Държавен вестник, бр. 27, 2007 г., стр. 26

С Т Р .  26
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
Б Р О Й  27
8.1.3. Инкубирайте петриевите блюда на тъмно
при 21 до 23 °C.
8.1.4. Първоначални прегледи на петриевите
блюда, включително и на референтните контролни
блюда, и преброяване на колониите, подобни на C.
m. subsp. sepedonicus, се правят след 3 дни с послед-
ващи преброявания след 5, 7 и накрая 10 дни.
8.2. Пречистване на предполагаеми колонии
Забележка.
Култивирането на субкултури, подобни на C. m.
subsp. sepedonicus, трябва да бъде извършвано върху
YGM среда; инокулацията на патладжан и/или пос-
ледваща идентификация трябва да бъде извършена,
преди колониите да се разраснат твърде много, т.е.
за предпочитане след три до пет дни.
8.2.1. Прави се натривка от колонии на C. m.
subsp. sepedonicus върху една от следните хранител-
ни среди (формулите са дадени в Допълнение 5):
Хранително-декстрозен агар (за употреба само
при субкултура),
дрожден —пептонено-глюкозен агар,
дрожден екстракт с минерални соли.
Инкубирайте при 21 до 24 °C до 10 дни.
C. m. subsp. sepedonicus расте бавно, обикновено
дава точковидни кремави куполообразни колонии
за 10 дни. За снимки на типични колонии на C. m.
subsp. sepedonicus (виж интернет страницата http://
forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).
8.2.2. Натрийте отново, за да установите чистота.
Темповете на растеж се подобряват в субкул-
турата. Типичните колонии са кремавобели или
с цвят на слонова кост; рядко жълти, заоблени,
гладки, издигнати, с изпъкнал купол, мукоидно-
течни, с ясни краища и диаметър обикновено от
1 до 3 mm.
Бърз тест за оцветяване по Грам (Допълнение
9) може да помогне да се подберат колонии за по-
нататъшно тестване.
8.2.3. Идентифицирайте предполагаемите кул-
тури (виж раздел 9) и направете тест за патоген-
ност (раздел 10).
9. Идентификация
Идентифицирайте чисти култури от предпола-
гаеми изолати на C. m. subsp. sepedonicus, като из-
ползвате поне два от следните тестове, базирани
на различни биологични принципи.
Включете познати референтни щамове, къде-
то е необходимо, за всеки потвърждаващ тест.
9.1. Хранителни и ензимни тестове за иденти-
фикация
Определете следните фенотипни характерис-
тики, които са универсално застъпени или отсъс-
тващи при C. m. subsp. sepedonicus, съгласно мето-
дите на Lelliott and Stead (1987), Klement et al. (1990),
Schaad (2001), (Anonymous) (1987).
Всички хранителни среди трябва да бъдат ин-
кубирани при 21 °C и прегледани след шест дни.
Ако не е настъпил растеж, инкубирайте 20 дни.
Всички тестове трябва да включват позната
контрола на C. m. subsp. sepedonicus. Хранителни-
те и физиологичните тестове трябва да се правят,
като се използва инокулат от субкултури, отгледа-
ни на хранителен агар. Морфологичните сравне-
ния трябва да се правят на култури, отгледани на
хранителен декстрозен агар.
Тестове
Очакван резултат
Окислително-
(O/F) инертна или
ферментационен тест
слабо оксидативна
Оксидазен тест
—
Растеж при 37 °C
—
Уреаза
—
Хидролиза на ескулина
+
Хидролиза на скорбялата
— или слаба
Толеранс на 7 % разтвор
на NaCl
—
Произвеждане на индол
—
Каталазна активност
+
Произвеждане на H2S
—
Използване на цитрат
—
Втечняване на желатин
—
Получаване на киселина
 от глицерин
—
Получаване на киселина
от лактоза
—  или слаба
Получаване на киселина
от рамноза
—
Получаване на киселина
от салицин
—
Грам оцветяване
(допълнение 9)
+
9.2. Имунофлуоресцентен тест
(a) Пригответе суспензия от приблизително 106
клетки на ml, разтворени в буфер за IF (Допъл-
нение 3).
(б) Пригответе серия от двукратни разрежда-
ния на подходящ антисерум.
(в) Приложете процедурата за имунофлуорес-
ценция (раздел 4).
(г) Положителен IF тест се постига, ако иму-
нофлуоресцентният титър на културата е еквива-
лентен на този от положителната контрола.
9.3. PCR
(a) Пригответе суспензия от приблизително 106
клетки на ml в ултрачиста вода.
(б) Загрейте 100 µl от клетъчната суспензия в
затворени епруветки в термостат или на водна баня
при 100 °C за 4 min. Ако е необходимо, добавете
прясно приготвена NaOH с крайната концентра-
ция от 0,05M, което ще спомогне за разкъсване на
клетъчните стени. След това пробите могат да
бъдат съхранявани при—16 до—24 °C , колкото е
необходимо.
(в) Приложете подходящи процедури, за да уве-
личите специфичните амплификати от C. m. subsp.
sepedonicus (e. g. Pastrik, 2000; вижте Допълнение
4; Li and de Boer, 1995; Mills et al., 1997; Pastrik and
Rainey, 1999; Schaad et al., 1999).
(г) Положителна идентификация на C. m. subsp.
sepedonicus се постига, ако PCR амплификатите са
същият размер и имат същата дължина на фраг-
мента като този на  положителната контрола.
9.4. Тест FISH
(a) Пригответе суспензия от приблизително 106
клетки на ml в ултрачиста вода.
(б) Приложете FISH процедурата (раздел 5).
(в) Положителен FISH тест се постига, ако се
получат едни и същи реакции от културата и от
положителната контрола.
9.5. Профилиране на мастните киселини (FAP)
(a) Отгледайте културата на Trypticase soy agar
(Oxoid) за 72 h при 21 °C (+/— 1°).
(б) Приложете подходяща FAP процедура (Janse,
1991; Stead, 1992).