Държавен вестник, бр. 78, 2002 г., стр. 45

Б Р О Й  78
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
С Т Р .  45
Схема за вземане на проби за серологично и
вирусологично изследване от свине по време на
клане и извършване на месопреглед в кланици
Брой животни:
Брой проби:
От 1 до 9 бр. свине
5
От 10 до 29 бр. свине
10
От 30 до 49 бр. свине
25
От 50 до 99 бр. свине
50
От 100 до 200 бр. свине
70
IV. Доказване на вируса
1. Пряк имунофлуоресцентен метод за доказва-
не на антиген.
Методът се прилага за детекция на КЧС-анти-
ген в криосрезове от сливици, далак, бъбреци или
дисталните части на илеума. Органите, събрани
от няколко животни, се събират и транспортират
без консерванти, охладени, но не замразени. Кри-
осрезовете се обработват директно с анти-КЧС-
имуноглобулин, конюгиран с флуоресцеин-изоти-
оцианат (ФИГЦ) и се наблюдават чрез флуорес-
центен микроскоп. Сливиците са най-подходящи-
ят орган, защото първи се инфектират с вируса,
независимо от начина на заразяване. В случаите
на субакутни и хронични форми най-често поло-
жителен е илеумът и е единственият орган, който
дава положителна флуоресцентна реакция.
Процедура:
Във всяка от сериите криосрезове от органи
трябва да се изследват положителни и отрицател-
ни срезове:
—отразяват се кубчета от органите приблизи-
телно с размери 1 Ч 1 Ч 0,5 см и се закрепват с
дестилирана вода към криостатната масичка;
—замразяват се в криобара на криостата;
—срязват се криосрезове с дебелина не повече
от 4 мкм и се залепят върху покривни стъкла с
големина 10 Ч 32 мм;
—криосрезовете се фиксират за 10 мин в хла-
дилна камера в ацетон и се изсушават за 20 мин.
при 37 °С;
—криосрезовете се промиват еднократно с ПБС
за 5 мин;
—КЧС-конюгатът се разрежда в работно раз-
реждане, покрива се криосрезът и се инкубира за
30 мин при 37 °С;
—след промиване с ПБС криосрезовете се об-
работват с Евансово синьо в концентрация 1:20 000
за 10 мин;
—трикратно промиване за по 5 мин с ПБС и
еднократно—с дестилирана вода;
—криосрезовете върху покривните стъкла се
отцеждат върху филтърна хартия, залепят се на
предметно стъкло с глицеринов буфер, след което
се наблюдават на флуоресцентен микроскоп.
Същата процедура се прилага и при използване
на прекия имунофлуоресцентен метод за доказва-
не на вирус в клетъчни култури.
2. Биологична проба.
Биологичната проба се извършва в определена
от НВМС база.
Биологичната проба се провежда върху три пра-
сета на 3—5 месечна възраст, ваксинирани срещу
КЧС, най-малко 30—50 дни преди залагането и върху
три неваксинирани прасета на същата възраст.
Прасетата се инокулират интрамускулно с по 2
мл 1:10 емулсия от далак и лимфни възли на болно
или умряло със съмнение за КЧС прасе.
Опитните прасета се наблюдават в продълже-
ние на 30 дни при ежедневно термометриране и
строга охрана.
При умиране на всичките 6 прасета с клинични
признаци и патологоанатомични изменения за
класическа и африканска чума по свинете диагно-
зата е положителна за африканска чума.
При умиране само на контролните неваксини-
рани прасета диагнозата е положителна за КЧС.
3. ELISA за откриване на гликопротеин ЕRNS/gp
44/48/ на вируса на класическата чума по свинете
Плаките на кита са покрити с моноклонални
антитела срещу гликопротеина Еrns на вируса на
КЧС. В случай на присъствие на този гликопро-
теин в серума или плазмата, или тъканносвързан
Еrns произтича специфично свързване с монокло-
налните антитела от плаката. Несвързаните ком-
поненти се отмиват, добавя се свързан с перокси-
даза (белязан) анти-Еrns-конюгат, който се свърз-
ва с комплекса антиген-антитяло върху плаката.
Несвързаният конюгат се отмива и се добавя хро-
моген. Степента на цветната реакция е право про-
порционална на количеството кликопротеин Еrns
в пробата. Диагностичната стойност на реакцията
се проверява чрез сравняване на оптичната плът-
ност в ямките с пробите и в тези с положителна и
отрицателна контрола. Процедура:
Всички реагенти се темперират.
Разтворите за миене на плаките и разредители-
те на пробите, конюгата и контролите се разреж-
дат съгласно описанието.
Във всеки две ямки след аплицирането на раз-
редител (50 мкл) се накапват пробите (серум, плаз-
ма или органа суспензия 1:10) в количество 150 мкл.
Едновременно с пробите се накапват и по две ямки
с положителна и отрицателна контрола.
Компонентите се смесват чрез внимателно
тръскане на плаката, тя се покрива и се инкубира
60 мин при 37 °С във влажна камера.
Плаката се промива двукратно.
Във всяка ямка се накапва разреден 1:200 ко-
нюгат, 200 мкл и се инкубира за 60 минути при
37 °С във влажна камера.
Плаката се промива двукратно.
Във всички ямки се накапва по 200 мкл хромоген.
Резултатите се отчитат чрез фотометриране
(ридер на “Санофи”), след като разликата между
оптичните плътности на отрицателната и положи-
телната контрола е по-голяма или равна на 0,4. Това
се отчита обикновено след 15 до 40 минути след
апликацията на хромогена. Във всяка от ямките се
накапва по 50 мкл стопиращ реакцията разтвор.
V. Доказване на антитела
1. ELISA за откриване на антитела срещу гли-
копротеин Е 2 (gp 55).
Плаките са покрити с рекомбинантен Е2 гли-
копротеин. В случай на присъствие на антитела в
пробите същите се свързват с антигена и предот-
вратяват свързването му с белязан с пероксидаза
Е2 специфичен конюгат. Несвързаните компонен-
ти се отмиват от плаката. Ако в пробата има спе-
цифични антитела, цветът не се променя след до-
бавянето на хромоген. В случай, че няма антитела,
се наблюдава зелено оцветяване. Степента на цвет-
ната реакция е право пропорционална на присъс-
твието на специфични антитела в пробата. Диаг-
ностичната стойност на теста се определя по оп-
тичната плътност на положителната и отрицател-
ната контрола.
Процедура:
Всички реагенти се темперират.
Концентрираните разтвори за миене на плаки-
те и за разреждане на контролите, пробите и ко-
нюгата се разреждат по описание.