Държавен вестник, бр. 28, 2007 г., стр. 48

С Т Р .  48
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
Б Р О Й  28
Поставят се по 190 µl екстракт от проба-
та в най-малко две от гнездата. Поста-
вят се положителни и отрицателни кон-
троли—всяка в по две гнезда за всяка
плака. Инкубира се за 16 часа при 4 °С.
3) Гнездата се измиват трикратно с PBS-
Tween (Допълнение 4).
4) Приготвя се подходящо разреждане на
специфични за R. solanacearum монокло-
нални антитела в PBS (Допълнение 4),
съдържащи 0,5 % bovine serum albumin
(BSA), и се поставят по 190 µl във всяко
гнездо. Инкубира се при 37 °С за два часа.
5) Гнездата се измиват трикратно с PBS-
Tween (Допълнение 4).
6) Приготвя се подходящо разреждане на
антимиши имуноглобулин конюгат с ал-
кална фосфатаза в PBS. Поставя се по
190 µl във всяко гнездо. Инкубира се при
37 °С за два часа.
7) Гнездата се измиват трикратно с PBS-
Tween (Допълнение 4).
8) Приготвя се разтвор на алкално фос-
фатазен субстрат, съдържащ 1 mg p-
nitrophenyl phosphat за ml субстратен бу-
фер (Допълнение 4). Поставят се по
200 µl за всяко гнездо. Инкубира се на
тъмно при стайна температура и се от-
чита абсорбция при 40 nm на равни ин-
тервали в рамките на 90 минути.
Интерпретиране на резултатите от ELISA тест:
ELISA тестът е отрицателен, ако средната оп-
тична плътност (OD) на пробата е по-ниска (< 2x
OD) от удвоената плътност на отрицателната кон-
тролна проба при условие, че всички оптични
плътности на положителните контроли са над 1,0
(след 90 минути инкубация със субстрата) и са по-
големи от два пъти OD, получена за екстрактите
на отрицателните проби.
ELISA тестът е положителен, ако оптическа-
та плътност (OD) на пробата е по-висока (> 2x
OD) от удвоената плътност на отрицателната кон-
тролна проба при условие, че средната оптична
плътност във всички отрицателни контролни
гнезда е < 2х от отчитанията в положителните
контролни гнезда.
Отрицателни отчитания от ELISA теста в гнез-
дата с положителната контролна означава, че тес-
тът не е проведен правилно или е бил инхибиран.
Положителни отчитания от ELISA теста в гнезда-
та с отрицателната контрола означава, че е настъ-
пило кръстосано заразяване или неспецифично
свързване на антитела.
9. Провеждане на биологичен тест
Забележка. Предварителното тестване с този
метод трябва да дава възможност за установяване
на 103 до 104 клетки на R. solanacearum на ml, при-
бавени към екстракти от проби, които са дали
отрицателен резултат при предишно тестване (за
подготовка виж Допълнение 3).
Най-висока чувствителност на откриване чрез
този метод може да се очаква, когато се използват
прясно приготвени екстракти от проби и оптимал-
ни условия за растеж. Методът може да се прилага
успешно и за екстракти, които са били съхранява-
ни в глицерин при температура от -68 до -86 °С.
Протоколът по-долу е на базата на Janse (1988):
9.1. Използват се 10 тестрастения за всяка
проба от чувствителни сортове домати (напри-
мер “Moneymaker” или сорт със сходна чувстви-
телност, определена от изпитващата лаборато-
рия) във фаза на развитие трети същински лист.
За подробна информация по отношение на кул-
турите виж Допълнение 8. Могат да се използ-
ват и патладжани (например сорт “Black Beauty”
или сортове със сходна чувствителност), като се
използват растения във фаза втори или трети съ-
щински лист. Симптомите се проявяват по-сла-
бо и се развиват по-бавно при патладжана. Зато-
ва се препоръчва при възможност да се използва
доматен разсад.
9.2. Разпределят се по 100 µl концентриран екс-
тракт от проби между отделните тестрастения.
9.2.1. Инокулация със спринцовка:
Инокулират се стъблата на растенията в учас-
тъка над котиледоните и под първи същински лист,
като се използва спринцовка за инсулин с хиподер-
мична игла (най-малко 23G). Екстрактът от про-
бата се разпределя между тестрастенията.
9.2.2. Инокулация чрез разрез:
Растението се задържа с два пръста, с пипета се
отмерва капка (приблизително 5—10 µl) от разре-
дената утайка и се капва върху стъблото между
котиледоните и първи същински лист.
С помощта на стерилен скалпел се прави диа-
гонален разрез с дължина около 1,0 cm, на дълбо-
чина приблизително 2/3 от дебелината на стъбло-
то, като се започва от капката.
Разрезът се запечатва със стерилен вазелин с
помощта на спринцовка.
9.3. С помощта на същата техника се инокули-
рат пет растения с водна суспензия, съдържаща
105 до 106 клетки на ml, биовар 2 щам на R.
solanacearum, приготвена от 48-часова чиста кул-
тура, като положителна контрола и с буфер за раз-
тваряне на утайката (Допълнение 4), като отрица-
телна контрола. Положителните и отрицателните
контролни растения се отделят от другите расте-
ния, за да се избегне кръстосано заразяване.
9.4. Тестрастенията се отглеждат при каран-
тинни условия за период до четири седмици при
температура от 25 до 30 °С и висока относителна
влажност с подходящо напояване, за да се избег-
не прекомерното поливане или увяхване поради
недостиг на вода. За да се избегне заразяването
на тестрастенията, инкубирането на растенията
за положителна и отрицателна контрола става
на отделни стендове в оранжерия или камера за
нарастване или ако пространството е ограниче-
но, се осигурява стриктно разделяне при отглеж-
дане. Ако растения, предназначени за различни
проби, трябва да се инкубират близо едни до
други, те се отделят с подходящи екрани. При
торене, напояване, инспектиране и други мани-
пулации се полагат специални грижи, за да не се
допусне кръстосано заразяване. От съществено
значение е в оранжериите и камерите за нараст-
ване да не се допуснат никакви вредни насеко-
ми, тъй като те могат да пренесат бактерията от
една проба на друга.
Растенията се наблюдават за симптоми на увях-
ване, епинастия, хлороза и/или закърняване.