Държавен вестник, бр. 28, 2007 г., стр. 53

Б Р О Й  28
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
С Т Р .  53
SMSA среда и се суспендира в 10 mM фосфатен бу-
фер за получаването на гъстота на клетките при-
близително 2 Ч 108 клетки на ml. Това обикновено
се получава с леко замътнена суспензия, еквива-
лентна на оптична плътност от 0,15 при 600 nm.
Вземат се конусите на 200 клубени от произве-
ден сорт с бяла кора, за който се знае, че не е зара-
зен с R. solanacearum.
Конусчетата се обработват по обичайния на-
чин и утайката се суспендира повторно в 10 ml.
Приготвят се 10 стерилни по 1,5 ml микроепру-
ветки с 900 µl от разтворената утайка.
Прехвърлят се 100 µl от суспензията на
R. solanacearum в първата микроепруветка. Раз-
бърква се на Vortex.
Определят се десетичните нива на зараза чрез
продължаване на разреждането в следващите пет
микроепруветки.
Шестте заразени микроепруветки се използват
като положителни контроли. Четирите незаразе-
ни микроепруветки се използват като отрицател-
ни контроли. Микроепруветките се етикетират.
Приготвят се аликвоти от по 100 µl в стерилни
по 1,5 ml микроепруветки и така се получават де-
вет точни копия на всяка контролна проба. Съхра-
няват се при —16 до —24 °С до използването им.
Наличието и количественото определяне на R.
solanacearum в контролните проби трябва да се
потвърдят най-напред с IF тест.
За PCR теста се прави екстракция на ДНК от
положителни и отрицателни контроли при всяка
серия от проби за тестване.
За IF и FISH тестовете се правят тествания върху
положителни и отрицателни контроли при всяка
серия проби за тестване.
За IF, FISH и PCR тествания трябва да се уста-
нови наличие на R. solanacearum в най-малко 106 и
104 клетки/ml на положителните контроли и нито
една клетка в отрицателните контроли.
_____________
Допълнение 4
Необходими буфери за тестовете
Обща разпоредба: Неотворените стерилизира-
ни буфери могат да се съхраняват до една година.
1. Буфери за екстракция
1.1. Буфер за екстракция—Extraction buffer
(50 mM фосфатен буфер, pH 7,0)
Този буфер се използва за екстракция на бакте-
рията от растителни тъкани чрез хомогенизиране
или разклащане.
Na2HPO4 (anhydrous)
4,26 g
KH2PO4
2,72 g
Дестилирана вода
1,00 L
Съставките се разтварят, проверява се pH и се
автоклавират при 121 °С за 15 минути.
Могат да бъдат полезни и следните допълни-
телни съставки:
Предназначение Количество
(на l)
Lubrol
Дефлокулант (*)
0,5 g
DC silicone antifoam Антипенител (*)
1,0 ml
Tetrasodium
Антиоксидант
1,0 g
pyrophosphate
Polyvinylpyrrolidone- Свързване на PCR
50 g
40000 (PVP-40)
инхибитори
__________________
(*) Използва се с метода за хомогенизирана екст-
ракция.
1.2. Буфер за разтваряне на утайката—Pellet
buffer (50 mM фосфатен буфер, pH 7,2)
Този буфер се използва за разреждане на екс-
тракти от конусчетата на картофени клубени след
концентрацията им в утайки чрез центрофугиране.
Na2HPO4. 12H2O
2,7 g
NaH2PO4. 2H2O
0,4 g
Дестилирана вода
1,0 L
Съставките се разтварят, проверява се pH и се
автоклавира при 121 °С за 15 минути.
2. Буфери за IF тест
2.1. IF-буфер (10 mM фосфатен буфер (PBS),
pH 7,2)
Този буфер се използва за разреждане на анти-
тела.
Na2HPO4. 12H2O
2,7 g
NaH2PO4. 2H2O
0,4 g
NaCl
8,0 g
Дестилирана вода
1,0 L
Съставките се разтварят, проверява се pH и се
автоклавира при 121 °С за 15 минути.
2.2. IF-буфер-Tween
Този буфер се използва за измиване на пред-
метните стъкла.
Прибавя се 0,1 % Tween 20 към IF буфера.
2.3. Фосфатен буферен глицерин, pH 7,6
Този буфер се използва за монтиране на покрив-
ните стъкла върху гнездата на предметните стъкла
за IF тест и за усилване на флуоресценцията.
Na2HPO4. 12H2O
3,2 g
NaH2PO4. 2H2O
0,15 g
Глицерин
50 ml
Дестилирана вода
100 ml
Предпазващи от обезцветяване разтвори могат
да се закупят например от Vectashield® (Vector
Laboratories) или Citifluor® (Leica).
3. Буфери за индиректна ЕLISA
3.1. Карбонатен буфер с двойна концентрация
(Coating buffer), pH 9,6
Na2СO3
6,36 g
NaHСO3
11,72 g
Дестилирана вода
1,0 L
Съставките се разтварят, проверява се pH и се
автоклавира при 121 °С за 15 минути.
Може да се добави натриев сулфит (0,2 %) като
антиоксидант, ако е необходимо да се предотврати
изграждането на окислени ароматни съединения.
3.2. 10X Фосфатен буфер—PBS, pH 7,4
NaCl
80,0 g
KH2PO4
2,0 g
Na2HPO4.12H2O
29,0 g
KCl
2,0 g
Дестилирана вода
1,0 L
3.3. Фосфатен буфер с Tween (PBS-Tween)
10Х PBS
100 ml
10 % Tween 20
5 ml
Дестилирана вода
895 ml
3.4. Блокиращ (антитяло) буфер (трябва да е
прясно изготвен)
10Х PBS
10,0 ml
Polyvinylpyrrolidone-44000
2,0 g
(PVP-44)
10 % Tween 20
0,5 ml
Мляко на прах
0,5 g
Дестилирана вода
Допълва се до 100 ml