Държавен вестник, бр. 27, 2007 г., стр. 20

С Т Р .  20
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
Б Р О Й  27
а) Съгласно изготвянето на препарати за тест-
ване в 4.1а):
Изгответе серия от удвоени разтвори на анти-
тялото в имунофлуоресцентен буфер. Първото
гнездо трябва да има 1/2 от титъра (T/2), останали-
те 1/4 от титъра (T/4), 1/2 от титъра (T/2), титъра
(T) и двойно на титъра (2T).
б) Съгласно изготвянето на препарати за тест-
ване 4.1б):
Изгответе работен разтвор (WD) на антитяло-
то в имунофлуоресцентен буфер. Работният раз-
твор влияе на специфичността.
Фиг. 1. Изготвяне на препарат за тестване съг-
ласно 4.1а) и 4.3а)
Разтвори от ресуспендирана утайка
1/100
1/1
1/1
1/1
1/1
ђ Разтвори от
ресуспенди-
рана утайка
(T = титър)
T/2
T/4
T/2
T
2T
ђ Удвоени
разтвори от
антисерум/
антитяло
Проба 1
• 1
• 2
• 3
• 4
• 5
Дубликат
на проба 1 • 6
• 7
• 8
• 9
• 10
или
проба 2
Фиг. 2. Изготвяне на препарат за тестване съг-
ласно 4.1б) и 4.3б)
Работни разреждания на антисерум/антитяло
1/1
1/10
1/100
празно
празно
ђ Децимални
р а з р е ж д а -
ния на ресу-
спендирана
утайка
Проба 1
• 1
• 2
• 3
• 4
• 5
Дубликат
на проба 1 • 6
• 7
• 8
• 9
• 10
или
проба 2
4.3.1. Подредете стъклата върху влажна хартия.
Покрийте всяко тестово прозорче напълно с раз-
твор на антитялото. Обемът на антитялото, нана-
сян върху всяко прозорче, трябва да е поне обемът
на прилагания извлек.
Следната процедура трябва да бъде извършва-
на при отсъствие на специфични инструкции от
доставчиците на антитела.
4.3.2. Инкубирайте стъклата върху влажна хар-
тия под похлупак за 30 min на стайна температура
(18 до 25 °C).
4.3.3. Изтръскайте капчиците от всяко стък-
ло и изплакнете внимателно с имунофлуоресцен-
тен буфер (IF). Измийте чрез потапяне за 5 min
в имунофлуоресцентен буфер Tween (Допълне-
ние 3) и след това за 5 min в имунофлуоресцен-
тен буфер. Избягвайте разпръскване или преми-
наване на капчици от едно в друго прозорче, които
могат да причинят кръстосано заразяване. Вни-
мателно премахнете излишната влага чрез неж-
но подсушаване.
4.3.4. Подредете стъклата на влажна хартия.
Покрийте тестовите прозорчета с разтвор на
FITC конюгат, използван, за да се определи ти-
търът. Обемът на конюгата, нанасян върху про-
зорчетата, трябва да е идентичен с обема на на-
насяното антитяло.
4.3.5. Инкубирайте стъклата на влажна хар-
тия под похлупак за 30 min на стайна температу-
ра (18 до 25 °C).
4.3.6. Изтръскайте капчиците конюгат от стък-
лата. Изплакнете и измийте, както преди (4.3.3).
Внимателно отстранете излишната влага.
4.3.7. Пипетирайте 5 до 10 µl от 0,1 M фосфатен
буфер с глицерол (Допълнение 3) или търговски
увеличител против избледняване върху всяко про-
зорче и поставете покривното стъкло.
4.4. Тълкуване на имунофлуоресцентния тест:
4.4.1. Прегледайте тестовите стъкла на епи-
флуоресцентен микроскоп с филтри, подходящи за
възбуждането на багрилото FITC, под водна или
маслена имерсия и при увеличение от 500 до 1000.
Сканирайте прозорчетата напречно на двата диа-
метъра при десните ъгли и по периметъра. За про-
би, показващи липса или малък брой клетки, наб-
людавайте поне 40 микроскопски полета.
Проверете първо стъклото с положителната
контрола. Клетките трябва да са ярко флуоресцент-
ни и напълно обагрени при определения титър на
антитялото или работния разтвор. Имунофлуорес-
центният тест (раздел 4) трябва да бъде повторен,
ако оцветяването е анормално.
4.4.2. Наблюдавайте за ярко флуоресциращи
клетки с характерна за C. m. subsp. sepedonicus мор-
фология в тестовите прозорчета на стъклата (виж
интернет страницата http://forum.europa.eu.int/
Public/irc/sanco/Home/main). Интензитетът на флу-
оресценцията трябва да бъде еквивалентен или по-
добър от щама на положителната контрола при
същия разтвор на антитялото. Клетки с непълно
оцветяване или със слаба флуоресценция трябва да
бъдат игнорирани. Ако се предполага някакво за-
разяване, тестът трябва да бъде повторен. Това може
да бъде случай, при който всички стъкла от една
серия показват положителни клетки поради замър-
сяване на буфера или ако положителните клетки се
откриват (извън прозорчето на препарата) по пок-
ривния слой на предметното стъкло.
4.4.3. Има няколко проблема, присъщи на спе-
цифичността на имунофлуоресцентния тест. Въз-
можно е съпътстващи популации от флуоресцира-
щи клетки с атипична морфология и кръстосани
реакции със сапрофитни бактерии, чийто размер и
морфология са подобни на C. m. sepedonicus, да се
намерят в утайките от конуси и части от стъбла.
4.4.4. Отчитайте само флуоресциращи клетки с
характерен размер и морфология при титъра или
работния разтвор на антителата като в 4.3.
4.4.5. Тълкуване на резултатите от имунофлуо-
ресценцията:
а) Ако се открият ярко флуоресциращи клетки
с характерна морфология , пресметнете средния
брой типични клетки на микроскопско поле и из-
числете броя на типични клетки на ml от ресуспен-
дираната утайка (Допълнение 4).
Резултатите от имунофлуоресценцията са по-
ложителни за проби с поне 5 Ч 103 типични клетки
на ml от ресуспендираната утайка. Пробата се счи-
та за потенциално заразена и се изисква по-ната-
тъшно тестване.
б) Резултатите от имунофлуоресценцията са от-
рицателни за проби с по-малко от 5 Ч 103 клетки на
ml от ресуспендираната утайка и пробата се счита за
отрицателна. Не се изисква по-нататъшно тестване.