Държавен вестник, бр. 18, 2006 г., стр. 51

Б Р О Й  18
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
С Т Р .  51
б) Пилетата се инокулират интравенозно с ви-
руссъдържаща алакто-аруниконова течност от
нисък пасаж, от разреждане 10-1 в доза 0,1 ml. За
разредител се използва стерилен буфериран физи-
ологичен разтвор (РВS).
в) За контрола се използват 10 пилета от съща-
та партида, инокулирани по същия начин, и доза
от разредителя, без вирус.
г) Опитните и контролните пилета ежедневно
се наблюдават в продължение на 10 дни и резулта-
тите се регистрират през 24 h.
д) Резултатите от наблюденията се групират по
тежест в 4 групи: нормални—без никакви клинич-
ни признаци, оценявани с фактор нула; болни—с
фактор 1; тежко болни*—с фактор 2, и умрели—с
фактор 3.
е) От отчетените резултати се изчислява ИВПИ,
както е показано в таблицата:
Клинични
Дни след инокулацията
Общо
признаци
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
резултат
Нормални
10 2
0
0
0
0
0
0
0
0
12 Ч 0 = 0
Болни
0
4
2
0
0
0
0
0
0
0
6 Ч 1 = 6
Тежко
0
2
2
2
0
0
0
0
0
0
6 Ч 2 = 12
болни
Умрели
0
2
6
8
10 10
10 10 10 10 76 Ч 3 = 228
общо: 246
Наблюде-
10 10 10 10 10 10
10 10 10 10
100
ния (бр.)
Общо
246
ИВПИ = ––––––––––– = –––– = 2,46
Наблюдения (бр.)
100
* За тежко болно се счита всяко опитно пиле, което
показва повече от един от следните клинични приз-
наци: респираторни усложнения, депресия, диария,
цианоза на оголените части от кожата и обиците, оток
на главата, нервни признаци.
8. Проучване за плакообразуваща способност:
а) От вируссъдържащата аланто-амнионова
течност се изготвят в РВS 10-кратни нарастващи
разреждания—10-1 до 10-7. Най-добре е да се използ-
ват такива разреждания на вируса, които осигуря-
ват оптимален брой плаки в петрите с възможност
за тяхното изброяване.
б) Изготвят се първични монослойни КК от
ЕПФ или подходяща постоянна клетъчна линия
(напр. Madin-Darby bovine kidney) в петриеви па-
нички с размер 5 cm в диаметър.
в) От всяко вирусно разреждане се прибавя в
две петриеви панички по 0,2 ml инокулум. Петри-
тата се оставят за абсорбция на вируса на стайна
температура за 30 min.
г) Следва трикратно промиване с РВS на кле-
тъчната повърхност и третираният клетъчен мо-
нослой се покрива с 5 ml 1 % w/v разтопен агар,
несъдържащ, респ. съдържащ 0,01 mg трипсин за
1 ml среда. Покриващата агарова среда не следва
да съдържа никакъв серум.
д) Следва инкубация на петритата с култура на
37 °С за 72 h, когато образуваните плаки са доста-
тъчно големи по размер и могат да бъдат изброя-
вани с невъоръжено око. Инкубацията се провеж-
да в среда с 5 % СО2.
Плаките се виждат най-добре, когато моносло-
ят бъде оцветен. За целта покриващият слой ага-
рова среда от всяка петра внимателно се отстраня-
ва, а останалият прикрепен към дъното клетъчен
монослой оцветява с кристал виолет—0,5 % w/v в
25 % V/V етанол.
е) Всички вируси на инфлуенцата по птиците
образуват плаки в посочените КК, които съдър-
жат трипсин. Плаки в отсъствие на трипсин обра-
зуват само вирулентни за птици вирусни изолати
на инфлуенцата.
9. Двойнодифузионен агар-гел преципитацио-
нен тест:
Имунодифузионният агар-гел преципитационен
тест е най-предпочитан за доказване присъствие
на нуклеокапсидния (NР) и метричен (М) антиген,
които са общи (групови) за всички субтипове на
вируса на инфлуенцата по птиците. Това се пости-
га чрез използване като антиген на концентриран
вирус или на суспензия от инфектирани хормо-
алантоисни мембрани (ХАМ).
Вируссъдържащите аланто-амниалови течнос-
ти се центрофугират при висока скорост на върте-
не, при което вирусните антигени от вътрешност-
та на капсида и на матрикса се освобождават и
допълнително третират с натриев lauroyl sacrogine.
Със същата цел може да бъде използван и кисел
преципитат, т.е. получен чрез третиране на алан-
то-амнионовите течности с 1 N солна киселина при
крайно рН 3,5—4,0, охлаждане за 1 h до 0 °С и цен-
трофугиране при ниска скорост—1000 g за 10 min.
Следва отстраняване на супернатантата, а ви-
руссъдържащият преципитат се ресуспендира в
минимален обем на glycine-Sarcosyl буфер (1 %
Sodium lauroyl sacrosinate буфериран до рН 9,0 с
0,5 М glycine). Така изготвеният препарат съдър-
жа както нуклеокапсидния (NP), така и матрикс-
ния (М) антиген.
Beard (1970) описва изготвянето на обогатен
нуклеокапсиден антиген от ХАМ на инфектира-
ни с вируса на инфлуенцата КЕ. Хориолактопсните
мембрани след отпрепариране от инфектираните
КЕ се хомогенизират в хаван с пестик или хомо-
генизатор, след което 3-кратно се замразяват и
размразяват. Следва нискооборотно центрофуги-
ране—на 1000 g за 10 min. За антиген в теста се
използва супернатантата, инактивирана с 0,1 %
формалин.
Антигените, изготвени по описаните два мето-
да, могат успешно да бъдат използвани в рутинния
двойнодифузионен агар-гел преципитационен тест.
Средата за този тест се изготвя от 1 % агароза
при агар плюс 8,0 % натриев хлорид в 0,1 М фосфа-
тен буфер, рН 7,2.
Тестът се провежда в петри или предметни
стъкла, поставени в херметизирана стъклена вана,
съдържаща достатъчно влага (напоена с вода фил-
търна хартия).
При положителен резултат ще се наблюдават
специфични преципитационни линии между анти-
гена и известния (познат) положителен серум сре-
щу вируса на инфлуенцата по птиците. Резултатът
се отчита между 18 и 72 h при наблюдение над
светлинен лъч под ъгъл 45°.