Държавен вестник, бр. 27, 2007 г., стр. 27

Б Р О Й  27
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
С Т Р .  27
(в) Положителен FAP тест се получава, когато
профилът на предполагаемата контрола е иденти-
чен с този на положителната контрола. Наличието
на характерните мастни киселини 15:1 Anteiso A,
15:0 Iso, 15:0 Anteiso, 16:0 Iso, 16:0 and 17:0 Anteiso е
много показателно за C. m. sepedonicus. Други родо-
ве като Curtobacterium, Arthrobacter и Micrococcus
също имат такива киселини, но 15:1 Anteiso A е рядка
киселина в тези бактерии и се среща във всички
видове Clavibacter spp. между 1 и 5 %.
При C. m. sepedonicus стойността обикновено е
около 5 %.
9.6. BOX-PCR
(a) Пригответе суспензия от приблизително 106
клетки на ml в ултрачиста вода.
(б) Приложете теста съгласно процедурата
(Smith et al., 2001).
10. Тест за потвърждаване
Тестът за патогенност трябва да се извърши
като крайно потвърждаване на диагностиката на
C. m. subsp. sepedonicus и за оценка на вирулент-
ността на културите, идентифицирани като C. m.
subsp. sepedonicus:
10.1. Пригответе инокулум от приблизително
106 клетки на ml от изолати на 3 дневни култури,
които да бъдат тествани и подходящи щамове от
положителни контроли на C. m. subsp. sepedonicus.
10.2. Инокулирайте 5 до 10 млади растения от
патладжан в стадий 3 лист (раздел 7.3 или 7.4).
10.3. Инкубирайте при 18 до 24 °C с достатъчно
светлина и висока относителна влажност, за да
избегнете напукване или стрес от засушаване (раз-
дел 7.7). С чисти култури типичното увяхване ще
се получи за две седмици, но растенията, които не
показват симптоми (вижте раздел 7.8) след този
период, трябва да бъдат инкубирани до три седми-
ци при температури, които водят до растеж на
патладжанените растения, но не надхвърлящи 25 °C
(Допълнение 8). Ако няма симптоми, след 3 сед-
мици културата не може да бъде потвърдена като
патогенна форма на C. m. subsp. sepedonicus.
10.4. Изолирайте от растение със симптоми
участък от стъблото—2 cm над точката на ино-
кулация. Стрийте и суспендирайте в малък обем
стерилна дестилирана вода или 50 mM фосфатен
буфер (Допълнение 3). Направете изолация от
суспензията след разреждане на разтвора и по-
сявка върху MTNA и YPGA (Допълнение 5), ин-
кубирайте три до пет дни при 21 до 23 °C и наб-
людавайте за образуването на типични за C. m.
subsp.sepedonicus колонии.
Допълнение 1
Лаборатории, включени в оптимизирането и
валидиране на протоколи
Лаборатория (1)
Място
Държава
1
2
3
Agentur fьr Gesundheit und
Виена и
Австрия
Ernдhrungssicherheit
Линц
Departement
Gewasbescherming
Мерелбек
Белгия
Plantedirektoratet
Лингби
Дания
1
2
3
Central Science Laboratory
Йорк
Англия
Scottish Agricultural
Единбург
Шотландия
Science Agency
Laboratoire National de la
Анжер
Франция
Protection des Vйgйtaux,
Unitй de Bactйriologie
Laboratoire National de la
Le Rheu
Франция
Protection des Vйgйtaux,
Station de Quarantaine
de la Pomme de Terre
Biologische Bundesanstalt
Kleinmachnow Германия
Pflanzenschutzamt Hannover Хановер
Германия
State Laboratory
Дъблин
Ирландия
Plantenziektenkundige Dienst Вагенинген
Холандия
Norwegian Crop Research
Аас
Норвегия
Institute, Plant Protection
Centre
Direcзгo-Geral de Protecзгo
Лисабон
Португалия
das Culturas
Nacionalni institut za
Любляна
Словения
biologijo
Centro de Diagnostico
Саламанка
Испания
de Aldearrubia
(1) Учени за контакт: вижте интернет страницата http:
//forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main
Допълнение 2
Изготвяне на положителни и отрицателни кон-
троли за скринингови тестове PCR/IF и FISH на
растителна тъкан от клубени
Изгответе 72-часова култура от вирулентен щам
на C. m. subsp. sepedonicus (NCPPB 4053 или PD
406) върху MTNA среда и суспендирайте в 10 mM
фосфатен буфер, за да получите клетъчна плът-
ност от приблизително 1 до 2 Ч 108 cfu на ml. Това
обикновено се постига чрез получаване на слабо
мътна суспензия, еквивалентна на оптична плът-
ност от 0,20 при 600 nm.
Отстранете конусчетата от 200 клубена, взети
от сорт с бяла кора, за които се знае, че са свободни
от C. m. subsp. sepedonicus.
Обработете конусчетата както обикновено и
ресуспендирайте утайката в 10 ml.
Пригответе 10 стерилни 1,5 ml микроепрувет-
ки с 900 µl от ресуспендирана утайка.
Прехвърлете 100 ml от суспензията от C. m.
subsp. sepedonicus в първата микроепруветка. Раз-
бъркайте.
Установете десетични нива на заразяване чрез
по-нататъшно разреждане в следващите 5 микро-
епруветки.
Шестте заразени микроепруветки ще бъдат
използвани като положителни контроли. Четири-
те незаразени микроепруветки ще бъдат изпол-
звани като отрицателни контроли. Надпишете
микроепруветките.