Държавен вестник, бр. 68, 2014 г., стр. 90

СТР.  90	
Д Ъ Р Ж А В Е Н  В Е С Т Н И К 	
БРОЙ  68
2. Принцип
Пробата се екстрахира със смес вода/метанол 
при слабо нагряване до стопяване на всички 
липидни материали. Определянето на всички 
търсени вещества се извършва посредством течна 
хроматография с обърнати фази и УВ детектор.
3. Реактиви
3.1. Всички реактиви трябва да са с квали­
фикация „за ВЕТХ“, а водата – бидестилирана. 
3.2. Метанол.
3.3. Хидрохинон.
3.4. Хидрохинон монометилов етер.
3.5. Хидрохинон моноетилов етер.
3.6. Хидрохинон монобензилов етер (моно­
бензон).
3.7. Тетрахидрофуран, „ВЕТХ“ чистота.
3.8. Смес вода : метанол = 1:1 (V/V). Смесват 
се един обем вода с един обем метанол (3.2).
3.9. Подвижна фаза – смес: тетрахидрофуран 
: вода = 45:55 (V/V). Смесват се 45 обема тетра­
хидрофуран (3.7) и 55 обема вода.
3.10. Стандартен разтвор
В мерителна колба от 50 cm3 (ml) се претеглят 
с точност 0,001 g 0,06 g хидрохинон (т. 3.3), 0,08 g 
хидрохинон монометилов етер (т. 3.4), 0,10 g 
хидрохинон моноетилов етер (т. 3.5) и 0,12 g 
хидрохинон монобензилов етер (т. 3.6). Разтва­
рят се и се долива до марката с метанол (т. 3.2).
Стандартният разтвор се приготвя чрез раз­
реждане на 10,00 cm3 (ml) от този разтвор до 
50,00 cm3 (ml) със смес вода : метанол (т. 3.8). 
Тези разтвори се приготвят непосредствено 
преди употреба.
4. Апаратура
Стандартно лабораторно оборудване.
4.1. Водна баня, поддържаща температура 
60 °С.
4.2. Високоефективен течен хроматограф с УВ 
детектор с променяща се дължина на вълната и 
дозатор с 10 µl капиляра.
4.3. Аналитична колона
Хроматографска колона от неръждаема сто­
мана, дължина 250 mm, вътрешен диаметър 
4,6 mm, пълнеж Zorbax фенил (химически свързан 
фенетилсилан върху Zorbax SIL, допълнително 
дезактивиран (end-capped) с триметилхлорсилан), 
размер на частиците 6 µm или еквивалентна. 
Да не се използва предколона, различна от 
„phenyl guard“ или еквивалентна.
4.4. Филтърна хартия, диаметър 90 mm, 
Schleicher & Schull, бяла лента № 5892, или ек­
вивалентна.
5. Процедура
5.1. Приготвяне на пробата
В мерителна колба от 50 cm3 (ml) се претегля 
1 g от пробата (M) с точност 0,001 g. Пробата 
се диспергира в 25 cm3 (ml) смес вода/метанол 
(т. 3.8). Колбата се запушва и се разклаща енер­
гично до получаване на хомогенна суспензия. 
Разклаща се поне 1 min. Колбата се поставя 
във водна баня (т. 4.1) при 60 °С за улесня­
ване на екстракцията. Колбата се охлажда и 
се долива до марката със смес вода/метанол 
(т. 3.8). Екстрактът се филтрува с филтърна 
хартия (т. 4.4). ВЕТХ определянето трябва да 
се извърши в рамките на 24 h от приготвянето 
на екстракта.
5.2. Високоефективна течна хроматография
5.2.1. Скоростта на подвижната фаза (т. 3.9) 
се нагласява на 1,0 cm3 (ml)/min, а детекторът 
се настройва на 295 nm.
5.2.2. Дозират се 10 µl от разтвора на проба­
та, получен, както е описано в 5.1, и се записва 
хроматограмата. Измерва се площта на пиковете. 
Извършва се калибриране, както е описано в 
т. 5.2.3. Сравняват се хроматограмите, получени 
за пробата и за стандартния разтвор. Използват 
се площите на пиковете и коефициентите на 
детектора (RF), получени съгласно т. 5.2.3, за 
изчисляване на концентрациите на анализира­
ните вещества в разтвора на пробата.
5.2.3. Стандартна крива
Инжектират се 10 µl от стандартния разтвор 
(т. 3.10) и се записва хроматограмата. Инжектира 
се няколко пъти, докато се получи постоянна 
площ на пика.
Определя се коефициентът на детектора RFi:
 
,
където:
Pi e площта на пика на хидрохинона, хидрохи­
нон монометиловия етер, хидрохинон моноетило­
вия етер или хидрохинон монобензиловия етер;
Сi – концентрацията на стандартния разтвор 
(т. 3.10) на хидрохинона, хидрохинон моно­
метиловия етер, хидрохинон моноетиловия 
етер или хидрохинон монобензиловия етер 
в g/50 cm3 (ml).
Получените хроматограми на стандартния 
разтвор и на разтвора на пробата трябва да 
отговарят на следните изисквания:
а) Разделянето на пиковете в най-лошо раз­
делената двойка трябва да бъде не по-малко от 
0,90 (за дефиниция на коефициента на разделяне 
виж фиг. 1).
Ако не е постигнато необходимото разделяне, 
трябва да се използва по-ефективна колона или 
друга по състав подвижна фаза до получаване 
на добро разделяне.
б) Коефициентът на асиметрия (AS) на всички 
получени пикове трябва да бъде в интервала 
от 0,9 до 1,5. (За дефиниция на коефициента на 
асиметрия виж фиг. 2.) Препоръчва се хроматогра­
мата за определяне коефициента на асиметрия 
да се записва при скорост най-малко 2 cm/min.
в) Базовата линия трябва да е стабилна.
6. Изчисления
За изчисляване на концентрацията (концен­
трациите) на анализираното вещество (вещества) 
в пробата се използват площите на пиковете на 
анализираните вещества. Концентрацията на 
анализираното вещество в пробата се изчислява 
като % (M/M) (xi) по формулата:
 
,