Държавен вестник, бр. 62, 2002 г., стр. 58

С Т Р .  58
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
Б Р О Й  62
2. 15 ml от серум от левкоза по говедата, съдържащ
антитяло само към гликопротеини на вируса на левко-
зата по говедата, разреден в съотношение 1:10 в 0,05 М
Tris/HCl буфер, рН 7,2 с 8,5 % NaCl;
3. 15 ml от серум от левкоза по говедата, съдържащ
антитяло само към гликопротеини на вируса на левко-
зата по говедата, разреден в съотношение 1:5 в 0,05 М
Tris/HCl буфер, рН 7,2 с 8,5 % NaCl;
4. 4 пластмасови петриеви панички с диаметър от
85 мм;
5. пробивно острие с диаметър между 4 и 6 мм;
6. референтен антиген;
7. антиген, който да бъде стандартизиран;
8. водна баня (56 °С).
Процедура
Разтваря се агарозата (1,6 %) в Tris/HCl буфера, като
внимателно се загрява до 100 °С. Поставя се във WC
водна баня за около 1 час. Разтворите на серума на
левкозата по говедата също трябва да се поставят във
WC водна баня.
Разбърква се 15 ml от загретия на 56 °С агарозен
разтвор с 15 ml серум от левкоза по говедата (1:10),
бързо да се тръскат и изливат в обем от по 15 ml във
всяка една от двете петриеви панички. Същата проце-
дура трябва да се повтори и със серума от левкоза по
говедата, разреден в съотношение 1:5.
Когато агарозата се е втвърдила, в нея се правят
дупки, както следва:
Добавяне на антиген
1. Петриеви панички 1 и 3:
а) ямка “А”—неразреден референтен антиген;
б) ямка “Б”—разреден в съотношение 1:2 референ-
тен антиген;
в) ямки “В” и “Д”—референтен антиген;
г) ямка “Г”—неразреден тестови антиген.
2. Петриеви панички 2 и 4:
а) ямка “А”—неразреден тестови антиген;
б) ямка “Б”—разреден в съотношение 1:2 тестови
антиген;
в) ямка “В”—разреден в съотношение 1:4 тестови
антиген;
г) ямка “Г”—разреден в съотношение 1:8 тестови
антиген.
Допълнителни инструкции
1. За да може да се получи оптимално утаяване, екс-
периментът трябва да се осъществи с два серумни раз-
твора (разредени в съотношение 1:5 и 1:10).
2. Ако диаметърът на утаяване е прекалено малък
и при двата разтвора, серумът се нуждае от по-ната-
тъшно разреждане.
3. Ако диаметърът на утаяване е прекалено голям и
неясно очертан и при двата разтвора, трябва да се избе-
ре серум с по-ниска степен на разреждане.
4. Крайната концентрация на агарозата трябва да
бъде 0,8 %, а тази на серумите—съответно 5 % и 10 %.
5. Сравнете измерените диаметри в координатната
система. Работният титър на тествания антиген пред-
ставлява разреждането му, при което се получава диа-
метър, равен с този, получен с референтния антиген.
В. Ензимосвързан имуносорбентен аналитичен тест
(ЕЛАЙЗА) за откриване на ЕЛГ
1. Материалите и реагентите, които се използват,
са следните:
(а) твърдофазни микроплаки, кювети или които и
да са други в твърдо състояние (фаза);
(б) антигенът е фиксиран към твърдата фаза със или
без помощта на поликлонални или моноклонални захва-
щащи антитела; ако антигенът е обвит директно върху
твърдата фаза, за случая на ЕЛГ всички тестови проби,
даващи положителни реакции, трябва да бъдат повтор-
но тествани спрямо контролен антиген; контролният
антиген трябва да е идентичен на антигена, освен в слу-
чаите на антигени на ЕЛГ; ако захващащите антитела са
обвити към твърдата фаза, антителата не трябва да ре-
агират на антигени, различни от тези на ЕЛГ;
(в) биологична течност, която трябва да бъде
тествана;
(г) съответстващ положителен и отрицателен
контрол;
(д) конюнгат;
(е) субстрат (основен пласт), адаптиран към използ-
вания ензим;
(ж) стопиращ разтвор, ако е нужно;
(з) разтвори за разреждане на тестови проби за пре-
парати на реагентите и за измиване;
(и) система за отчитане (измерване), подходяща за
използвания субстрат.
2. Стандартизиране и чувствителност на теста
Чувствителността на ЕЛАЙЗА теста трябва да е от
такъв порядък, че да може да отчете положителен ре-
зултат от серум Е4, когато той е разреден 10 пъти (се-
румни проби) или 250 пъти (млечни проби) повече от
разредения разтвор, получен от отделните проби, ако
те са включени в групи. При аналитичните методи, из-
ползвани върху проби (серумни и млечни), които се
изследват поотделно, разреденият в съотношение 1:10
Е4 серум (при отрицателен серум) или в съотношение
1:250 (при отрицателно мляко) трябва да отчете отри-
цателен резултат, когато е тестван при същата степен
на разреденост на анализирания разтвор, като тази, из-
ползвана за индивидуалните тестови проби. Посочени-
те в списъка от раздел А.2 официални институти трябва
да се разглеждат като отговарящи за проверка на ка-
чеството на ЕЛАЙЗА метода, а в частност и за опреде-
лянето (за всяка производствена партида) на броя на
пробите, които следва да се обединят в обща група въз
основа на изброената стойност, получена за Е4 серума.
Серумът Е4 следва да се достави от Националната
ветеринарна лаборатория в Копенхаген.
3. Условия за използване на ЕЛАЙЗА тест за от-
криване на ЕЛГ
Методът ЕЛАЙЗА може да бъде използван на про-
ба от мляко или суроватка от млякото, взето от ферма,
в която най-малко 30 % от млечните крави са в млечен
период.
Ако се използва този метод, трябва да се вземат
мерки да се гарантира, че взетите проби могат да бъдат
идентифицирани към животните, от които са взети
млякото или серумите, обект на проверка.
37777
НЕОФИЦИАЛЕН РАЗДЕЛ