Държавен вестник, бр. 18, 2006 г., стр. 49

Б Р О Й  18
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
С Т Р .  49
ни 5-кратно за останалите тъкани и трахеални
смивки. Хламидиите се обезвреждат чрез добавка
на 50 mg/mol окситетрациклин. Киселинността (рН)
на средата след прибавяне на антибиотици се ко-
ригира до 7,0—7,4.
4. Изолиране на вируса:
Изолирането на вируса се извършва в осем—
десетдневни кокоши ембриона (КЕ), като обрабо-
тената суспензия (супернатанта) се инокулира
алантоисно в обем 0,1—0,2 ml/КЕ. За всяка проба
се използват минимум 4 КЕ. Предпочитат се КЕ
от стада, свободни от патогенна флора (СПФ). При
липса на такива се използват КЕ от стада, които
не показват наличие на антитела срещу вируса на
инфлуенцата. Инокулираните ембриони се инку-
бират на 37 °С и се овоскопират ежедневно. Умре-
лите и умиращи КЕ и всички останали живи след
6-ия ден на инкубацията се убиват чрез охлаждане
на 4 °С. Аланто-амнионовите течности се изслед-
ват за хемаглутинационна активност (ХА). Ако не
се установи хемаглутинация, описаната процедура
се повтаря, като за инокулум се използва неразре-
дена аланто-амнионова течност от предходния
пасаж. При положителна хемаглутинация трябва
да се изключи присъствието в културата на хема-
глутиниращи бактерии. При наличие на бактерии
течността се пропуска през филтърна мембрана с
размер на порите 450 nm, след което към нея се
добавят антибиотици и с нея се инокулират ембри-
оните по начин, посочен по-горе.
II. Методи, прилагани при диференциална ди-
агноза
1. Предварително лабораторно диференциране:
Поради важността на мерките за ограничава-
не разпространението на вируса на инфлуенцата
по птиците (ИП) е необходимо да бъде определе-
на и оборудвана национална референтна лабора-
тория, в която могат да се идентифицират хема-
глутиниращи вирусни изолати на ИП от субтип
Н5 или Н7, както и на вируса на нюкасълската
болест по птиците.
За идентифициране на хемаглутинина се про-
вежда реакция възпиране на хемаглутинацията
(РВХА). Използват се събраните хемаглутинаци-
онни течности и стандартни положителни и отри-
цателни серуми съгласно т. 5 и 6.
Основанията за налагане на ограничителни
мерки на терена са положителните за инфлуенца
титри 24 и повече срещу субтиповете Н5 и Н7.
Теренните изолати обикновено показват титри 29
и повече.
2. Потвърждаване на предварителната дифе-
ренциална диагноза:
Тъй като досега са идентифицирани 13 субтипа
на основата на хемаглутинина (от Н1 до Н15) и 9
субтипа на основата на антиген неураминитоза (от
N1 до N9), както и на различни комбинации между
тях, не е практично и финансово изгодно нацио-
налните лаборатории да разполагат с всички суб-
типове антисеруми, които позволяват да се извър-
ши пълно антигенно характеризиране на изолира-
ните инфлуенчни вируси.
3. Националната референтна лаборатория след-
ва да извърши следното:
а) потвърждаване на диагнозата чрез използ-
ване на двойно дифузионната реакция преципита-
ция в агаров гел (РПАГ), с която се разкрива об-
щият за всички инфлуенчни вируси групов анти-
ген, описан в т. 9; със същата цел могат да бъдат
използвани и тестовете ЕЛАЙЗА и имунофлуорес-
центният метод (ИФМ);
б) да потвърди или отхвърли, че изолатът е от
субтип Н5 и Н7;
в) да определи интравенозния патогенен индекс
(ИВПИ) в шестседмични пилета съобразно описа-
нието в т. 7; интравенозен патогенен индекс
(ИВПИ), по-висок от 1,2, е показател за налагане
на ограничителни мерки срещу установения изо-
лат на инфлуенчния вирус; със същата цел може да
се използва тестът за плакообразуване в моно-
слойни клетъчни култури (КК) от ембрионални
пилешки фибробласти (ЕПФ);
г) Националната референтна лаборатория след-
ва незабавно да изпраща до одобрената лаборато-
рия на Европейската общност всички хемаглути-
ниращи вируси за по-нататъшно антигенно изуча-
ване; в задълженията на одобрената лаборатория
на Европейската общност е провеждането на пъл-
но антигенно типизиране, което се извършва за
всички получени инфлуенца вируси; за всички Н5
и Н7 субтипове, които не са имали интравенозен
патогенен индекс, по-голям от 1.2, е нужно допъл-
нително секвениране на хемаглутининовия ген, за
да се определи наличието или отсъствието на пов-
тарящи се аминокиселинни бази на мястото на
разцепване на хемаглутиновия протеин.
4. Серологични тестове за разкриване на специ-
фични антитела срещу вируса на инфлуенцата по
птиците:
а) При провеждане на програми за ерадикация
(изкореняване) на огнищата на инфлуенцата, за
които хемаглутининовият субтип на вирусния при-
чинител е установен, той може да бъде използван
като антиген в РВХА съобразно т. 5 и 6. Със съ-
щата цел за антиген може да бъде използван и
всеки друг инфлуенчен вирус от същия (хомоло-
жен) субтип.
В случаите, когато субтипът на вируса—при-
чинител на инфлуенцата, не е известен, диагноза-
та може да бъде потвърдена чрез разкриване на
специфични антитела в серуми от засегнати пти-
ци чрез тестовете за доказване на групово специ-
фичните антигени—РПАГ, ЕЛАЙЗА, ИФМ. При
провеждане на ЕЛАЙЗА е възможно да възникне
проблем в специфичността є във връзка с госто-
приемниковите (като вид птици) имуноглобули-
нови субстанции.
б) Проби.
Кръвни проби за лабораторно изследване се
вземат от подкрилната вена, както следва: от всич-
ки птици на стада до 20 бр.; по 20 проби от по-
големите по размер стада (това гарантира откри-
ване поне на една положителна проба с вероят-
ност 99 %; при заразеност на 25 % от птиците в
стадата този брой проби е достатъчен за сигурно
откриване на инфекцията независимо от големи-
ната им). След съсирване (коагулация) на кръвта
в пробите серумите се декаптират и съхраняват на
4 °С за изследване до 4 дни.
в) Изследване за наличие на специфични ан-
титела.