Държавен вестник, бр. 28, 2007 г., стр. 43

Б Р О Й  28
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
С Т Р .  43
Внимателно се отстранява излишната влага.
5.3.7. С пипета върху всяко кладенче се накап-
ват по 5—10 µl от 0,1М фосфатен буфер с глицерин
(Допълнение 4) или предпазващо от обезцветява-
не вещество, продавано в търговската мрежа, и се
покриват с покривно стъкло.
5.4. Отчитане на IF тест:
5.4.1. Предметните стъкла се разглеждат под
микроскоп, снабден с епифлуоресцентна светлина
и с подходящи филтри за работа с FITC, под имер-
сионно масло при увеличение от 500х до 1000х.
Кладенчетата се наблюдават по дължината на два
перпендикулярни диаметъра и по периметъра. За
пробите, които не показват никакви клетки или
малък брой клетки, се наблюдават поне 40 мик-
роскопски полета.
Най-напред се проверява предметното стъкло
с положителната контрола. Клетките трябва да се
светли, флуоресцентни и напълно оцветени при
определения титър за антитяло или работно раз-
реждане. Ако оцветяването не е добро, IF тестът
(раздел VI.А.5) трябва да се повтори.
5.4.2. Кладенчетата на IF стъклата се наблюда-
ват за светли флуоресциращи клетки с характер-
ната морфология на R. solanacearum (виж интер-
нет страница http://forum.europa.eu.int/Public/irc/
sanco/Home/main). Интензитетът на флуоресцен-
цията трябва да е равен на оцветяването на поло-
жителната контрола при същото разреждане на
антитялото. Клетките с непълно оцветяване или
със слаба флуоресценция не се зачитат.
При съмнение за зараза тестът трябва да се
повтори. Това става, когато всички предметни
стъкла в партидата показват положителни клетки
поради заразяване на буфера или ако се открият
положителни клетки (извън прозорците на пред-
метните стъкла) върху покритието на предметни-
те стъкла.
5.4.3. Няколко проблема са присъщи за спе-
цификата на имунофлуоресцентния тест. В утай-
ките от картофените “очи” и сегменти от стъб-
лото могат да се появят популации от флуорес-
циращи клетки с атипична морфология и клетки
на сапрофитни бактерии с кръстосано действие,
чиито размер и морфология са сходни до тези на
R. solanacearum.
5.4.4. Разглеждат се само флуоресциращите
клетки с типичен размер и морфология при титъ-
ра или работното разреждане на антителата в 5.3.
5.4.5. Интерпретиране на IF теста:
а) При откриване на светли флуоресциращи
клетки с характерна морфология се определя сред-
ният брой на типични клетки за микроскопско поле
и се изчислява броят на типичните клетки за ml
разтворена утайка (Допълнение 5).
Отчетените резултати от IF тест са положи-
телни за пробите с поне 5 Ч 103 типични клетки
за ml разтворена утайка. Пробата се определя
като потенциално заразена и бъдещите тестове
продължават.
б) IF тест е отрицателен за всяка проба с по-
малко от 5 Ч 103 типични клетки за ml разтворена
утайка и пробата се счита за отрицателна. Не се
налага допълнително тестване.
Фиг. 1. Приготвяне на предметните стъкла за
теста в съответствие с 5.1а) и 5.3а)
Разреждане на разтворената утайка
1/100
1/1
1/1
1/1
1/1
Разреждане
на разтво-
рената
утайка
(T = титър) T/2
T/4
T/2
T
2T
Двойни раз-
реждания
на антисе-
рума/анти-
тяло
Проба 1
•1 •2 •3 •4 •5
Повтаряне
на проба 1
•6 •7 •8 •9 •10
или
проба 2
Фиг. 2. Подготовка на предметното стъкло с
пробите в съответствие с 5.1б) и 5.3б)
Работно разреждане на антисерум/антитяло
1/1 1/10
1/100 празно празно
Десетично
разреждане
на утайката
Проба 1 •1 •2 •3
•4
•5
Повта-
ряне на
проба 1 •6 •7 •8
•9
•10
или
проба 2
5.3.1. Предметните стъкла се подреждат върху
влажна хартия. Всяко кладенче се накапва с разре-
деното антитяло. Във всяко кладенче количество-
то на антитялото трябва да е най-малко равно на
количеството на екстракта.
Когато не са дадени конкретни указания от
доставчиците на антителата, се извършва следна-
та процедура:
5.3.2. Предметните стъкла се инкубират на
влажна камера в продължение на 30 минути при
стайна температура (18 до 25 °С).
5.3.3. От всяко предметно стъкло се изтръск-
ват капчиците и внимателно се промива с IF бу-
фер. Измива се чрез потапяне за 5 минути в IF
буфер-Tween (Допълнение 4), а след това в IF бу-
фер. Трябва да се внимава да не се образуват аеро-
золи или да се разпръснат капчици, което би дове-
ло до кръстосано заразяване. Излишната влага се
отстранява чрез внимателно попиване.
5.3.4. Предметните стъкла се подреждат върху
влажна хартия. Кладенчетата се накапват с разре-
дения FITC конюгат, използвано за определяне на
титъра. Във всяко кладенче количеството на ко-
нюгата трябва да е най-малко равно на количест-
вото на антитялото.
5.3.5. Предметните стъкла се инкубират във
влажна камера в продължение на 30 минути при
стайна температура (18 до 25 °С).
5.3.6. От всяко предметно стъкло се изтръск-
ват капчиците. Изплаква се и се измива, както е
описано по-горе (5.3.3).