Държавен вестник, бр. 28, 2007 г., стр. 42

С Т Р .  42
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
Б Р О Й  28
4.2.1. За обогатяване чрез PCR 100 µl от екс-
тракта на пробата се прехвърлят в 10 ml хранител-
на среда за обогатяване (виж Допълнение 2), пред-
варително разпределена в епруветки и колби без
наличие на ДНК. За обогатяване чрез ELISA тест
могат да се използват по-високи съотношения на
екстракта към хранителната среда (например 100 µl
в 1,0 ml хранителна среда за обогатяване).
4.2.2. Културите се инкубират за 72 часа при
температура от 27 до 30 °С на клатачка или в ста-
тично положение, като капачките не са плътно
затворени, за да има възможност за аерация.
4.2.3. Разбърква се добре преди ЕLISA или PCR
тестовете.
4.2.4. Обогатената хранителна среда се третира
по същия начин както пробата/пробите в тестове-
те по-горе.
Забележка. Ако се очаква инхибиране на обога-
тяването на R. solanacearum поради високи попу-
лации на някои конкурентни сапрофитни бакте-
рии, обогатяването на екстрактите от пробите с
центрофугиране или други форми на концентра-
ция може да дадат по-добри резултати.
5. IF тест
Принцип
Използването на IF теста като основен скринин-
гов тест е препоръчително поради доказаната му
сила при постигане на задължителните прагове.
Когато IF тестът е използван като основен скри-
нингов тест и отчитането по него е положително,
като втори скринингов тест трябва да се направи
теста за изолация, PCR тест или FISH тест. Когато
IF тестът е използван като втори скринингов тест
и отчитането по него е положително, за завършва-
не на анализа е необходимо допълнително тества-
не в зависимост от схемата.
Забележка. Използват се валидирани антитела
на R. solanacearum (виж интернет страница http://
forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Пре-
поръчва се за всяка нова партида антитела да се
определи титърът. Титър е най-високото разрежда-
не, при което се осъществява оптимална реакция при
изпитването на суспензия, съдържаща 105 до 106
клетки на ml от хомоложния щам на R. solanacearum,
като се използва подходящо конюгат с флуоресцеин
изотиоцианат (FITC) в съответствие с указанията
на производителя. Всички валидирани поликлонал-
ни антисеруми са имали IF титър поне 1:2000. По
време на тестването антителата трябва да се изпол-
зват при работно разреждане/ работни разреждания,
близки до или равни на титъра.
Тестването трябва да се извърши с прясно при-
готвени екстракти от проби. При необходимост то
може успешно да се извърши с проби, съхранявани
при температура от -68 до -86 °С в глицерин. Гли-
церинът може да се отстрани от пробата чрез до-
бавяне на 1 ml буфер за разреждане на утайката
(Допълнение 4), повторно центрофугиране за
15 минути при 7000 g и повторно суспендиране в
равно количество буфер за разреждане на утайка-
та. Това не се налага често, особено ако пробите са
фиксирани към предметните стъкла на пламък.
Подготвят се отделни предметни стъкла с по-
ложителни контроли на хомоложния щам или на
друг референтен щам на R. solanacearum и суспен-
дирани в картофен екстракт, определен в Допъл-
нение 3Б, и по избор—в буфер.
При възможност трябва да се използва естест-
вено заразена тъкан (запазена чрез лиофилизация
или замразяване при температура от -16 до -24 °С),
като контролата се накапе върху предметните
стъкла за IF.
Като отрицателни контроли могат да се изпол-
зват екстракти от проби, които при предходно тест-
ване са дали отрицателни резултати за R.
solanacearum.
Стандартизираните положителни и отрицател-
ни контроли, които могат да се използват с този
тест, са изброени в Допълнение 3.
Използват се многогнездни предметни микро-
скопски стъкла, като се предпочитат тези с 10 кла-
денчета и с диаметър 6 mm за всяко кладенче.
Контролният материал се тества по същия на-
чин както пробата/пробите.
5.1. Приготвяне на предметни стъкла, като се
използва една от следните процедури:
а) За утайки със сравнително малко съдържа-
ние на скорбяла:
С пипета се отмерва стандартно количество (15 µl
е подходящо за кладенче с диаметър 6 mm—в мащаб
се изчисляват количествата за по-големите прозор-
ци) с разреждане 1/100 от ресуспендираната карто-
фена утайка върху първия прозорец. След това се
отмерва с пипета сходно количество неразредена
пелета (1/1) върху останалите прозорци в реда. Вто-
рият ред може да се използва като дублиращ или за
втора проба, както е показано на фиг. 1.
б) За други утайки:
Приготвят се десетични разреждания (1/10,
1/100) на ресуспендираната утайка в буфер за раз-
тваряне на утайката. С пипета се отмерва изме-
рено стандартно количество (15 ml е подходящо
за кладенче с диаметър 6 mm—в мащаб се изчис-
ляват количествата за по-големите кладенчета)
от ресуспендираната утайка и всяко разреждане
върху реда от кладенчета. Вторият ред може да
се използва като дублиращ или за втора проба,
както е показано на фиг. 2.
5.2. Капките се изсушават на стайна темпера-
тура или чрез затопляне до температури от 40 до
45 °С. Бактериалните клетки се фиксират върху
предметното стъкло чрез загряване (15 минути при
60 °С) с помощта на пламък, с 95 % етанол или в
съответствие с конкретните указания на достав-
чиците на антителата.
При необходимост фиксираните предметни
стъкла могат да се съхраняват в замразено състо-
яние в сухи кутии за необходимото време (не пове-
че от три месеца), преди да бъдат подложени на
ново тестване.
5.3. IF процедура
а) В съответствие с метода за приготвяне на
стъклата, описан в 5.1а):
Приготвя се серия разреждания от двe части.
В първото гнездо се поставя 1/2 от титъра (Т/2), а
в другите—1/4 от титъра (Т/4), 1/2 от титъра (Т/2),
титъра (Т) и два пъти титъра (2Т).
б) В съответствие с метода за подготвяне на
стъклата за теста, описан в 5.1б):
Приготвя се работното разреждане (WD) на
антитялото в IF буфер. Работното разреждане е
разреждането на антисерума, позволяващо опти-
мална специфичност, и обикновено е на половина-
та на титъра.