Държавен вестник, бр. 109, 2002 г., стр. 66

С Т Р .  66
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
Б Р О Й  109
3.7. разтвор на двунатриев хидрогенен фос-
фат, с=0.025 mol/l—3,55 g безводен двунатриев
хидрогенен фосфат (или 4,45 g дихидрат или 8,95
g от додекахидрат) се разтварят във вода (HPLC
степен) в 1000-милиметрова колба. Допълва се
до определената черта и се разбърква;
3.8. HPLC подвижна/мобилна фаза—смесват
се следните реактиви:
650 ml ацетонитрил (3.3),
250 ml вода (HPLC степен),
50 ml разтвор на калиев дихидрогенен фос-
фат (3.6),
50 ml разтвор на двунатриев хидрогенен фос-
фат (3.7).
През 0,22 µm филтър се прецежда (4.6) и се
дегазира разтворът (напр. чрез утрасонифика-
ция за 10 min);
3.9. стандартна субстанция—чист robenidine
—1.3-bis[(4-chlorobenzylidene)amino] guanidine
hydrochloride, E 750;
3.9.1. изходен стандартен разтвор на robenidine
—300µµg/ml—отмерват се 30 g от стандартния ро-
бенидинов разтвор (3.9) до най-близките 0,1 mg
на колбата. Разтваря се в кисел метанол (3.2) в
100 ml градуирана колба. Допълва се до опреде-
лената черта със същия разтворител и се разбър-
ква. Колбата се увива в алуминиево фолио и се
поставя на тъмно място;
3.9.2. междинен стандартен разтвор на
robenidine—12µµg/ml—10,0 ml от изходния стан-
дартен разтвор се слагат (3.9.1) в 250 ml граду-
ирана колба. Допълва се до количеството, не-
обходимо за подвижната фаза, и се разбърква.
Колбата се увива с алуминиево фолио и се съх-
ранява на тъмно място;
3.9.3. калибрацинни разтвори—5, 10, 15 и 20
ml от междиния стандартен разтвор се прехвър-
лят (3.9.2) в няколко 50 ml калибрирани колби.
Допълват се до количеството, необходимо за
подвижната фаза (3.8) и се разбъркват. Разтво-
рите отговарят съответно на 1,2; 2,4; 3,6; 4,8 и
6,0 µg/ml робенидин. Разтворите се приготвят
непосредствено преди употреба.
4. Апаратура
4.1. стъклена колона—направена е от тъмно
кехлибарено стъкло, снабдено със запорен кран.
Резервоарът е приблизително с обем 150 ml,
вътрешен диаметър от 10 до 15 mm и дължина
250 mm;
4.2. лабораторен механичен шейкър;
4.3. вакуумен ротационен изпарител на филма;
4.4. HPLC апарат с утравиолетов детектор с
променлива дължина на вълните или диодно-кле-
тъчен детектор, който работи в обхват 250 —
400 mm;
4.4.1.течна хроматографска колона—300 mm
Ч 4 mm, С18, 10 µm опаковка или еквивалент;
4.5. филтрова хартия със стъклени нишки
(Whatman GF/A или еквивалент);
4.6. мембранни филтри, 0,22 µm;
4.7. мембранни филтри, 0,45 µm.
5. Процедура
Забележка. Робенидинът е чувствителен към светли-
на. Да се използват тъмнокехлибарени стъкленици във
всички операции.
5.1. Общи положения
5.1.1. Анализира се празна проба с цел да се
провери наличието на робенидин или интерфе-
риращи вещества.
5.1.2. Провежда се възстановителен тест, като
се анализира празната проба (5.1.1), която е била
усилена от допълнително количество робени-
дин, сходно с това в пробата. Пробата може да
бъде усилена до ниво 60 mg/kg, като се прехвър-
лят 3,0 ml от изходния стандартен разтвор в
отделна 250 ml конична колба. Разтворът се
изпарява до 0,5 ml под азотна струя. Прибавят
се 15 g от празната проба, смесва се добре и се
изчаква 10 min, преди да се продължи с етапа на
екстракция.
Забележка. За целите на метода празната фуражна
проба трябва да бъде сходна по вид с образеца и при
анализ не трябва да се открие наличието на робенидин
в нея.
5.2. Екстракция
Отмерват се приблизително 15 g от пригот-
вения образец до най-близките 0,01 g. Прехвър-
лят се в 250 ml колба и се добавят 100 ml кисел
метанол (3.2), съдът се запушва добре и се бър-
ка в шейкър в продължение на 1 h (4.2). Разтво-
рът се прецежда през филтрова хартия със стък-
лени нишки (4.5) и целият филтрат се събира в
150 ml конична колба. Прибавят се 7,5 g от
молекулярно сито (3.4), съдът се запушва добре
и се разбива в продължение на 5 min. Незабавно
се прецежда през филтрова хартия със стъкле-
ни нишки. Разтворът се запазва за етапа на
пурификация (5.3).
5.3. Пурификация
5.3.1. Подготовка на колоната с алуминиев
окис
Долният край на стъклената колона се за-
пушва (4.1) с тапа от стъклен памук и се уплът-
нява, като тапата се набутва навътре с помощта
на стъклена пръчка. Отмерват се 11 g от при-
готвения алуминиев окис (3.5) и се прехвърлят
в колоната. По време на опита влиянието на
околната среда трябва да се сведе до минимум.
Колоната се почуква леко в долния є край, за да
се избистри окисът.
5.3.2. Пурификация на пробата/образеца
Прехвърлят се 5 ml от пробния екстрат, при-
готвен в (5.2), в колоната с помощта на пипета.
Краят на пипетата се поставя близо до колон-
ната стена и се оставя разтворът да се абсорби-
ра от алуминиевия окис. Робенидинът от коло-
ната се елюира, като се използват 100 ml мета-
нол (3.1) при скорост на изтичане 2 до 3 ml/min.
Елюираната субстанция се поставя в 250 ml
колба с кръгло дъно. Метаноловият разтвор се
подлага на изпаряване до изсъхване при нама-
лено налягане от 40 °С във вакуумен ротацио-
нен филмов изпарител (4.3). Утайката се разт-
варя отново в 3 до 4 ml субстанция от подвиж-
ната фаза (3.8) и се прехвърля в 10 ml колба.