Държавен вестник, бр. 18, 2006 г., стр. 50

С Т Р .  50
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
Б Р О Й  18
Способността на серумите да инхибират (въз-
пират, задържат) хемаглутинационната активност
на инфлуенчните вируси се доказва чрез РВХА в
постановки, описани в т. 6. Тя може да се проведе
чрез използване на 4 или 8 хемаглутинационни
единици (ХАЕ) съобразно желанието на Нацио-
налната референтна лаборатория. За положител-
на се счита всяка проба с възпиращ (задържащ)
титър 24 и по-голям в тест с 4 ХАЕ и титър 23 и
повече в тест с 8 ХАЕ.
5. Реакция хемаглутинация (РХА):
Реагенти:
а) Фосфатно-буфериран физиологичен разтвор
с рН 7,0—7,4 (PBS).
б) Кръв за изготвяне на еритроцитна суспен-
зия се взема от минимум 3 кокошки, доказано сво-
бодни за специфични антитела срещу вируса на
инфлуенцата по птиците, за предпочитане от СПФ
стадо.
Кръвта при вземането се смесва с антикоагу-
лант—равно количество разтвор на Алсевер или
4 % натриев цитрат в съотношение 1:5. Червените
кръвни клетки (ЧКК) преди употреба се промиват
с РВS 3-кратно в центрофуга при 300—500 g. Пре-
поръчва се от промитите ЧКК да се изготви 1 %
суспензия в РВS.
в) За антиген в РВХА се използва птичи инфлу-
енчен вирус. Референтната лаборатория към Ев-
ропейския съюз доставя и препоръчва използване
като антигени вируси от субтип Н5 или Н7 с дока-
зана ниска вирулентност.
г) Процедури за изпълнение в микровариант:
—разлива се PBS във всички ямки на микро-
плаката с V-образни дъна в обем 0,025 ml;
—добавя се 0,025 ml вирусна суспензия (т.е.
аланто-амнионова течност от инфектирани КЕ)
само в първата ямка от редицата;
—с микротитрационна пипета се изготвят 2-крат-
но нарастващи разреждания на вирусния антиген—
от 1:2 до 1:4096;
—допълнително се поставя PBS към всяка ямка
от редицата в обем 0,025;
—добавя се във всяка ямка 1 % суспензия от
ЧКК в обем 0,025 ml;
—в няколко (2—5 бр.) ямки се поставя контро-
лът на еритроцитите без вирус;
—следва внимателно разклащане на плаката
за размесване на инградиентите и инкубиране
при 4 °С;
—отчитането на резултатите се извършва след
30—40 min, т.е. когато ЧКК в контролните ямки
са оформени на дъното във вид на точка; при от-
читането плаките се държат в наклонено поло-
жение; еритроцитите в контролните ямки и тези
с отрицателна хемаглутинация “текат”, а ЧКК в
ямките с положителна хемаглутинация оформят
нежна пелена на дъното и раменете на ямките,
без да “текат”;
—хемаглутинационният титър на антигена
представлява най-високото му разреждане, което
аглутинира напълно ЧКК; това разреждане на
вируса съдържа 1 ХАЕ; за по-точно определяне на
хемаглутинационния титър се препоръчват и па-
ралелни тест-редици от вирус със стартови раз-
реждания от 1:3 и 1:5; това се прави с оглед на по-
прецизно изготвяне на работното разреждане на
антигени при използване в РВХА.
6. Реакция възпиране (задръжка, инхибиция) на
хемаглутинацията:
Компоненти:
а) фосфатен буферен физиологичен разтвор
(PBS);
б) вируссъдържаща аланто-амнионова течност,
разтворена с PBS, така че да съдържат 4 или 8 ХАЕ
антиген в 0,025 ml (антиген);
в) суспензия от птичи ЧКК в 1 % суспензия;
г) отрицателен контролен серум;
д) положителен контролен серум.
Процедури за изпълнение в микровариант:
а) разлива се PBS във всяка ямка на микропла-
ката с V-образни дъна в обем 0,025 ml;
б) добавя се 0,025 ml от серума за изследване
само в първа ямка от редицата;
в) с микротитрационна пипета се изготвят двук-
ратно нарастващи разреждания на серума—от 1:2
до 1:4096;
г) добавя се по 0,025 ml от работното разрежда-
не на антигена, съдържащо 4 или 8 ХАЕ/0,025 ml;
д) в няколко ямки на отделна редица се поста-
вят по 2—5 ямки контроли на ЧКК (без вирус и без
серум) и антигенът (без серум);
е) следва внимателно разклащане на плаката
за размесване на инградиентите и инкубиране на
4 °С за минимум 60 min или на стайна температура
(18—25 °С) за минимум 30 min;
ж) добавя се във всяка ямка от редицата, вкл. в
контролите, 1 % еритроцитна суспензия в обем
0,025 ml;
з) следва повторно размесване на инградиен-
тите и поставяне на 4 °С; резултатът се отчита след
30—40 min или когато ЧКК в контролните ямки за
еритроцити са оформени на дъното на ямките във
вид на точка; при отчитане плаките се държат в
наклонено положение; еритроцитите в ямките за
контрол на ЧКК и положителните за специфични
антитела серумни разреждания са утаени под фор-
мата на точка и “текат”, а в контролните ямки за
антигена и отрицателните за антитела серумни раз-
реждания образуват нежна пелена на дъното и
раменете на ямките и не “текат”;
и) възпиращият титър представлява най-висо-
кото разреждане на изследвания серум, което за-
държа напълно хемаглутинационната активност
на антигена в 4 или 8 ХАЕ; препоръчително е да се
направи допълнителна проверка, че използваният
в теста антиген е в точно изискваното количество
(4, респ. 8 ХАЕ);
й) резултатът от изследването ще бъде вали-
ден, при условие че титърът на отрицателния кон-
тролен серум не надхвърля 23 при използване ан-
тиген с 4 ХАЕ или 22—с 8 ХАЕ, а титърът на поло-
жителния контролен серум не се отклонява с пове-
че от едно деление (ямка) в плюс или минус от
предварително известния му титър.
7. Интравенозен патогенен индекс:
а) Тестът ИВПИ се провежда на 10 пилета на
шестседмична възраст, чувствителни към вируса
на инфлуенцата по птиците.