备专利法第二十二条第三款规定的创造性。权利要求10、11分别进一步限定“所用的聚合酶不具有5’-3’外切核酸酶活性”和“额外的寡核苷酸存在5'末端的修饰，并因而不能被具有5'-3'外切核酸酶活性的聚合酶显著地破坏”。本领域公知，在PCR扩增中寡核苷酸不被聚合酶切割的前提是该聚合酶不具有5'-3'外切核酸酶活性，或者是该寡核苷酸存在5'末端的修饰能够阻止聚合酶的切割，因此为了保证PCR扩增中所述额外的寡核苷酸在反应过程中能够持续有效地抑制背景DNA扩增，本领域技术人员有动机选择上述两种机制来防止寡核苷酸被聚合酶破坏从而失去阻断背景DNA扩增的目的。另外，证据2中公开了采用不具有5’-3’外切核酸酶活性的Taq聚合酶的Stoffel片段以防止阻断寡核苷酸被聚合酶分解的内容（参见证据2摘要部分的译文）。因此，在权利要求9不具备创造性的基础上，权利要求10、11也不具备专利法第二十二条第三款规定的创造性。权利要求12的附加技术特征限定“除引物之外使用的寡核苷酸不具备3’-OH功能”，证据2公开了为了防止阻断寡核苷酸发生延伸反应，除了将其设计为3’位不具有配对碱基末端，也可以使用使寡核苷酸不能延伸的其他方法的内容（参见证据2译文第8页第3段），此外，本领域公知，引物是在核酸合成反应时，作为多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链，在引物的3’-OH上，核苷酸以二酯链形式进行合成，因此，引物的3’-OH必须是游离的，无3’-OH功能的寡核苷酸不能被聚合酶所延伸，即不具备引物功能。而额外的寡核苷酸作为阻断剂，其作用是为了阻断延伸而非像引物一样作为链延伸反应的起点，本领域技术人员为了防止PCR扩增反应中除引物以外的其他寡核苷酸可能产生的延伸反应干扰和影响引物延伸所产生的结果，保证PCR扩增中其他寡核苷酸不被聚合酶所延伸，有动机选择不具备3'-OH功能的寡核苷酸用于PCR反应。因此，在权利要求5-11不具备创造性的基础上，权利要求12也不具备专利法第二十二条第三款规定的创造性。权利要求13进一步限定了步骤b的具体操作方式，权利要求14-19进一步限定了报道分子的结构和测定方式。涉及GST-PiJ基因的甲基化检测方法的证据6中公开了PCR产物的荧光实时监测方法，其在PCR扩增反应中使用荧光标记物以便实时监测PCR产物的状况（参见证据6译文第11页最后1段至第12页）。同时，本领域公知，将报道寡核苷酸加入PCR扩增体系中，利用其与目标序列的结合可有效指示目标序列的扩增；对报道寡核苷酸进行荧光标记（例如，带有至少一个荧光标记），并且可借助荧光共振能量转移（例如，TaqMan测定、LightCycler测定等）进行核酸杂交探测，依据荧光的增减以及荧光信号来分析判断PCR扩增状况。因此，本领域技术人员有动机进一步将报道寡核苷酸应用于PCR扩增体系中，利用其与目标序列的结合指示目标序列的扩增；亦有动机对报道寡核苷酸进行荧光标记（例如，带有至少一个荧光标记），并且可借助荧光共振能量转移（例如，TaqMan测定、LightCycler测定等）进行核酸杂交探测，或者依据荧光的增减以及荧光信号来分析判断PCR扩增状况，进而确定所研究的DNA的甲基化状态。因此，权利要求13-19也不具备专利法第二十二条第三款规定的创造性。权利要求20、21的附加技术特征分别限定背景DNA以所研究的DNA浓度的100或1000倍存在。证据1中公开了纳克级的DNA样品中添加1微克（μg）鲑鱼精DNA作为载体进行扩增检测的内容（参见证据1译文第4页第3段），即证据1公开了背景DNA以所研究的DNA浓度的1000倍存在的内容，此外，证据3公开了一种检测大量正常DNA中存在的微量突变的DNA等位基因的新型阻断物-PCR方法，其也涉及与证据2相类似的PCR阻断扩增技术，其摘要部分公开了当两种不同类型的N-ras突变与过量的正常DNA的比例为1：1000时可以被有效地扩增的内容。基于证据1、3的上述内容，本领域技术人员也能够预期继续降低背景DNA的含量比例以使背景DNA的干扰效果降低时，例如背景DNA的浓度为所研究DNA浓度的100倍时，同样能够实现扩增效果。而且，为了获得理想的选择性扩增效果以便检测到胞嘧啶甲基化，选择合适比例的背景DNA与研究DNA也属于本领域技术人员的常规选择，因此，在权利要求1-19不具备创造性的基础上，权利要求20、21也不具备专利法第二十二条第三款规定的创造性。权利要求22进一步限定了分析的方式以及所用寡聚体的类型，权利要求23-26进一步限定了寡聚体或研究DNA的种类及性质。证据6公开了“可以利用DNA测序芯片上的上述寡核苷酸阵列确立整个序列区域中扩增的DNA序列”（参见证据6译文第11页第1段）。证据5公开了一种复杂DNA甲基化指纹的制备方法，其中具体公开了在DNA芯片上对甲基化CpG二核苷酸进行检测的内容，其原理也是应用了胞嘧啶与亚硫酸氢盐反应后形成尿嘧啶，而5-甲基胞嘧啶与之反应而不被修饰的原理，对5-甲基胞嘧啶（主要是CpG二核苷酸的甲基化状态）通过杂交的方式进行检测。其中寡聚物阵列可以是PNA、修饰或未修改的寡核苷酸阵列（参见证据5说明书第21页第4.4.1节，第24页第1段），证据5、6都涉及DNA甲基化检测，因此本领域技术人员有动机在甲基化检测的过程中使用其中公开的带有修饰或未修饰的寡核苷酸形成的寡聚体阵列对所研究DNA进一步进行杂交分析，所述寡聚体与所研究DNA杂交的区段大小、一个实验能探测得到的甲基化位置数目都是依据芯片杂交的影响因素、芯片上所包含的集合的寡核苷酸的多少容易确定的，所述的寡聚体包含与胞嘧啶相关靶序列对应的CG、TG或CA二核苷酸亦是本领域技术人员容易想到的。因此，在权利要求1-21不具备创造性的基础上，权利要求22-26也不具备专利法第二十二条第三款规定的创造性。权利要求27-30进一步限定了测定扩增DNA长度的方法。证据5公开了甲基化测定中DNA长度测定的分析方法，其中包括自动测序系统、毛细管电泳、质谱分析法（参见证据5说明书第5页、第6页）。证据6还公开了可按照标准方案进行探测扩增DNA存在的步骤（参见证据6译文第8页第3段），例如采用凝胶电泳，然后观测与扩增DNA对应的条带的方法。此外，本领域公知，凝胶电泳、毛细管凝胶电泳、层析（例如，HPLC层析等）、质谱分析、测序（例如，桑格方法、马吉测序法、通过杂交的测序SBH等）均是测定扩增DNA存在或结构的常用技术手段，同时可针对突变DNA的位点进行单独测序以确定相应的突变状况。可见，本领域技术人员为了测定扩增的DNA以便得到胞嘧啶甲基化状况，有动机选用以上常用技术手段，并针对研究的CpG位点进行单独测序以确定相应的甲基化状况。因此，在权利要求1-22不具备创造性的基础上，权利要求27-30也不具备专利法第二十二条第三款规定的创造性。权利要求31进一步限定了将检测得到的甲基化程度用于推断疾病或者医学状况。证据6公开了所述在人体样品中检测胞嘧啶甲基化的方法可用于诊断或预测人体的疾病或者病况（参见证据6译文第3页第1段，第5页第2段和倒数第2段，第7页最后1段、第8页第4段）。因此，在权利要求1-30不具备创造性的基础上，权利要求31也不具备专利法第二十二条第三款规定的创造性。权利要求32-35、37的附加技术特征分别为：该标记为荧光标记；该标记为放射性核素；该标记为在质谱仪中探测的可除去的质量标记；扩增产物是全部在质谱仪上探测并由此通过其质量明确地进行特征记录。然而采用扩增产物自带的荧光标记、放射性核素、在质谱仪中探测的可除去的质量标记对其进行探测，以及产物全部在质谱仪上探测并由此通过其质量明确地进行特征记录，是本领域技术人员在DNA检测领域中的常规技术手段（例如，可参见公开PCR反应相关公知常识的证据10，其中公开了采用扩增产物自带的荧光标记对扩增产物进行探测）。因此，在权利要求1-30不具备创造性的基础上，权利要求32-35、37也不具备专利法第二十二条第三款规定的创造性。权利要求36进一步限定了在扩增反应中引物之一是结合在固相上的。而将引物结合于固相载体进行PCR扩增反应属于常规技术手段，有助于提高扩增反应的效率并充分利用引物。因此，在权利要求35不具备创造性的基础上，权利要求36也不具备专利法第二十二条第三款规定的创造性。权利要求38要求保护根据权利要求1-37之一的方法的用途，用于区别细胞类型或组织或者用于研究细胞分化。本领域已知，DNA胞嘧啶甲基化与细胞类型、所属组织或者细胞分化均有密切联系，可以作为区别细胞类型或组织，以及研究细胞分化的重要指标。本领域技术人员为了区别细胞类型或组织，以及研究细胞分化，有动机应用权利要求1-37之一的方法，上述用途属于本领域的常规应用，在权利要求1-37不具备创造性的基础上，权利要求38也不具备专利法第二十二条第三款规定的创造性。权利要求39要求保护一种试剂盒，该试剂盒包括含有亚硫酸氢盐的试剂、引物和其它用于产生扩增产物的无3’-OH功能的寡核苷酸，以及可选择的实施根据权利要求1-37中之一的测定的说明书。如上所述，权利要求1-37所述的探测方法不具备创造性。在此情况下，将方法中所使用的试剂以及说明书制备成试剂盒，属于本领域的常规技术手段，也不足以给试剂盒本身带来创造性。因此，权利要求39也不具备专利法第二十二条第三款规定的创造性。据此，专利复审委员会作出被诉决定，宣告本专利权全部无效。原告EPI公司不服被诉决定，在法定期限内起诉称：一、原告提交的证据中显示，“PNA的最大贡献可来自不能使用寡核苷酸进行的新应用的开发中”，证据4属于不能使用寡核苷酸进行的新应用，且PNA寡聚体具有更好的亲和力，因此，本领域技术人员不容易想到采用寡核苷酸代替PNA寡聚体，被诉决定相关认定有误，本专利权利要求1相对于证据1、2、4及公知常识的结合具备创造性。二、在权利要求1具备创造性的情况下，从属权利要求亦具备创造性。三、即便权利要求1不具备创造性，但权利要求5-14、17-26、28、30-32、38、39亦具备创造性。据此，被诉决定认定有误，请求法院依法予以撤销并判令被告重新作出无效决定。被告国家知识产权局认为被诉决定认定事实清楚，适用法律正确，请求法院依法驳回原告的诉讼请求。第三人为真公司认为被诉决定认定事实清楚，适用法律正确，请求法院依法驳回原告的诉讼请求。本院经审理查明：本专利系名称为“探测胞嘧啶甲基化模式的高灵敏度方法”的第02805507.1号发明专利，申请日为2002年3月8日，最早优先权日为2001年3月9日，授权公告日为2007年11月7日，专利权人为EPI公司。针对本专利，为真公司于2017年12月6日向专利复审委员会提出无效宣告请求，同时提交了相关证据，其中：证据1：JGHerman等，“Methylation-specificPCR：Anove1PCRassayformethylationstatusofCpGislands”，《ProceedingsoftheNationa1AcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica》，1996，93（18）：9821-9826，及其中文译文。证据1公开了一种用于检测CpG岛上的甲基化位点的甲基化特异性PCR方法（参见证据1译文第3页第3段），该方法利用亚硫酸氢盐改性产生的序列差异，设计引物，从亚硫酸氢盐改性的DNA中区分甲基化DNA和未甲基化DNA，其中的具体实施例以P16基因为研究基因，在将正常细胞（非甲基化）和癌症细胞（具有甲基化的胞嘧啶碱基）中提取的DNA进行亚硫酸氢盐处理（参见证据1译文第4页第3段）后，所有非甲基化的胞嘧啶碱基都转变为尿嘧啶，5’-甲基化胞嘧啶仍然为胞嘧啶（参见证据1译文第3页第2段），然后设计引物以区分甲基化和未甲基化的DNA（所采用的引物的具体核苷酸序列详见证据1的表1），通过加入引物和Taq聚合酶对亚硫酸氢盐处理过的DNA进行扩增，其中所使用的引物分为未改性或野生型引物、甲基化特异性引物和未甲基化特异性引物。最后，通过丙烯酰胺凝胶电泳或限制性酶切反应进一步分析P16基因中CpG岛上的甲基化状态（参见证据1译文第5页第2、3段）。实验结果表明，用甲基化引物只能扩增来自包含甲基化P16等位基因的细胞系的DNA，含有未甲基化P16等位基因的细胞系的DNA只能用未甲基化引物进行扩增，在混合有甲基化P16等位基因和未甲基化P16等位基因的DNA样本中，所述方法能够一致地检测另外的未甲基化样本中0.1%的甲基化DNA(参见证据1译文第8页第2段和第9页第2段)，是一个简单、敏感和特异性的方法，可用于确定几乎任何一个富集CpG的区域的甲基化状态(参见证据1译文最后1页)。证据2：US5849497A的美国专利公开文本，公开日为1998年12月15日，及其中文译文。证据2公开了一种使用不能延伸的寡核苷酸特异性抑制PCR扩增的方法，即采用不具备5’-3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶，通过不能延伸的寡核苷酸优选地与非研究DNA模板结合并阻碍引物在聚合酶反应中的延伸，进而降低非研究DNA的扩增效率，从而促进所研究DNA的选择性扩增和富集，所述方法可以用于区分可被相同的广范围引物引发的不同种类细菌的核糖体序列，也可以用于阻止特定序列不必要的扩增（参见证据2译文第7页发明内容部分和第11页第3段）。证据2还公开了因为PNA不容易合成，因此不容易应用。而且每个碱基的成本要比相应的DNA寡核苷酸阻断剂贵的多。因此，这种方法既不经济有效，又不广泛应用。（参见证据2译文第6页第4段）证据2明确指出也可以使用使寡核苷酸不能延伸的其他方法（参见证据2译文第8页第3段）。证据4：Henrik??rum，“PCRClamping”，《CurrentIssuesinMolecularBiology》，2000，2（1）：27-30，及其中文译文。证据4涉及PCR锁止技术，其公开了一种基于PCR的选择性扩增DNA靶序列的方法，所述方法特异性地阻断野生型基因的PCR产物的生成，从而有效地扩增突变型DNA，具体方法是使用PNA寡聚体优先与野生型基因上的靶序列结合，以阻断引物与靶序列的结合或者阻碍引物在聚合酶反应中的延伸，从而对野生型基因的扩增产生不利影响，并且在突变型基因也存在时，使得突变型基因被优选地扩增（参见证据4译文第1、2页），所述锁止技术基于PNA和DNA引物对一个共同靶点的物理竞争而进行（参见证据4译文第4页第1段）。专利复审委员会受理上述无效宣告请求后，于2018年4月27日举行了口头审理。口头审理结束后，EPI公司于2018年5月3日提交了正式的与其口审当庭陈述作为审理基础的权利要求书相一致的权利要求书（共39项），同时再次重申了其在口审当庭的意见陈述，修改后的权利要求书如下：“1.一种在DNA样品中探测胞嘧啶甲基化的方法，其特征在于，进行了下面的步骤：将包含所研究的DNA和背景DNA的基因组DNA样品以这样一种方式进行化学处理，从而使得所有非甲基化的胞嘧啶碱基都转变为尿嘧啶，而5-甲基胞嘧啶碱基保持不变，其中，所述化学处理是用亚硫酸氢盐进行的；用至少2个引物寡核苷酸、一个聚合酶和至少一种额外的寡核苷酸对经化学处理的DNA样品进行扩增，其中该寡核苷酸结合5’-CG-3’二核苷酸或5’-TG-3’二核苷酸或5’-CA-3’二核苷酸，其中该额外的寡核苷酸优先地结合背景DNA并对其扩增产生不利影响，在扩增中所研究的DNA相对于背景DNA是优先被作为模板的，并且分析扩增产物，并从扩增产物的存在性和/或从对其它位置的分析中推断所研究的DNA中的甲基化状态。其特征在于，该额外的寡核苷酸的结合位点与引物在背景DNA上的结合位点重叠，且该额外的寡核苷酸阻碍了至少一种引物寡核苷酸与背景DNA的结合。2.根据权利要求1的方法，其特征在于，样品DNA是从个体的血清或其它体液中获得的。3.根据权利要求1的方法，其特征在于，样品DNA是从细胞系、血液、痰、粪便、尿、血清、脑脊液、包埋于石蜡中的组织如来自眼、肠、肾、脑、心、前列腺、肺、乳房或肝的组织、组织载玻片和其所有可能的组合中获得的。4.根据权利要求1-3的方法，其特征在于，化学处理是在将DNA包埋于琼脂糖中之后进行的。5.根据权利要求1-3的方法，其特征在于，使DNA双链体变性的试剂和/或自由基阱存在于化学处理中。6.根据权利要求1的方法，其特征在于，使用至少两个额外的寡核苷酸，其中它们的结合位点再次分别与引物在背景DNA上的结合位点重叠，且所述额外的寡核苷酸都阻碍了这两个引物寡核苷酸与背景DNA的结合。7.根据权利要求6的方法，其特征在于，额外的寡核苷酸之一阻碍了正向引物的结合，而另一个阻碍了反向引物的结合。8.根据权利要求5～7中之一的方法，其特征在于，所述额外的寡核苷酸至少以相对于引物寡核苷酸5倍的浓度存在。9.根据权利要求5的方法，其特征在于，额外的寡核苷酸结合背景DNA并因而阻碍了引物寡核苷酸在聚合酶反应中的完全延伸。10.根据权利要求9的方法，其特征在于，所用的聚合酶不具有5’-3’外切核酸酶活性。11.根据权利要求9的方法，其特征在于，额外的寡核苷酸存在5’末端的修饰，并因而不能被具有5’-3’外切核酸酶活性的聚合酶显著地破坏。12.根据权利要求5～11中之一的方法，其特征在于，除引物之外使用的寡核苷酸不具备3’-OH功能。13.根据权利要求1～12中之一的方法，其特征在于，在第二步骤中，经化学处理的DNA样品使用至少2个引物寡核苷酸和一个额外的与5’-CG-3’二核苷酸或5’-TG-3’二核苷酸或5’-CA-3’二核苷酸杂交的寡核苷酸，和至少一个与5’-CG-3’二核苷酸或5’-TG-3’二核苷酸或5’-CA-3’二核苷酸杂交的报道寡核苷酸以及聚合酶进行扩增；其中该额外的寡核苷酸优先结合背景DNA并对其扩增产生不利影响，且其中该报道寡核苷酸优先结合所研究的DNA并指示其扩增。14.根据权利要求13的方法，其特征在于，是相对于报道寡核苷酸附加地使用另一个用荧光染料进行标记的寡聚体，该寡聚体直接在邻近报道寡核苷酸处进行杂交，且该杂交借助荧光共振能量转移进行探测。15.根据权利要求13或14中之一的方法，其特征在于，进行TaqMan测定。16.根据权利要求13或14中之一的方法，其特征在于，进行LightCycler测定。17.根据权利要求13～16中之一的方法，其特征在于，报道寡核苷酸带有至少一个荧光标记。18.根据权利要求13～17中之一的方法，其特征在于，报道分子通过荧光的增加或减少以显示扩增。19.根据权利要求18的方法，其特征在于，荧光的增加和减少也直接用于分析，且所研究的DNA的甲基化状态从荧光信号来推断。20.根据权利要求1～19中之一的方法，其特征在于，背景DNA以所研究的DNA浓度的100倍存在。21.根据权利要求1～19中之一的方法，其特征在于，背景DNA以所研究的DNA浓度的1000倍存在。22.根据权利要求1～21中之一的方法，其特征在于，该分析或者在根据权利要求4～8的方法情况下，进一步的分析是借助与寡聚体阵列的杂交来进行的，其中寡聚体可以是核酸或与其杂交性质上相似的分子。23.根据权利要求22的方法，所述寡聚体是PNA。24.根据权利要求22的方法，其特征在于，该寡聚体通过12-22个碱基长的区段与所研究的DNA杂交且它们包括CG、TG或CA二核苷酸。25.根据权利要求22的方法，其特征在于，所研究的DNA中多于20个甲基化位置的甲基化状态是在一个实验中探测的。26.根据权利要求22的方法，其特征在于，所研究的DNA中多于60个甲基化位置的甲基化状态是在一个实验中探测的。27.根据权利要求1～22中之一的方法，其特征在于，所述分析是通过对扩增的所研究的DNA的长度测量来进行的，其中长度测量的方法包括凝胶电泳、毛细管凝胶电泳、层析、质谱分析和其它适宜的方法。28.根据权利要求27的方法，所述层析是HPLC。29.根据权利要求1～22中之一的方法，其特征在于，所述分析是通过测序进行的，其中测序方法包括桑格方法、马吉测序法和通过杂交的测序(SBH)。30.根据权利要求29的方法，其特征在于，对每一个或一小组CpG位置的测序分别用一个单独的引物寡核苷酸进行，且引物延伸仅构成了一个或几个碱基段，且从引物延伸类型推断所研究的DNA中相关位置的甲基化状态。31.根据权利要求1～30中之一的方法，其特征在于，从不同的经研究的CpG位置的甲基化程度能够推断病人的疾病或另一种医学状况的存在。32.根据权利要求1～31之一的方法，其特征在于，扩增产物本身带有可探测的标记用于对其进行探测。33.根据权利要求32的方法，其特征在于，该标记为荧光标记。34.根据权利要求32的方法，其特征在于，该标记为放射性核素。35.根据权利要求32的方法，其特征在于，该标记为在质谱仪中探测的可除去的质量标记。36.根据权利要求1～35之一的方法，其特征在于，在扩增反应中引物之一是结合在固相上的。37.根据权利要求1～32中之一的方法，其特征在于，扩增产物是全部在质谱仪上探测并由此通过其质量明确地进行特征记录。38.根据权利要求1～37之一的方法的用途，用于区别细胞类型或组织或者用于研究细胞分化。39.一种试剂盒，该试剂盒包括含有亚硫酸氢盐的试剂、引物和其它用于产生扩增产物的无3’-OH功能的寡核苷酸，以及可选择的实施根据权利要求1～37中之一的测定的说明书。”在此基础上，专利复审委员会于2018年5月17日作出被诉决定，宣告本专利权全部无效。诉讼阶段，原告提交了包含有国家图书馆文献提供中心出具的《文献复制证明》的、1999年出版的、题目为《PEPTIDENUCLEICACIDS》的书籍复印件（共33页）及其中文译文。该文献记载，“PNA主链的中性特征是一个重要特征，其产生了许多结果。其中最令人印象深刻的是在低至中等离子强度下，互补的PNA/DNA链之间的结合比互补的DNA/DNA链之间的结合更强”、“PNA可用于许多与传统合成DNA或DNA类似物相同的应用中。然而，PNA的最大贡献可来自不能使用寡核苷酸进行的新应用的开发中”。另查，根据中央机构改革部署，原国家知识产权局专利复审委员会的相关职责由国家知识产权局统一行使。上述事实，有被诉决定、本专利授权公告文本、证据1、证据2、证据4、原告诉讼阶段提交的相关证据及庭审笔录在案佐证。本院认为：原告有关权利要求1具备创造性的理由为，本领域技术人员不会想到将证据4中的阻断剂PNA寡聚体替换为寡核苷酸。具体理由为，从其在诉讼中提交的证据可以看出PNA寡聚体适用于寡核苷酸不能应用的情形，而证据4属于寡核苷酸不能应用的情形，故证据4中的PNA寡聚体不能采用寡核苷酸进行替代。但因证据4并未记载其不能使用寡核苷酸，原告也未能对此进行合理解释，故其上述主张不能成立，本院不予支持。同时，本专利的说明书中记载，“特别优选的是额外的寡核苷酸或PNA寡聚体在背景DNA上的结合位点与引物的结合位点重叠，且额外的寡核苷酸阻碍了至少一种引物寡核苷酸与背景DNA的结合”（参见本专利说明书第8页第7、8段）。由此可见，本专利也将寡核苷酸和PNA寡聚体作为并列的优选技术方案，在原告并未指出本专利使用寡核苷酸替代PNA寡聚体克服了现有技术偏见的情况下，显然其有关寡核苷酸不能替代PNA寡聚体的主张不能成立，本院不予支持。此外，虽然PNA寡聚体的亲和性好于寡核苷酸，但这一情形只能说明采用PNA寡聚体的效果好于寡核苷酸，但并不能说明不能采用寡核苷酸代替PNA寡聚体。由证据2的记载可知，相对于寡核苷酸，PNA寡聚体成本更高，可见，对于本领域技术人员而言，其会基于对成本及效果的客观需求选择具体的阻断剂，即在成本有限的情况下选择效果相对较差的寡核苷酸。因此，原告有关PNA寡聚体的亲和性好于寡核苷酸，从而使得本领域技术人员不会想到采用寡核苷酸替换PNA寡聚体的主张不能成立。在此基础上，本院认为，本领域技术人员均知晓寡核苷酸与PNA寡聚体一样，都是通过与背景DNA模板的结合，使引物不能进行正常的PCR延伸来扩增背景DNA，因此，本领域技术人员有动机使用寡核苷酸替代PNA寡聚体。综上，原告有关权利要求1具备创造性的理由均不能成立，相应地，对其有关权利要求1具备创造性的主张本院不予支持。被诉决定中有关权利要求1不具备创造性的认定并无不当，本院予以维持。对于其他权利要求是否具备创造性，本院认同被诉决定中的认定，此处不再重复。原告有关其他权利要求亦具备创造性的主张不能成立，本院不予支持。综上，原告的诉讼请求缺乏事实和法律依据，本院不予支持。依照《中华人民共和国行政诉讼法》第六十九条之规定，本院判决如下：驳回原告EPI基因组股份公司的诉讼请求。案件受理费人民币一百元，由原告EPI基因组股份公司负担（已交纳）。如不服本判决，原告EPI基因组股份公司可于本判决书送达之日起三十日内，被告中华人民共和国国家知识产权局、第三人江苏为真生物医药技术股份有限公司可于本判决书送达之日起十五日内，向本院提交上诉状，并按对方当事人人数提交副本，同时交纳上诉案件受理费人民币一百元，上诉于中华人民共和国最高人民法院。审 判 长  芮松艳人民陪审员  吴 东人民陪审员  梁继英二〇二〇年十月二十六日法官 助理  段重合技术调查官马秋娟书记员刘海璇