Държавен вестник, бр. 5, 2006 г., стр. 25

Б Р О Й  5
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
С Т Р .  25
Три от епруветките се заразяват чрез добавяне
на 0,2 ml за епруветка от приготвените тъканни
проби, като е препоръчително заразяване да се
извърши и с десетократни и стократни разрежда-
ния на пробите—от особена важност, когато те-
ренният материал е доставен при лоши условия.
Залагат се положителни и отрицателни контроли
чрез заразяване съответно с хемадсорбиращ вирус
и без заразяване за разкриване на възможна не-
специфична хемадсорбция.
След 3 дни във всяка една от епруветките се
добавя по 0,2 ml прясно приготвена 1 %-на суспен-
зия от еритроцити в буферен разтвор.
В продължение на следващите 7—10 дни култу-
рите се наблюдават ежедневно под микроскоп за
наличие на цитопатичен ефект (ЦПЕ) и на хемад-
сорбция.
Отчитане на резултатите: Хемадсорбцията се
състои в струпване на голямо количество свинс-
ки еритроцити по повърхността на заразените
клетки. Цитопатичният ефект се състои в отсъс-
твие на адхезиращи клетки при отсъствие на хе-
мадсорбция. Вероятните причини за наличието
на ЦПЕ са: цитотоксичен ефект на инокулума,
наличие на вируса на Ауески или наличие на не-
хемадсорбиращ вирус на АЧС, който обаче може
да бъде доказан чрез DIF или чрез PCR. При от-
съствие на изменения или ако резултатите от DIF
и PCR са отрицателни, наложително е ново зара-
зяване на пресни левкоцитни култури със супер-
натантата от старите.
Процедура 2. HT в левкоцитни култури от пе-
риферна кръв на заразени прасета
Процедурата е по-лесна от подготовката и ино-
кулацията на първични свински левкоцитни кул-
тури и дава по-бързи резултати при положителни
случаи. Тя може да се изпълни в лаборатории, които
не са оборудвани за рутинна вирусологична диаг-
ностика: минимални изисквания са наличието на
предметни и покривни стъкла, микроскоп, стерил-
на среда, епруветки и пипети. Кръвта, взета от
подозрителни прасета на терена и от такива, ино-
кулирани в лабораторията, се обработва с хепарин
и левкоцитните култури се събират за директно
наблюдение за хемадсорбция.
Вземат се 20 ml от цяла кръв в спринцовка,
съдържаща 2000 IU хепарин в 2 ml буферен разт-
вор, размесват се и се прехвърлят в стъклена епру-
ветка. Епруветката се поставя вертикално в инку-
батор или във водна баня при 37 градуса С и се
изчаква утаяването на клетките. Седиментацията
се подобрява чрез добавяне на 2 ml разтвор на
Декстран 150 в 0,9 % натриев хлорид. Културите
се инкубират за 6—8 h при 37 °С, след което малки
количества от супернатантата, съдържаща бели
кръвни клетки, заедно с еритроцити се наблюда-
ват под микроскоп върху предметно стъкло за
наличие на хемадсорбция.
1.3. Доказване на антиген на вируса на АЧС
чрез директен имунофлуоресцентен метод (DIF).
DIF се използва за доказване на антиген на АЧС
в тъкани от подозрителни прасета от терена или
на такива, заразени в лабораторията. Допълнител-
но методът може да се използва за доказване на
същия в левкоцитни култури, в които не се е наб-
людавала хемадсорбция, като по този начин се
идентифицират нехемадсорбиращите щамове на
вируса. Чрез DIF се разграничава също цитопа-
тичният ефект, предизвикан от вируса на АЧС и от
други вируси, например вируса на болестта на
Ауески или от този вследствие заразяване с цито-
токсичен инокулум.
Процедура
Изготвят се криостатни срезове, отпечатъчни
препарати от изследваните тъкани или от кле-
тъчния седимент от заразени левкоцитни култу-
ри върху предметни стъкла, изсушават се на въз-
дух и се фиксират с ацетон за 10 min при стайна
температура.
Обработват се с флуоресцеин изотиоцианат
(FITC) конюгиран антивирус АЧС имуноглобулин
в работно разреждане за 1 h при 37 °С във влажна
камера.
Едновременно с това се фиксират и обработ-
ват с конюгат положителни и отрицателни пре-
парати.
След промиване с фосфатно-буферен разтвор и
обработка на препаратите с глицеринов буфер съ-
щите се наблюдават под ултравиолетов светлинен
микроскоп.
Отчитане на резултатите: Положителни за
присъствие на АЧС вирусен антиген са проби, в
които се наблюдава специфична грануларна ци-
топлазматична флуоресценция в паракортикалните
тъкани на лимфоидните органи или във фиксира-
ните макрофаги в другите органи.
1.4. Доказване наличието на вирусна нуклеи-
нова киселина чрез полимеразно-верижна реакция
(PCR).
Чрез PCR-техниката се доказват и идентифи-
цират широк кръг от изолати, принадлежащи към
всички известни генотипове на вируса, включи-
телно нехемадсорбиращи вируси и изолати с нис-
ка вирулентност. Реакцията е подходяща за иден-
тификация на вирусната ДНК в загнили тъкани,
които не са подходящи за вирусна изолация и до-
казване на антиген.
Изследванията за генетично типизиране на
вируса чрез PCR се извършват в Референтната
лаборатория за АЧС на Европейския съюз, Валде-
омос, Мадрид, Испания.
1.5. Биологична проба (инокулация на прасета).
Използва се за разграничаване на АЧС от кла-
сическата чума по свинете (КЧС), които имат не-
различими клинични и патологоанатомични приз-
наци. Заразяват се две групи прасета, животните в
едната от които са били ваксинирани срещу КЧС,
а в другата са неваксинирани. След заразяване в
случай на АЧС умират прасетата и от двете групи,
а в случай на КЧС—само тези от групата с невак-
синирани животни.
2. Доказване на антитела срещу вируса на АЧС
2.1. Ензим-свързан имуносорбентен метод
(ELISA).
Методът е директен и с него може да се доказва
наличието на антитела срещу вируса на АЧС у
прасета, които са били инфектирани с ниско или
средно вирулентни вирусни щамове на АЧС.
Приготвяне на антиген
Антигенът се приготвя от заразени с вируса на
АЧС клетки, в растежната среда на които присъства
свински серум.